增强前体药物活化的制作方法

专利名称：增强前体药物活化的制作方法
技术领域：
本发明涉及在靶细胞中活化前体药物的活化剂。本发明还涉及用所述新活化剂活化前体药物的方法。
酶性前体药物疗法(EPT)涉及在治疗中用酶活化前体药物。前体药物通常为可以在体内转化为具有治疗作用的活性型的药学惰性或相对惰性化合物(Connors综述于1995 Gene Therapy 2，702；Springer和Niculescu-Duvaz 1996 Adv Drug Deliv Res 22，351)。EPT特别用于肿瘤治疗中。
最初研制的前体药物利用体内固有的酶实现活化，例如利用P450酶系活化环磷酰胺(CP)及其异构体异环磷酰胺产生损伤DNA的氮芥；主要由NADPH细胞色素C(P450)还原酶活化丝裂霉素C(MMC)产生有效的烷化剂(例如Bligh等1990，Cancer Research 50，7789)。这些重要的前体药物的治疗指数并不取决于对靶细胞的选择性传递，而是取决于靶细胞对DNA损伤的不同敏感性。当细胞分裂时所述损伤才有效，因此将损伤分裂活跃或将发展为细胞分裂的肿瘤细胞，而正常器官和组织的分化成熟细胞不发生分裂，因此不会受到损伤。仍然没有证实肿瘤具有特别高水平的可以激活该类前体药物的酶(Forrester等1990 Carcinogenesis 11，2163)。人们认为主要在肝脏中激活前药物如CP、IF和MMC成为治疗性代谢物，然后通过循环将所述治疗代谢物分布到肿瘤部位。人们认为即使当肿瘤具有一定的代谢前体药物的能力时，所述酶活性的向下调节也会引起药物抗性(例如Bligh等1990同上)。
发现肿瘤细胞不是很有效地代谢前体药物，使得产生了将正常人类的酶直接传递到肿瘤以达到局部的高浓度活化化合物的理论(例如Chen等1996 Cancer Research 56，1331)。最近例如在实验体系中证明，用病毒载体将编码P450的基因直接转移到肿瘤细胞中可以增强CP的效力，使得所述肿瘤生长明显减慢甚至消退(Chen等1996同上)。通过数种方法中的一种可以选择性地将有关的酶活性靶向肿瘤细胞。一种方法是通过合成完成后或生产重组蛋白使肿瘤选择性单克隆抗体或片段如单链抗体(scFv)与酶缀合。所述蛋白给予患者后借助于所述抗体特异性识别肿瘤表面而局限在肿瘤部位。所给予的无毒前体药物只在肿瘤部位被所结合的缀合物活化(Bagshawe综述于1987 Br J Cancer 56，531)。该方法称为ADEPT(抗体依赖性前体药物活化)。另一种方法是用以DNA为基础的传递系统如质粒(基因依赖性酶前体药物疗法GDEPT)(例如Vile等1993 Cancer Res 53，3860)或病毒载体(病毒依赖性酶前体药物疗法VDEPT)(例如Huber等1991PNAS 88，8039)将编码所述酶的DNA传递至靶细胞。在这些方法中，将靶向配体掺入传递载体或用肿瘤特异性启动子获得肿瘤特异性(例如Harris等1994 Gene Therapy 1，170和其中的参考文献)。最近的进展描述了ADWPT和GDEPT方法的联合法，藉此构建了基因融合物，使得编码所述抗体靶向部分的基因与编码前体药物活化酶的基因融合。以DNA或基因传递载体如病毒载体将基因融合物传递至靶组织中(WO 98/55607)。
另一类前体药物因为在为肿瘤独特生理特征的严重低氧的环境中发生还原性活化而对肿瘤具有选择性毒性。低氧为异常低水平氧的情况，见于大多数直径大于约1mm的实体瘤(Coleman 1988 J NatCanc Inst 80，310；Vaupel等Cancer Res 49，6449)。低氧环境传导可以产生各种化学组族的还原衍生物的还原反应(Workman和Stratford1993 Cancer and Metastasis Reviews，12，73-82)。典型生物还原药物有抗生素、丝裂霉素C(MCC)和甲基丝裂霉素(POR)，但是评价了许多其它化合物包括N-氧化物如Tirapazamine(TRZ)(Zeeman等1986 Inst JRadiot Oncol Biol Phys 12，1239)和醌类如吲哚并醌E09(Bailey等1992Int J Radiot Oncol Biol Phys 22，649)、cyclopropamitosenes(EP-A-0868137)和被细胞色素P450 3A4活化的米托蒽(AQ4N)的叔胺-N氧化物类似物(Patterson 1993 Cancer Metast Rev 12，119；Patterson 1994Biochem Pharm Oncol Res 6，533)。迄今为止，这些化合物中最有开发价值的是Tirapazamime(TRZ；3-氨基-1，2，4-苯并三嗪-1，4-二氧化物)。它被代谢为一氮氧化物(SR4317)以及在较低的程度上代谢为游离碱SR4330。二电子或四电子还原产物均没有基因毒性，所以认为涉及Tirapazamine的单电子自由基而不是稳定的代谢物(A.Cahill和I.N.H.White 1990，Carcinogenisis，11，1407)。据认为产生的硝基氧阴离子自由基直接作用于DNA诱发DNA链断裂(J.M.Brown综述于1993 Br J Cancer 67，1163)。Tirapazamine在低氧条件下的细胞杀伤活性增强，但是在中度氧张力时表现出一定程度的毒性。这是很重要的，因为低氧程度在整个肿瘤中是变化的，而且不可能在一定时间内维持绝对低水平的氧使Tirapazamime杀伤肿瘤细胞的效力较例如只在非常低的氧张力时活化的丝裂霉素C更强(J.M.Brown综述于以上引用的文献中)。Tirapazamime在高剂量时因作用于骨髓引起骨髓抑制确实具有毒性。所以目前的临床应用受到剂量限制性毒性的影响，实际上达到明显治疗作用所需要的剂量接近最大耐受量(Adam等1992 Int J Radiat Omc Biol Phys 22，717)。初期的研究工作表明细胞色素P450在Tirapazamime的代谢中具有明显的作用，但是其在活化和细胞毒性中的作用仍不明确(Walton等Biochem Pharmacol 44，251)。然而，越来越多的证据表明，P450还原酶起着更为重要的作用。Patterson等在1995 Br J Cancer 72，1144中已经表明P450还原酶在一组乳腺癌细胞系中具有一定范围的活性，而且Tirapazamime的低氧毒性直接与内源性P450还原酶水平有关。在2个膀胱癌细胞系中获得相似的相关性(Xu等1994 Br J Cancer 242)。最近因为证实将人P450还原酶的全长cDNA转移到肿瘤细胞和在肿瘤细胞中过量表达P450还原酶基因显著提高对Tirapazamime的敏感性，所以获得了P450还原酶在Tirapazamime(TRZ)代谢中的重要性的有效证据(Patterson等1997 Br J Cancer 76(10)，1338-1347)。这些资料首次表明P450可以用于基因治疗用途。
这些通过将正常人类酶如P450和P450还原酶转移到细胞增强前体药物活化的研究表明，在各种可利用的策略中可以应用正常哺乳动物酶。这些策略包括上述的GDEPT、VDEPT和ADEPT方法。另一方面可以应用体外工程改造含有所述基因的造血细胞传递所述酶WO 98/55607。直接将前体药物活化酶如P450和P450还原酶传递到肿瘤可以减少系统给予患者的前体药物的剂量，因此减少全身性毒性。所有酶性前体药物治疗法取决于与正常组织相比，前体药物在疾病组织中的差别活化(Chen等1996；T.Connors同上；Patterson等1997)。
尽管将天然酶用于EPT策略因为例如可以避免不需要的免疫反应而引人注目，但是其缺点是某些药物如P450仍然会在肝脏发生药物转化，因此可能产生一定的全身性毒性。所以研究了各种不同人类以外的酶性前体药物的组合。因为明确它们不存在于任何人类细胞中，所以如果传递是肿瘤特异性的，则不会有前体药物在正常组织如肝脏中活化引起的毒性副作用。例如单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSVTk)可以使前体药物丙氧鸟苷(GCV)磷酸化产生核苷类似物，核苷类似物随后进一步被细胞激酶磷酸化产生阻断DNA合成的核苷酸(丙氧鸟苷三磷酸盐)(F.L.Moolten 1986 Cancer Res 46，5276)。HSVTk法是S期特异性的，从而只杀伤增殖活跃的肿瘤细胞，所以它并不是在所有情况下都是合适的。另一个实例是使用可以还原与GB1954相关的化合物产生损伤DNA的代谢物的大肠杆菌硝基还原酶(Anlezark等1992 Biochem Pharmacol 44，2289)。设计了许多其它不同的酶前体药物的组合，例如羧肽酶G2、青霉素酰胺酶、碱性磷酸酶、β-内酰胺酶和胞嘧啶脱氨酶可以水解活化前体药物(Knox等综述于1995 Biochem Pharmacol 49，1641中的前言中以及书中引用的T.Connors的文献；书中引用的文献Spring和Niculescu-Duvaz 1996)。
无数的因素使至此描述的所有各种酶前体药物治疗策略复杂化。不同药物/酶组合和不同传递方式存在不同的具体问题。在ADEPT中，例如所述酶传递到细胞外部，然而在大多数情况下所述活性药物必须跨过细胞膜，这对化学设计产生各种限制。所述活性药物也必须弥散到整个肿瘤体发挥作用。使用高亲和力抗体在一个部位产生高水平的活化可能耗竭大部分肿瘤的前体药物，完全使所述活性化合物流入液循环，由此降低效力而增加全身性毒性。此外需要重复给予前体药物。所以，一般因为ADEPT策略有将活性化合物传递入循环的潜在可能性而具有缺陷。另外，如果所述酶活性需要细胞内辅因子如NADPH，则可能必须将替代的辅因子共同给予到细胞外环境，这限制了例如在ADEPT策略中使用细菌硝基还原酶(Knox等1995 Biochem Pharmacol 49，1641)。如果存在细胞内辅因子，则VDEPT/GDEPT策略具有优势，因为所述酶将只在细胞内活化所述药物，所以任何意外释放酶入循环将不会引起全身性活化和毒性。但是，GDEPT和VDEPT策略不能将相关基因传递至所有肿瘤细胞中，这意味着肿瘤中的许多细胞不被杀伤，使所述酶的细胞内限制成为一个明显的缺点。所以在VDEPT和GDEPT策略中最好是具有某一将细胞杀伤延伸到原工程细胞以外的方法。这称为“旁观者效应”(Freeman等1993 Cancer Res 53，5274)。例如用HSV Tk观察到了这种效应，其中除了含Tk基因的细胞外，还杀伤了许多细胞。然而，所述机制略微有点可疑，因为不借助于通过间隙连接的代谢协助，高负荷的三磷酸盐活性代谢物不可能通过细胞膜(综述于本文引用的T.Connors文献中以及Hamel等1996 Cancer Res 56，2697)。Tk“旁观者效应”可能实际上是意外、所以是不可预期的免疫应答引起的，而不是真正的代谢作用。环磷酰胺在肿瘤中被P450活化中观察到旁观者效应。在这种情况下提出，高毒性acreolin代谢物介导所述作用，但是不会引起全身性毒性，因为它相对短效(Chen和Waxman 1995Cancer Res 55，581)。另一方面，邻近细胞可以摄取中间代谢物如4-羟基环磷酰胺。用可以被DT二磷酸酶还原的氮丙啶(aziridin)GB 1954也观察到观者效应，但是氮丙啶被细菌硝基还原酶还原产生有效的烷化剂而具有更强的作用(Knox 1988 Biochem Pharmacol 37，4661；Bridgewater 1997 Hum Gene Therapy 8，709)，尽管并不是总能观察到该情况(Clark等1997 Gene Therapy 4，101-110；Patterson和Stratford，未公开观测结果)。任何旁观者效应将与产生的活性代谢物浓度成比例增加。所以最好是增强前体药物活化酶的活性以提高活性代谢物的浓度。
所以尽管酶性前体药物疗法引人注目，但是至今使用的每一种方法均存在许缺点。为了使酶性前体药物疗法作用最大化，重要的是选用传递系统和具有有效靶细胞特异性的细胞杀伤的酶/药物组合。此外，最好是通过产生全身性毒性最小的高旁观者效应而提高所破坏的靶细胞数量。本发明的目的在于满足这些需要。
本发明的一个方面是提供前体药物活化剂，它包含a)定位结构域；和b)在靶细胞中活化前体药物的前体药物活化结构域；并且其中所述定位结构域不是肿瘤选择性抗体。
所述定位结构域和前体药物活化结构域优选包括氨基酸序列或为编码所述结构域的核酸序列形式。
在本发明优选实施方案中，所述前体药物活化剂为融合蛋白形式。蛋白包括肽和多肽。
另一方面，所述结构域可以随同给予。随同给予不一定是指同时给予。可能是给予一种结构域之前或之后给予另一种结构域。
“靶细胞”就是指无论是天然或靶向或传递系统组成部分的所述药物能够转染或转导的细胞。
另一方面，本发明提供包括至少一种编码细胞色素P450的可表达核酸序列的前体药物活化剂，其中所述或每个核酸序列操作性连接到一个或多个组成型控制调节元件或一个或多个诱导型表达控制调节元件。
在另一实施方案中，所述活化剂是修饰造血干细胞(MHSC)的形式，其中所述造血干细胞包含所述前体药物活化剂或所述前体药物活化结构域或经工程化表达它。
因此，本发明的又一方面提供包括修饰造血干细胞(MHSC)的前体药物活化剂，所述修饰造血干细胞含至少编码一种前体药物活化结构域的可表达核苷酸序列，其中所述或每一个核苷酸序列操作性连接至一个或多个组成型表达控制调节元件或一个或多个诱导型表达控制调节元件。
本发明还提供包含按照本发明的核酸序列的核酸载体。
本发明也提供包含本发明核酸序列病毒载体。
本发明还提供用于医药的本发明的前体药物活化剂、核酸载体、病毒载体或转导细胞。
本发明还提供用于医药的包含本发明的前体药物活化剂、核酸载体、病毒载体或转导细胞的药用组合物。
本发明进一步提供治疗患有以下病症的人类或动物患者的方法，所述病症例如癌症(尤其是实体瘤)、脑型疟疾、缺血性心脏病、类风湿性关节炎或特征为缺血、低氧或低糖的病症。
进一方面，本发明提供生产病毒株的方法，包括将本发明的核苷酸序列引入病毒基因组。该方法最好包括所述基因组与本发明载体之间的同源重组将所述核苷酸序列引入所述病毒基因组。
在甚至更进一步的方面，本发明提供产生MHSC的方法，包括将本发明的载体引入造血细胞株(HSC)。
现在参照附图通过非限制性实例描述本发明各种优选的特征和实施方案，其中

图1A所示为P450还原酶序列；图1B所示为P450还原酶的功能结构域；图2所示为P450还原酶衍生物；图3所示为跨细胞靶向序列；图4所示为人细胞色素P450 2B6；图5所示为IRES；图6所示为反转录病毒载体；图7所示为基因融合构建物；图8所示为赋予多重药物敏感性反转录病毒载体；和图9所示为巨噬细胞传递P450的结果；图10所示为P450 PCR片段；图11所示为pegHRELacZ；图12所示为pBHRELacZ；图13所示为pBHREp450del；图14所示为pBHREP450；图15所示为pegHREP450；图16所示为pONY4；图17所示为pONY4.1；图18所示为pONY4HREP450；图19所示为pONY4.1HRE450；图20所示为pEGASUS-4；图21所示为pEGASUS4P450；图22所示为pONY4.0P450；图23所示为pONY4.1P450。
附图详述图1A所示为P450还原酶序列。SEQ ID NO1为mRNA序列(部分，GenBank登记号S90469)；SEQ ID NO2所示为其氨基酸序列。
图1B所示为P450还原酶的功能结构域。
图2A所示为非锚定P450R。SEQ ID NO3所示为DNA编码序列。SEQ ID NO4所示为其氨基酸序列。
图2B显示FAD和NADPH结合(FN)片段，其中SEQ ID NO5为DNA编码序列，SEQ ID NO6为其氨基酸序列。
图3A所示为SV40大T抗原NLS片段。SEQ ID NO10为DNA编码序列(互补序列4442-4422)，SEQ ID No11为其氨基酸序列。
图3B所示为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。SEQ ID No19为18kD同种型的DNA编码序列，SEQ ID No20为其氨基酸序列。
图3C所示为触角足同源框肽(pAntp)。SEQ ID No53为同源域的编码序列，SEQ ID No54为其氨基酸序列。
图3D所示为1型单纯疱疹病毒(HSV-1)间层蛋白VP22。SEQ IDNO55为DNA编码序列(GenBank序列X14112的互补序列106391…105486)，SEQ ID NO56为其氨基酸序列。
图3E所示为铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)。SEQ ID NO33为域II的DNA编码序列，SEQ ID NO34为其氨基酸序列。
图3F所示为具有翻译启始信号和分泌信号肽的ST4单链Fv片段(ScFv)。SEQ ID NO25为ST4-ScFv的翻译启始信号和信号肽DNA序列(WO98/55607)，SEQ ID NO27为其氨基酸序列。
图4所示为人细胞色素P450 2B6。SEQ ID NO45为mRNA序列，SEQ ID NO46为其氨基酸序列。
图5所示为IRES(内部核糖体进入序列)。SEQ ID NO52为FMDV(R100)+SacI(开始)和XhoI(末端)接头的IRES序列。
图6A所示为PKAHRE一种基于MLV的单一转录单位载体。低氧效应启动子控制治疗基因的表达(3×PGK)。编码所述前体药物活化酶的基因被取代为所示的nlsLAcZ基因。
图6B所示为COI一种用CMV增强子替代MLV增强子(阴影框)的基于MLV的载体。编码所述前体药物活化酶的基因插入Bam/Sal/Hpa多位点接头或Stu/Xho多位点接头。另一方面可以将不同的基因插入每一个多接头。
图8所示为赋予多重药物敏感性的反转录病毒载体。VP22-FN增强对Tirapazamine的敏感性。P450-FN增强对环磷酰胺的敏感性。P450-FN加VP22-FN增强对丝裂霉素C、Tirapazamine以及环磷酰胺的敏感性。前体药物活化结构域所述前体药物活化酶通常为前体药物活化酶或前体药物活化酶的活性片段；尽管它可以是任何活化前体药物的结构域。本领域已知愈来愈多数量的前体药物活化酶，可以应用其中任何一种。合适的前体药物活化酶可以是天然或工程化酶，包括细胞色素P450、细胞色素P450还原酶、胸苷激酶、硝基还原酶、胞嘧啶脱氨酶、DT-二磷酸酶、NADPH细胞色素cP450还原酶和羧肽酶G2。
可以将前体药物活化酶传递至肿瘤部位以治疗癌症。在每种情况下，合适的前体药物与合适的前体药物活化酶联合用于治疗所述患者。将合适的前体药物结合载体给予。前体药物的实例包括磷酸鬼臼亚乙苷(与碱性磷酸酶一起使用，Senter等1988 Proc Natl AcadSci 854842-4846)；5-氟胞嘧啶(与胞嘧啶脱氨酶一起使用，Mullen等1994 Cancer Res.541503-1506)；阿霉素-N-对羟基苯氧基乙酰胺(与青霉素-V酰胺酶一起使用，Kerr等1990 Cancer Immonol Immunother31202-206)；对-N-双(2-氯乙基)氨基苯甲酰谷氨酸(与羧肽酶G2一起使用)；氨基甲酸头孢菌素氮芥(与β-内酰胺酶一起使用)；SR4233(与P450还原酶一起使用)；丙氧鸟苷(与HSV胸苷激酶一起使用，Borrelli等1988 Proc Natl Acad Sci 857572-7576)；与硝基还原酶一起使用的芥子前体药物(Friedlos等1997 J Med Chem 401270-1275)和环磷酰胺(与P450一起使用，Chen等1996 Cancer Res 561331-1340)。
用于本发明的合适前体药物活化酶的实例包括胸苷磷酸化酶，它活化5-氟-尿嘧啶前体药物capcetabine和去氧氟尿苷；单纯疱疹病毒的胸苷激酶，它活化丙氧鸟苷；细胞色素P450，它将诸如环磷酰胺的前体药物活化为DNA损害剂；和胞嘧啶脱氨酶，它活化5-氟胞嘧啶。最好使用人来源的酶。
如上所述，最好为前体药物活化酶形式。用于治疗患者的前体药物活化酶将结合合适的前体药物给予。
所述酶最好为细胞色素P450或细胞色素P450还原酶。
细胞色素P450是一个结合于膜的血红素-硫醇盐蛋白超家族(Nelson等1996 Pharmacogenetics 61-42)，存在于原核生物和真核生物。这些酶被命名为细胞色素，是因为它们在还原性的条件下与一氧化碳形成复合物，在约450nm产生最大吸光度。在细胞内质网(微粒体)或线粒体中均可检测到它们。对于类固醇激素代谢、药物失活、毒素/外生素的脱毒和氧化食品化学物质、环境污染物质、致癌剂和其它天然或合成化学物质，它们是重要的单加氧酶。而且，部分细胞色素P450具有额外的异构酶、还原酶、脱水酶、氧化氮合酶、或酯酶活性(参见Rendic&Di Carlo 1997 Drug Metab Rev 29413-580)。
因为细胞色素P450是电子传递链中的末端氧化酶，所以其作用包括提供两个得自还原的吡啶核苷酸如NADPH的电子。该电子传递过程需要P450与其氧化还原配偶体(黄素蛋白)NADPH-依赖性细胞色素P450氧化还原酶和细胞色素b5相互作用。还原的细胞色素P450结合至氧和其底物。然后该酶催化一个氧原子掺入其底物而另一个氧原子掺入水中。典型的酶反应为P450将羟基掺入底物，例如细胞色素P450 2B6 4-羟化环磷酰胺。此外，某些异生素、有机底物或药物可以诱导或抑制细胞色素P45蛋白和酶活性的表达，例如巴比妥酸盐诱导同种型CYP2B。
该酶的定义如下单加氧酶血红素硫醇盐结合于膜的天然的酶活性需要电子传递链需要分子氧本文所用的术语细胞色素P450包括哺乳动物细胞色素P450基因如P450 2B1、P450 2B6、P450 2A6、P450 2C6、P450 2C8、P450 2C9、P450 2C11和P450 3A4。已经连接其中每一种基因以活化抗癌药物环磷酰胺或异环磷酰胺。产生P450突变体以改进基于P450的酶性前体药物疗法随机定点诱变或定向进化可以提高细胞色素P450的酶活性。定点诱变需要完全了解氨基酸替代对细胞色素P450的结构和功能的影响。与此相反，对P450的已有认识对定向进化并不重要。而且有益突变频率一般较有害突变低。需要多个循环的重组和选择来组合有益突变以改进基因。所以定向进化尤其是DNA重排优于随机诱变，因为每一轮可以产生多个有益突变而不是单个有益突变。尽管如此，两种方法均需要强大而有效的选择或筛选方法，以从无数突变体的文库中获得优势突变。
可通过随机寡核苷酸诱变(Horwitz&Loeb 1986 PNAS 837405-9)、化学诱变(Sweasy&Loeb 1993 PNAS 904626-30)、易错PCR(Cadwell&Joyce 1994 PCR Methods Appl.3S136-40)或DNA重排(Stemmer 1994a Nature 370389-91；Zhan&Arnold 1997 PNAS 947997-8000)进行定向进化。所有这些方法均产生DNA插入片段文库，DNA插入片段可以连接到表达载体中，以在细菌或哺乳动物细胞环境中进行选择或筛选。然而，非DNA重排技术受限于可操作的DNA插入片段大小。在一种典型研究中，发现1-kb片段太大而不能产生易错PCR，而DNA重排能够重新装配高至2.7kb大小的DNA片段(Stemmer 1994b PNAS 9110747-51)。
因为大多数P450编码序列大于1-kb，DNA重排是改进P450基因的合适方法。采用Stemmer氏方法(Stemmer 1994a Nature 370389-91；Stemmer 1994b PNAS 9110747-51)用DNA酶I使相关P450编码序列随机片段化。合并并纯化10-50bp大小的片段。在DNA聚合酶存在下，通过重复的热循环而不需要引物对这些片段进行重叠序列延伸。然后在特异性的5’-和3’-引物存在下，经PCR获得全长基因。此外，用聚合酶在该方法中也引入点突变。另一方面，可以使用Arnold氏交错延伸法(StEP，Zhao等1998 Nat Biotechnol 16258-61)。可使相关的P450编码序列变性并用规定的5’-和3’-引物引导。然后所述引物经受非常简短的DNA聚合酶催化的延伸。用热法将这些延伸的引物从模板分离，之后使其随机退火回到所述模板。在每一个变性和退火/延伸循环中，部分延长的片段与不同模板(模板转换)随机退火，由此导致产生重组体。重复该重组循环直到产生全长基因为止。
作为较小规模的实例，可以重组已知能够代谢氧氮杂磷类(oxazaphosphorines)如环磷酰胺的相关的人P450同种型的DNA编码序列获得对该前体药物更好的酶。包括CYP2A6(Yamano等1990Biochemistry 291322-9&Genbank登记号M33316)、CYP2B6(Yamano等1989 Biochemistry 287340-8&Genbank登记号M29874)、CYP2C8(Okino等1987 J Biol Chem.26216072-9&Genbank登记号M17397)、CYP2C9(Romkes等1991 Biochemistry 303247-3255；erratum 1993 Biochemistry 321390&Genbank登记号M61855或M61857)、CYP2C18(Goldstein等1991 Biochemistry 30，3247-3255&Genbank登记号M61856)、CYP2C19(Romkes等1991 Biochemistry 303247-3255；erratum 1993 Biochemistry 321390&Genbank登记号M61854)和CYP3A4(Gonzalez等1988 DNA 779-86&Genbank登记号M18907；Beaune等1986 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.838064-8068&Genbank登记号M14096；Spurr 1989 Hum.Genet 81171-4&Genbank登记号X12387；Bork等1989 J.Biol.Chem.264910-919&Genbank登记号J04449)。
对于较大规模的方法，可以重组两个或多个亚族的哺乳动物P450以产生改进的针对环磷酰胺或其它相关前体药物的酶。包括大鼠CYP2A1(Matsunaga 1990 Biochemistry 291329-41&Genbank登记号M33312)、小鼠CYP2A4(Squires和Negishi 1988 J.Biol.Chem.2634166-71&Genbank登记号M19319)、人CYP2A6、家兔CYP2A10(Peng等1993 J.Biol.Chem.26817253-60&Genbank登记号L10236)、大鼠CYP2B1(Fujii-Kuriyama等1982 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.792793-7&Genbank登记号J00719)、家兔CYP2B4(Gasser等1988 Mol.Pharmacol.3322-30&Genbank登记号M20856)、人CYP2B6、小鼠CYP2B9(Noshiro 1988 Biochemistry 276434-6443&Genbank登记号M21855)、犬CYP2B11(Graves等1990 Arch.Biochem.Biophys.281106-115&Genbank登记号M92447)、家兔CYP2C1(Leihgton等1984Biochemistry 23204-210&Genbank登记号K01521)、人CYP2C8、人CYP2C9、大鼠CYP2C11(Yoshioka等1987 J.Biol.Chem.2621706-11&Genbank登记号U33173或J02657)、人CYP2C18、人CYP2C19、猴CYP2C20(Komori等1992 Biochim.Biophys.Acta 1171141-6&Genbank登记号S53046)、仓鼠CYP2C25(Sakuma等1994 Mol.Pharmacol.45228-36&Genbank登记号X63022)、小鼠CYP2C29(Matsunaga等1994 Biochim.Biophys.Acta 1184299-301&Genbank登记号D17674)、山羊CYP2C31(Zeilmaker等1994 Biochem.Biophys.Res.Commun.200120-5&Genbank登记号X76502)、猪CYP2C42(Nissen等1998 Anim.Genet.297-11&Genbank登记号Z93098)、大鼠CYP3A1(Gonzalez等1985 J.Biol.Chem.2607435-7441&Genbank登记号M10161)、人CYP3A3(Molowa等1986 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.835311-5&Genbank登记号D00003)、人CYP3A4、人CYP3A5、人CYP3A7(Komori等1989 J.Biochem.105161-3&Genbank登记号D00408)、猴CYP3A8(Komori等1992 Biochim.Biophys.Acta 1171141-6&Genbank登记号S53047)和犬CYP3A12(Ciaccio等1991 Biochim.Biophys.Acta 1088319-322&Genbank登记号X54915)。然而，仍然不了解部分以上所列的同种型代谢氧氮杂磷的能力。定位结构域细胞内定位结构域在第一个实施方案中，所述定位结构域为细胞内定位结构域。
细胞内定位结构域用来使前体药物活化结构域具有亚细胞定位，从而提高前体药物活化结构域的功效。这又使所需要的前体药物剂量降低，从而提高治疗指数。
在该优选的实施方案中，在靶细胞中的靶部位是活化的前体药物作用的亚细胞部位。所以融合蛋白将前体药物活化结构域传递到靶细胞中的相关部位。这提高了活化前体药物的功效。
所述细胞内定位结构域通常为能够优先或特异性结合在亚细胞部位如一种细胞器的肽或多肽。例如，所述细胞内定位结构域可以在细胞内膜如核膜或线粒体膜中具有特异性结合配偶体。或者所述细胞内定位结构域可以特异性地被靶细胞中一种细胞器如核或线粒体摄取，或者所述细胞内定位结构域结合上述的特异性结合配偶体后，另外被一种细胞器摄取。因此，细胞内定位结构域优选为核定位结构域。适用于本发明的核内定位结构域包括SV40大T抗原、核质蛋白和c-myc的核定位结构域。
人们认为活性前体药物的作用与在亚细胞作用部位中的活性代谢物浓度成正比。许多活性化合物通过对肿瘤细胞DNA的直接作用介导其毒性作用。自由基引起DNA链断裂，活化的Tirapazamine(TPZ)即如此(Cahill和White在所引用的书中)，而烷化剂如CP、丝裂霉素C和CB1954则使DNA交联，引起在复制时的剪切(Bligh等1990，Cancer Res.50，7789；Knox等1988，Biochem.Pharmacol.37，4661)。已知部分这些化合物的半衰期，所以推测部分活化酶可以见于核中(J.M.Brown在所引用的书中)，实际上在核部分可以检测到细胞色素P450和P450还原酶活性(Cahill和White在所引用的书中；Friedman等1989 Biochem.Pharmacol.38，3075)。我们已知当将全长P450还原酶cDNA传递到靶细胞时，P450还原酶蛋白定位于细胞质中的内质网(ER)[A.V.Patterson 1997在所引用的书中图1]。P450还原酶蛋白具有ER膜锚着序列，而且通常见于该部分(G.C.M.Smith等1994Proc.Natl.Acad.Sci.91，8710)。所述酶的活性部分释放入胞质溶胶中，因此活性代谢物在ER产生并随后自由地被动扩散入核中。缺失ER锚着序列不会影响所述蛋白的折叠或其结合辅因子以及提供电子的能力(Smith等在所引用的书中)。P450还原酶是天然的ER膜结合组分，然而我们认为有可能将酶靶向核内，进一步靶向染色质以达到提高在靶部位局部的前体药物活化。因此，在一个优选的实施方案中，细胞内定位结构域为核结合结构域。增加代谢物传递至DNA的第一步是将P450还原酶靶向核。鉴定了各种将蛋白转运到核内的肽信号(E.A.Nigg综述于1997，Nature 386，779)，包括但不限于在以下蛋白中鉴定的核定位信号-SV40大T抗原 PKKKRKV核质蛋白 KRPAATKKAGQAKKKKc-myc PAAKRVKLD[信号序列记录为常规单个氨基酸代码字母]。
去除P450还原酶的ER锚着序列，产生不能锚着的P450还原酶(alP450还原酶)。如果用核定位信号(NLS)代替锚着序列，则P450还原酶不再定位于ER，而是主要见于核内。此外，P450还原酶在核内的局部浓度的提高使所述细胞对Tirapazamine(TPZ)杀伤的敏感性提高。该衍生物称为NLS-alP450还原酶。
已经证实P450还原酶基因可以形成相当于所述基因的外显子结构的功能域。特别鉴定了结合FMN、FAD和NADPH的结构域(T.D.Porter等1990 Biochem.29，9814)。这些结构域在结构和功能上均是离散的，使得它们可以表达为蛋白片段而仍能结合其相应的辅因子。例如，已经证实涵盖残基242-677的肽可结合FAD和NADPH，因此该结构域(FN片段)可以将电子传递各种单电子受体(Smith等在所引用的书中)。为了提高靶向核的效率，可以使用只含有参与将电子传递到外源电子受体的活性区的FN片段。将核靶向信号与P450还原酶的残基242-677融合。产生的较小蛋白更易于进入核内。另外的益处是电子被传递给FMN和P450而不会被丢失，因此可用于将电子传递给外源电子受体。另一个益处是较小的大小为某些容量有限的GDV如反转录病毒载体的额外基因让出了空间。该衍生物称为NLS-FN。
P450还原酶是带电荷分子，含有富含赖氨酸和精氨酸的区段(E.A.Shephard等1992，Arch.Biochem.BioPhys.，294，168)。该正电荷有助于保持于核中，甚至可以将所述蛋白定位于DNA上。然而为使核内保留最适化、甚至进一步的染色质定位，可以设计其它融合物。例如可以是与转录因子、高迁移率组蛋白、核被膜蛋白或任何具有需要的核定位作用的蛋白的融合物。跨细胞定位结构域在第二个实施方案中，所述定位结构域是跨细胞定位结构域。
在该方面所述定位结构域将前体药物活化结构域传递到相邻细胞，从而增加治疗细胞数。前体药物在其活化细胞以外的效应的扩大称为“旁观者”效应。这通过先前的活性代谢物扩散到相邻细胞而实现。该方法的两个缺点是它同时将代谢物传递到全身从而产生全身性毒性的危险以及在细胞与细胞之间中稀释代谢物。本发明特别适用于活性代谢物跨膜扩散少的前体药物，例如胸苷激酶和胞嘧啶脱氨酶产生核苷酸类似物、细胞色素P450代谢产生产生的氮芥、P450还原酶产生的Tirapazamine自由基。这是因为它提供跨膜的活化酶而不是代谢物。有用的跨细胞活化结构域包括果蝇触角足同源框肽的第三个螺旋结构域、单纯疱疹病毒VP22蛋白、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF/FGF2)、分泌的单链抗体(s.scFv)和毒素诸如铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)的跨膜转运信号。诸如Kaposi成纤维细胞生长因子和转录因子kB的膜转运序列也是有用的跨细胞活化结构域。
Tirapazamine(TPZ)的活性代谢物的不稳定性足以限制任何旁观者效应，使所述酶在大多数细胞未接受所述基因的VDEPT或GDEPT策略中的作用减弱。为了提高药物如Tirapazamine(TPZ)的旁观者效应，我们设计了使酶分布到整个靶组织的新方法，而不是以上所述的代谢物扩散分布。为此用保证从所述细胞运出并运入相邻细胞的跨细胞的靶向信号(TTS)代替ER膜锚。在一个实施方案中TTS也赋予靶细胞特异性。
运出/运入或跨细胞靶向信号(TTS)可从不同类别的生物系统获得，而且在它们介导的运出-运入的方式上不必在机械学上相关。
合适TTS的部分实例如下-碱性成纤维细胞因子(bFGF或FGF2)。尽管缺乏典型的分泌信号序列，但是许多细胞可分泌碱性成纤维细胞因子。bFGF受体在许多肿瘤类型中是向上调节的，与bFGF相互作用的结果是使与它连接的配体和任何巨大分子快速内化[Baldin等1990 EMBO J.9，1511；Sosnowski等1996，J.Biol.Chem.271，33647和其中所引用的参考文献]。bGFG与P450还原酶或FAD/NADPH片段的融合物产生被运出、然后被任何具有FGF受体的细胞摄取的蛋白。该复合物被转运到细胞核中。可加入另外的信号，例如典型的分泌信号和NLS，以保证从任何产生细胞中的有效运出和在任何靶细胞中的有效核运入。该衍生物称为bFGF-P450R和bFGF-FN。
-pAntp。它是相当于包含于果蝇触角足蛋白的第三个外显子中的同源框结构域的60个氨基酸的多肽。它具有透入细胞并转移到核的特性(Joliot等1991 Proc.Nat.Acad.Sci.，88，1864)。得自pAntp的较小的肽也具有运入活性，并且融合蛋白可被内化(Derossi等1994.J.Biol.Chem.269，1044)。不清楚的是，该肽如何有效地从细胞运出，所以将典型的分泌信号肽包含于融合蛋白中。将非锚着型P450还原酶与分泌信号序列融合，以介导至果蝇触角足蛋白同源框结构域的运出以及至相邻细胞核的运入。该衍生物为Ant-P450还原酶和Ant-FN。
-得自单纯疱疹病毒的VP22蛋白。它是具有301个氨基酸的病毒体结构蛋白，它从感染细胞天然运出，然后被相邻细胞摄入、转运到核并停泊在染色质上。与VP22融合的蛋白类似地运出/运入并定位。[Elliott和O’Hare 1997；WO97/05265]。非锚着的P450还原酶与VP22融合，融合蛋白再分布到相邻细胞的核。该衍生物为VP-P450还原酶和VP-FN。优选柔性接头分开VP22和P450还原酶结构域(见后Somia等)。
-编码转运结构域(II)的截短铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)(I.Pastan和D.Fitzgerald 1991 Science，254，1173；J.Hwang等1987，Cell，48，129)。将转运结构域融合至靶向配体如单链抗体、优选识别肿瘤细胞特异性抗原的单链抗体(例如S.I.Chen等1997 Nature，385，78和其中的参考文献)，以及融合至NLS-alP450还原酶。融合蛋白被分泌并停泊在肿瘤细胞表面，转移以及运入所述细胞内。该衍生物为PEA-5T4-P450还原酶和5T4-PEA-FN。例如，所述靶向配体是抗癌胚抗原5T4的单链抗体，但是可以使用任何scFv，例如抗HER-2的scFv(J.K.Batra等1992，Proc Natl Acad Sci 89，5867)。本发明不一定限于应用单链抗体，在某些情况下可以优选使用双链抗体Fab结构域。
-合成或天然膜转运序列(MTS)。另一合适的跨细胞靶向结构域是信号肽疏水区，通常称为膜转运序列(MTS)。这些可见于许多天然基因例如转录因子kB、Kaposi成纤维细胞生长因子或它们可以是选用于MTS功能的合成肽。这些MTS可以用作将短肽传递入活细胞的载体(例如Lin等1995，用含有细胞膜可渗透的基元和核定位序列的合成肽抑制转录因子NG-kB的核传递，J.Biol.Chem 270，14255)。这类肽可以位于肽的N-末端或C-末端，并证实这类肽能够转运全长蛋白(例如Rojas等1998，具有细胞膜渗透性的融合蛋白的基因工程，Nature Biotechnology，16，370)。例如可将Kaposi成纤维细胞生长因子MTS与编码谷胱甘肽-S-转移酶的细菌酶。在大肠杆菌中表达MTS-酶蛋白，证实该纯化蛋白易于被小鼠细胞摄取。
现在我们描述如何将MTS用于基因治疗。可将MTS融合至前体药物活化酶如P450还原酶或硝基还原酶的融合整个或活性部分，优选融合至所述酶的衍生物例如可以从所产生的细胞中分泌的5T4scFv融合蛋白。周围细胞摄取产生的融合蛋白，从而增加能够活化前体药物的细胞数。分泌信号不必与靶向配体如scFv结合，可以使用任何合适的分泌信号序列。在所述细胞不会自然或因细胞死亡释放蛋白的情况下，加入分泌信号可使产生细胞释放所述融合蛋白。生化结合结构域在第三个实施方案中所述定位结构域为生化结合结构域。我们将生化结合结构域定义为第二前体药物活化结构域，从而使得一种前体药物活化结构域的产物传递给另一种前体药物活化结构域。在一个优选实施方案中，所述另一个结构域可以为另一种酶，使得第一种酶的产物直接传递至第二种酶。这可以实现可以或不可以与核和跨细胞靶向组合的生化结合。生化结合的实例为参与前体药物代谢的细胞色素P450和NADPH细胞色素还原酶。P450将电子提供给细胞色素P450，所述生化反应通过邻近效应增强。制备所述两种蛋白的融合蛋白可以增强邻近效应，从而提高电子转移给相邻蛋白结构域的效率。这对例如环磷酰胺的活化是有用的，其中可通过供给过量的细胞色素P450增强环磷酰胺的活化作用(例如Chen等1996，Cancer Res.56，1331；专利公布第WO 96/04789)，但是环磷酰胺的活化速率即使当所述的酶为等摩尔比时也受限于已知对细胞色素P450活性是亚理想的P450还原酶(例如G.Truan等1993 Gene，125，49)。在细菌系统中已经描述了通过与P450还原酶的生化结合增强细胞色素P450的活性(A.Parikh等1997，Nature Biotechnology，15，784)，但是并没有提出将其用于基因治疗。
根据参与转化的前体药物活化结构域可以将一些前体药物代谢为不同产物，或者通过前体药物活化结构域的组合增强前体药物的代谢。例如，有证据表明P450和P450还原酶均可引起Tirapazamine的低氧毒性(Walton等1992在所引用的书中，J.M.Brown在所引用的书中)。同样，P450能够羟化环磷酰胺的能力取决于P450还原酶的电子转移，说明所述两种酶活性的提高可以增强前体药物的代谢。我们证实前体药物活化结构域的组合可以最大化一种或多种前体药物的毒性作用。所述活化结构域的组合型将取决于具体前体药物组合。作为实例以下概述数种组合型-将P450的编码区融合至P450还原酶的编码区或一种以上所述的P450R的衍生物。细胞色素P450和P450还原酶的融合物如前所述，但是未描述本文所述的特定编码序列以及没有提及基因治疗用途方面(Blake等1996 FEBS Lett 397210；细胞色素P450 3A4与P450还原酶融合，M.S.Shet等1993 Proc.Natl.Acad.Sci.90，11748；大鼠细胞色素P4501A1与酵母P450还原酶融合，T.Sakaka等1994细胞色素P450第八届国际会议，编辑M.C.Lechner，第429-432页；Chun等1996 Arch Biochem Biophys 33048)。在所述融合物中的所述蛋白的相邻性加强电子转移至P450，从而提高前体药物如环磷酰胺的代谢。
生化结合结构域也可以是巨噬细胞形式。在该实施方案中所述巨噬细胞将表达前体药物活化酶。
如上所述，优选P450邻近P450还原酶。我们现在发现P450还原酶存在于人巨噬细胞中。我们目前发现P450不在巨噬细胞中表达，但是我们还发现可以工程改造巨噬细胞表达P450。我们进一步证实这类工程的巨噬细胞可以用来活化前体药物如环磷酰胺。其它前体药物的实例在该说明书中的其它地方给出。
优选工程巨噬细胞组成型或调节性表达编码前体药物活化酶。合适的启动子实例是巨细胞病毒CMV启动子和低氧效应元件(HRE)；尽管可以使用其它启动子，并且它们也是本领域技术人员已知的。
可通过巨噬细胞表达的前体药物活化剂不受限于P450。可以使用其它前体药物活化剂如胞嘧啶脱氨酶。这类前体药物活化剂将是本领域技术人员已知的。
在本发明特别优选的实施方案中，提供能够表达P450的巨噬细胞。优选P450为CYP2B6。优选P450在CMV启动子控制之下。这样的前体药物活化剂可以联合前体药物环磷酰胺用于治疗。
巨噬细胞也可以采用如后所述的传递方法。化学结合域在第四个实施方案中，所述定位结构域是化学结合结构域。化学结合结构域是指改变细胞内化学环境以最适化前体药物活化结构域的活性的条件的结构域。例如某些前体药物的生物还原活化取决于低氧环境。有的药物如Tirapazamine的活化被分子氧逆转(J.M.Brown综述于Br.J.Cancer 1993，67，1163)。NADPH依赖性还原酶如P450还原酶活化Tirapazamine。在本发明中可用另外的蛋白来去除细胞的分子氧，以有利于生物还原Tirapazamine的条件。一个实例是提供具有P450R的细胞色素P450酶。细胞色素P450是一种单加氧酶并将还原分子氧，从而增强活化Tirapazamine的P450还原酶的低氧环境。在微生物系统中已经提出了用P450还原酶增强细胞色素P450活性，但是以前在任何意义上均未提出通过细胞色素P450增强P450还原酶活性。
所述化学结合结构域也可以与细胞内、跨细胞或生化结合结构域一齐使用。
因为P450利用分子氧，所以我们建议可以将它用来通过促进维持低氧环境以进一步增强药物如Tirapazamine(TPZ)和MMC的活化。已经证实在小鼠随同给予环磷酰胺和Tirapazamine可增强杀伤肿瘤细胞(S.A.Holden等1992，J.Nat.Canc.Inst.84，187)。尽管希望不受任何理论的限制，但是可能这是上述强化概念的体内发现。我们现在证实随同给予细胞色素P450和P450还原酶可增强细胞对Tirapazamine敏感性。联合给予细胞色素P450和P450还原酶的进一步的优势是它具有联合环磷酰胺和Tirapazamine药物治疗的有用性。其它的前体药物活化酶和衍生物的组合如下例如融合蛋白450FN可以与P450还原酶或衍生物随同给予以增强CP活化和Tirapazamine活化。其它药物组合包括丝裂霉素C和Tirapazamine。线粒体结合线粒体DNA(mt-DNA)是DNA加合物形成的高度敏感靶。mt-DNA充满了丰余性极低的有功能而重要的编码序列(94.4％)，因为在重要编码序列产生损伤的概率相当高，所以mt-DNA损伤较核DNA损伤的细胞毒性更高。此外，mt-DNA没有组蛋白保护所述DNA免遭攻击，因此它对活性代谢物或产生自由基的链断裂剂的烷化作用非常敏感。已经证明线粒体是药物如MMC的重要靶(Pritsos等1997Oncol Res 6-7，333)。
还有证据指出线粒体在编程性细胞死亡的效应中起着关键作用(Henkart和Grinstein 1996 J Exp Med 183，1293；Papa和Skulachev 1996；Decaudin等1998 Int J Oncol 12，141)。在编程性细胞死亡的核特征出现前是线粒体功能和结构的改变(Petit等1997 Mol Cell Biochem 174，185)。这看来涉及通常隐蔽在膜间隙的蛋白酶类诱导编程性细胞死亡的蛋白的释放。在线粒体膜破坏的效应中因其内膜上所谓的渗透转运孔的开放引起的线粒体肿胀而释放所述蛋白。重要的是，已知活性氧种类(ROS)的水平升高可诱导线粒体孔(Skulachev 1996 FEBS Lett397，7；Susin等1997)。
设想将前体药物活化酶靶向线粒体可提高前体药物对所述细胞的毒性，并刺激所述编程性细胞死亡效应通路。
增强前体药物代谢物传递至线粒体DNA的第一步是将所述前体药物活化酶转运到线粒体内。合成作为含有氨基末端前序列的蛋白前体的线粒体蛋白。很少不具有所述氨基末端处长序列的蛋白定位于线粒体。所述前序列是必需的，而且在有些情况下可满足运入需要(Verner和Schatz 1988 Science 241，1307；Fenton 1995 Amer J HumanGenetics 57，235)。尽管前序列缺乏原序列的同源性，但是它们富含碱性和羟化氨基酸，缺乏酸性氨基酸和长的疏水性延长段，因此能够形成两亲性α-螺旋和β-折叠构型。在本发明中将编码线粒体运入信号的DNA序列融合至前体药物活化酶的编码序列。合适的运入序列描述于Verner和Schatz 1988和Fenton 1995。所述融合蛋白在靶细胞中表达后，运入线粒体内。造血干细胞(HSC)作为背景信息，单核细胞及其分化衍生物巨噬细胞得自称为HSC的胚细胞贮源，它们能够产生多种不同的细胞类型。在哺乳动物中，HSC在胚胎肝脏、脾脏和骨髓中发现，但在出生后和整个成体生活中，通常只在骨髓中发现它们。在诸如细胞-细胞相互作用和存在可溶性细胞因子的微环境因素影响下，HSC分化为各种细胞谱系。
由HSC产生四种主要的细胞谱系。这些谱系包括红细胞类谱系(红细胞)；巨核细胞谱系(血小板)；骨髓谱系(粒细胞和单核吞噬细胞)；和淋巴谱系(淋巴细胞)。特别是，骨髓谱系和淋巴谱系对于免疫系统的功能是关键性的。
在妊娠约6周的人类胎儿的肝脏中开始成髓作用。其中已经由个体干细胞体外生长出集落的研究，已经表明得自HSC的第一祖细胞为可以产生粒细胞、红细胞和巨核细胞的集落形成单位(CFU)(CFU-GEMM)。
在组织特异性蛋白调节物网络的影响下，发生这些细胞的成熟，其中已经给出所述调节物许多名称，包括生长因子、细胞因子和白介素。大体上，没有区别不同类别生长因子的功能或结构特征。大多数因子看来能够刺激多种生物反应，关键依赖于其靶细胞的不同分化状态。例如，一种造血生长因子粒细胞集落刺激因子(G-CSF)刺激未成熟骨髓细胞的增殖以及激活成熟嗜中性粒细胞对细菌的杀伤。红细胞生成素(EPO)和血小板生成素(TPO)是结构相似的细胞因子，分别支持红细胞类谱系和巨核细胞谱系以及更原始祖先的增殖和分化(Gotoh等1997 Ann Hematol 75207-213)。TPO通过结合于造血受体家族一成员Mpl受体而启动其生物效应(Broudy等1997 Blood891896-1904)。已经表明HOXB4是非常早期的重要调节物，而不是晚期造血细胞增殖的重要调节物(Sauvageau等1995 Genes Dev 91753-1765)。可溶性Kit配体蛋白(Kls)作为跨膜酪氨酸激酶受体C-kit的配体起作用，并刺激肥大细胞和红细胞类祖先(91EP-810609)。白介素包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6和IL-12，它们能够激活HSC(参见“Molecular Biology and Biotechnology编辑RA Meyers1995 VCH Publishers Inc第392-397页)。
这些介质在血生成的正调节中是重要的，主要得自骨髓中的基质细胞，但它们也由成熟形式的分化的骨髓细胞和淋巴样细胞产生。有许多成功的生长因子组合可使用，但IL-3和IL-6与或不与其它在原始细胞上有活性的因子(诸如干细胞因子(SCF))的组合已经得到最佳结果(Bodine等1989 Proc Natl Acad Sci 868897-8901；Luskey等1992 Blood 80396-402；Fraser等1990 Blood 76；1071-1076)。其它细胞因子(诸如TGFβ)可以向下调节血生成。
CFU-GM细胞是嗜中性粒细胞和单核吞噬细胞的前体。由于CFU-GM沿嗜中性粒细胞途径分化，因此可以观察到几种不同的形态学阶段。原粒细胞发育为早幼粒细胞和中幼粒细胞，它们成熟并作为嗜中性粒细胞释放到循环中。由CFU-GM至成熟嗜中性粒细胞的单向分化可能是于不同发育阶段获得特定生长/分化因子受体的结果。
由于所述细胞发育为粒细胞，因而所述细胞上的表面分化标记消失或出现。例如，II类MHC和CD38在CFU-GM上表达，但不在成熟的嗜中性粒细胞上表达。在分化过程中获得的其它表面分子包括CD13、低密度的CD14、CD15、β1整联蛋白、VLA-4、与CD18β2链相关的β2整联蛋白CD11a、b和c、补体受体和CD16Fcγ受体。
采用单核细胞途径的CFU-GM最初产生增殖性原单核细胞。这些细胞分化为幼单核细胞，最后分化为成熟循环单核细胞。循环单核细胞被认为是滞留组织的巨噬细胞的交换库。不同形式的巨噬细胞包括视网膜内皮系统。
同成熟的嗜中性粒细胞一样，成熟的单核细胞和巨噬细胞丧失了CD34。然而，与嗜中性粒细胞不同，它们继续表达显著水平的II类MHC分子。这些分子显然对于将抗原提呈给T细胞是重要的。单核细胞也与成熟的嗜中性粒细胞一样获得许多的这些表面分子。
除巨噬细胞外，出生时存在大多数典型的抗原提呈细胞(APC)，包括小结树突细胞、朗格汉斯细胞和交错突细胞。尽管其起源仍不清楚，但可能大多数得自骨髓干细胞。一种可能性是，它们得自相同的CFU-GEMM前体，则细胞形态、细胞化学和功能的差异可以是由于局部微环境的影响，诸如细胞因子。或者，APC可能得自不同的干细胞，并且代表单独的分化谱系。
在分化为集落形成细胞(诸如CFU-GEMM)的第一阶段，HSC表达CD33和CD34。因此，HSC通常可以根据细胞表面的细胞糖蛋白CD34(可能是CD33)的存在来特征鉴定。
在分化为红细胞类谱系、骨髓单核细胞谱系和巨核细胞谱系的下一阶段中，重要的红细胞类谱系的爆发集落形成单位-红细胞类(BFUE)细胞携带抗原CD33和CD34，但这些抗原在后来的分化中丧失。包括CFU-GM细胞在内的骨髓单核细胞谱系携带CD33，但不携带CD34，并且这种CD33随后丧失。巨核细胞谱系最初产生携带CD34的CFU大细胞，CD34也随后丧失。
HSC和其它细胞上再一重要的抗原系统是II类MHC(主要组织相容性复合物)群。已经发现，大多数HSC携带称为DR的抗原，并且在分化时表达称为DP的抗原，然后表达另一称为DQ的抗原。因此，II类MHC DR抗原是相对早期干细胞的特征。
分离HSC及其在培养物中维持和分化的方法在本领域(Santiago-Schwartz等1992 J Leuk Biol 52274-281；Charbord等1996 Br JHaematol 94449-454；Dao等1997 Blood 89446-456；Piacibello等1997Blood 892644-2653)和WO91/09938中是已知的。也描述了反转录病毒介导的HSC转导以及转移至患者的方法(Dunbar等1996 Hum GeneTher 7231-253)。融合蛋白在需要融合蛋白的本发明中，通过构建杂交DNA分子融合所述结构域。该杂交分子给定额外分子的氨基酸序列，所述额外分子共价结合至给定前体药物活化结构域的全部或活性部分的DNA序列。如果需要随同给予而不是融合蛋白，则将编码前体药物和额外蛋白的两个基因掺入所设计的合适基因传递载体(GDV)以保证随同给予细胞。例如额外蛋白可以用不同的启动子/增强子从同一载体中的不同表达盒表达，换句话说，由内部核糖体进入位点IRES分隔的两个编码序列的包含物将实现随同给予。
因此，另一方面本发明提供编码至少一个本文所述药物组分的核酸，该核酸能够在靶细胞中表达至少一个药物组分。本发明优选提供编码本文所述融合蛋白的核酸，该核酸能够在靶细胞中表达所述融合蛋白。
另一方面，本发明提供含有编码至少一个所述系统组分的核酸的核酸载体，该载体能够将所述核酸传递至靶细胞。本发明优选提供含有编码所述融合蛋白的核酸的核酸载体，该载体能够将所述核酸传递至靶细胞。按照本发明的合适载体包括病毒载体、尤其是反转录病毒载体。核酸本发明还提供编码本发明融合蛋白的核酸。采用标准重组DNA方法学可以构建这些核酸。所述核酸可以是RNA或DNA，优选为DNA。如果是RNA，可以通过cDNA中间体进行操作。一般来说，制备编码第一个区的核酸序列，将合适的限制性位点置于5’和/或3’端。可以在标准实验室载体如基于pBR322或pUC19的质粒载体中方便地操作所述序列(见下文)。可以参考Sambrook等的分子克隆(ColdSpring Harbor，1989)或准确详述合适技术的类似标准参考书。
同样，编码第二区的核酸可以在相似载体系统中提供。参考公开出版文献或数据库如Genbank可以确定核酸来源。表达载体和宿主细胞可以将编码按照本发明的融合蛋白的核酸或其组分部分掺入载体中供进一步操作。本文所用的载体(或质粒)是指用来将外源性DNA引入细胞以使其表达或复制的不连续元件。这类载体的选择和使用完全在本领域技术人员技术范围内。可采用许多载体，合适载体的选择将取决于所述载体的指定用途，即是否用于DNA扩增或DNA表达、插入载体的DNA的大小和用载体转化的宿主细胞。根据其功能(扩增DNA或表达DNA)以及与其匹配的宿主细胞，每种载体含有各种组分。所述载体组分一般包括但不限于一种或两种以下组分复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子、转录中止序列和信号序列。
表达载体包括任何能够表达操作性与能够表达所述DNA的调节序列如启动子区连接的核酸的载体。所以，表达载体是指在引入合适宿主细胞时引起所克隆的DNA表达的重组DNA或RNA构建物，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其它载体。合适的表达载体是本领域技术人员熟知的，包括可在真核细胞和/原核细胞中复制的表达载体和保留游离的表达载体或整合入宿主细胞基因组的表达载体。例如，编码按照本发明的融合蛋白的DNA插入适合在哺乳动物细胞中表达cDNA的载体，例如基于CMV增强子载体如pEVRF(Matthias等，(1989)NAR 17，6418)。
构建本发明的载体可采用常规连接技术。将所分离的质粒或DNA片段以产生所需要质粒的需要方式切割、加尾及重接。需要时以已知方式进行分析证实所构建的质粒中的正确序列。构建表达载体、体外制备转录物、将DAN引入宿主细胞以及进行分析以评价表达和融合的合适方法是本领域技术人员已知的。采用根据本发明提供的序列的适当标记的探针，例如直接用常规DNA印迹法、定量mRNA转录物的RNA印迹法、点印迹法(DNA或RNA分析)或原位杂交检测样品中基因的存在、扩增和/或表达。需要时，本领域技术人员将容易设计如何改进这些方法。传递系统在本发明中可通过任何合适的基因传递载体GDV将所述杂交DNA分子传递至靶细胞群。这包括但不限于配制于脂质或蛋白复合物中或作为裸DNA通过注射或生物发射传递给予的DNA、病毒如反转录病毒、腺病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、腺伴随病毒。重组DNA技术以及基因表达领域的一般技术人员可以设计GDV以适当水平和特定用途要求的细胞特异性表达融合蛋白。换句话说，所述新前体药物活化酶的组合可用单核细胞、巨噬细胞、淋巴结细胞或造血干细胞传递。特别可使用新的细胞依赖性传递系统。在该系统中将编码前体药物活化酶和蛋白组合的基因体外引入巨噬细胞、单核细胞或单核细胞干细胞前体，然后再引入患者体内。
正如本领域众所周知的，载体是允许或促进一种实体从一种环境转移至另一种环境的工具。按照本发明，并且作为实例，用于重组DNA技术的某些载体允许诸如DNA区段(诸如异源DNA区段，诸如异源cDNA区段)的实体转移入靶细胞。任选的是，一旦处于靶细胞中，所述载体则可以用来将异源DNA维持在所述细胞中，或可以用作DNA复制单位。用于重组DNA技术的载体的实例包括质粒、染色体、人工染色体或病毒。
所述载体可以通过病毒或非病毒技术传递。
非病毒传递系统包括但不限于DNA转染法。在此，转染包括使用非病毒载体将基因传递至靶哺乳动物细胞的过程。
典型的转染方法包括电穿孔、DNA生物发射(biolistics)、脂质介导的转染、紧密(compacted)DNA介导的转染、脂质体、免疫脂质体、脂转染试剂、阳离子试剂介导的转染、阳离子表面两亲物(CFA)(NatureBiotechnology 1996 14；556)、多价阳离子诸如精胺、阳离子脂质或聚赖氨酸、1，2-双(油酰氧基)-3-(三甲基铵基)丙烷(DOTAP)-胆固醇复合物(Wolff和Trubetskoy 1998 Nature Biotechnology 16421)和它们的组合物。
病毒传递系统包括但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、反转录病毒载体、慢病毒载体、痘病毒、痘相关病毒(pox-associated virus)、痘慢病毒或杆状病毒载体。
反转录病毒的实例包括鼠类白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、弗吉纳米肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠类白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠类骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫洛尼鼠类肉瘤病毒(Mo-MSV)、艾贝尔逊鼠类白血病病毒(A-MLV)、鸟类髓细胞瘤病病毒-29(MC29)和鸟类成红细胞增生病毒(AEV)。
在Coffin等(“Retroviruses”1997 Cold Spring Harbour LaboratoryPress编辑JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus第758-763页)中，可以找到详细的反转录病毒一览表。
在本领域中可以找到关于某些反转录病毒的基因组结构的细节。作为实例，可以从NCBI Genbank中找到关于HIV和Mo-MLV的细节(基因组登记号分别为AF033819和AF033811)。
反转录病毒可以大致分为两类即“简单”和“复杂”反转录病毒。反转录病毒甚至可以进一步分为7组。其中5组是具有致癌潜力的反转录病毒。其余2组是慢病毒和泡沫状病毒属病毒(spumavirus)。这些反转录病毒的综述见于Coffin等，1997(同上)。
慢病毒群甚至可再分为“灵长类”和“非灵长类”慢病毒。灵长类慢病毒的实例包括人免疫缺陷病毒(HIV)(即人自身免疫缺陷综合征(AIDS)的致病因子)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类慢病毒群包括原型“慢病毒”维斯那/梅迪病毒(VMV)以及相关的羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)和新近描述的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。
慢病毒科和其它类型反转录病毒之间的不同之处在于，慢病毒具有感染分裂细胞和非分裂细胞的能力。相反，诸如MLV的其它反转录病毒不能感染非分裂细胞，诸如构成例如肌肉、脑、肺和肝脏组织的细胞。
每个反转录病毒基因组均包含称为gag、pol和env的基因，它们编码病毒体蛋白和酶。在原病毒中，这些基因两端的侧翼为称为长末端重复序列(LTR)的区域。LTR负责原病毒的整合和转录。它们也作为增强子-启动子序列起作用并可控制病毒基因的表达。反转录病毒RNA的包衣壳借助于位于病毒基因组5’端的psi序列而发生。
LTR本身是相同的序列，它们可以分为三种元件，它们称为U3、R和U5。U3得自所述RNA 3’端特有的序列。R得自于所述RNA两端重复的序列，而U5得自所述RNA 5’端特有的序列。在不同反转录病毒中，这三种元件的大小可以显著变化。
传染性反转录病毒RNA基因组的基本分子结构是(5’)R-U5-gag，pol，env-U3-R(3’)。在缺陷型反转录病毒载体基因组中，gag、pol和env可能不存在或没有功能。该RNA两端的R区是重复序列。U5和U3分别代表RNA基因组5’和3’端特有的序列。
不同反转录病毒之间的宿主范围和组织嗜性不同。在某些情况下，这种特异性可以限制重组反转录病毒载体的转导潜力。因此，许多基因治疗试验使用MLV。具有称为4070A的包膜蛋白的特定MLV称为兼嗜性病毒，它也可以感染人细胞，因为其包膜蛋白与人和小鼠之间保守的磷酸转运蛋白“对接”。这种转运蛋白是普遍存在的，因此这些病毒能够感染许多细胞类型。
然而，在某些情况下，尤其从安全的角度来看，它可能对特异性导向限定细胞有益。用异源env基因取代所述env基因是用来特异性靶向某些细胞类型一个技术或策略实例。该技术称为假型化，在WO-A-98/05759、WO-A-98/05754、WO-A-97/17457、WO-A-96/09400和WO-A-91/00047中可以找到实例。
术语“重组反转录病毒载体”(RRV)是指这样的载体，它具有足够的反转录病毒遗传信息，以在存在包装组分的情况下，允许将RNA基因组包装为能够感染靶细胞的病毒颗粒。靶细胞的感染包括反转录和整合入靶细胞基因组中。使用的RRV携带将由所述载体传递至靶细胞的非病毒编码序列。RRV不能独立复制，以在最终的靶细胞中产生感染性反转录病毒颗粒。
在用于基因治疗的典型的重组反转录病毒载体中，可以从病毒除去gag、pol和env蛋白编码区中的一种或多种的至少一部分。这使得反转录病毒载体为复制缺陷型。除去的部分甚至可以用一种NOI取代，以便产生能够将其基因组整合入宿主基因组的病毒，但其中修饰的病毒基因组由于缺乏结构蛋白而本身不能繁殖。当整合入宿主基因组中时，所述NOI表达，产生例如治疗和/或诊断效应。因此，通常通过将NOI整合入重组病毒载体中；将修饰的病毒载体包装入病毒体外壳中；并允许转导目的位点，诸如靶细胞或靶细胞群体，而将所述NOI转移至目的位点。
通常采用包装细胞系或辅助细胞系和重组载体的组合，繁殖复制缺限型反转录病毒载体，以例如制备合适滴度的反转录病毒载体，用于后续的例如目的位点的转导。即可以反式提供所述三种包装蛋白。
“包装细胞系”含有反转录病毒gag、pol和env基因中的一种或多种。所述包装细胞系产生包装反转录病毒DNA所需的蛋白，但由于缺乏psi区而导致不能包衣壳。然而，当将携带NOI和psi区的重组载体引入包装细胞系时，所述辅助蛋白可以包装psi阳性重组载体，产生重组病毒原种。该病毒原种可以用来转导细胞，以将所述NOI引入靶细胞基因组中。因为已经证明它可以增加病毒滴度，所以优选使用称为psi+的psi包装信号，它含有从剪接供体上游至gag起始密码子的下游的额外序列。
其基因组缺乏制造病毒蛋白所需的所有基因的重组病毒，仅可以转导一次，并且不能繁殖。这些仅能转导一轮靶细胞的病毒载体被称为复制缺陷型载体。因此，将所述NOI引入宿主/靶细胞基因组，而不产生潜在有害的反转录病毒。在Coffin等(1997)(同上)中概述了可用的包装系。
优选使用其中在独立转染入包装细胞系的分离的表达质粒中携带gag、pol和env病毒编码区的反转录病毒包装细胞系。该策略有时称为三质粒转染法(Soneoka等，1995)，降低了可复制病毒产生的潜力，因为野生型病毒的产生需要三次重组事件。因为同源性明显促进重组，所以减小或消除所述载体和辅助者基因组之间的同源性也可以用来减轻产生可复制辅助病毒的问题。
稳定转染包装细胞系的替代方法将采用瞬时转染细胞系。当研制载体时，瞬时转染可有利地用来测量载体产生的水平。在该方面，瞬时转染避免了产生稳定的载体生产细胞系所需的较长时间，如果该载体或反转录病毒包装组分对细胞有毒性，则也可以使用瞬时转染。通常用来产生反转录病毒载体的组分包括编码Gag/Pol蛋白的质粒、编码Env蛋白的质粒和含有NOI的质粒。载体的产生包括将这些组分中的一种或多种瞬时转染入含其它所需组分的细胞中。如果该载体编码有毒基因或编码干扰宿主细胞复制的基因，诸如细胞周期抑制剂或诱导细胞凋亡的基因，则可能难以产生稳定的载体生产细胞系，但瞬时转染可以用来在细胞死亡之前产生所述载体。此外，利用瞬时转染，已经开发出产生的载体滴度水平与得自稳定的载体生产细胞系的水平相当的细胞系(Pear等，1993)。
在实验和实践应用中均非常需要使用高滴度的病毒制剂。提高病毒滴度的技术包括如上所述的psi+包装信号和病毒原液浓度。另外，采用不同的包膜蛋白如水疱性口炎病毒的G蛋白已经将病毒滴度提高至浓度高达109/ml(Cosset等，1995)。另一种技术是构建反转录病毒载体的断裂内含子系统。这将在下文描述。
除了为提高载体滴度而操作反转录病毒载体外，还设计了在转导细胞中诱导产生特异性NOI的反转录病毒载体。如前所述，最常用反转录病毒载体设计包括用一种或多种NOI代替反转录病毒序列，产生复制缺陷型载体。关于NOI表达的调节，目前主要使用三种方法。
1.已经用最简单的方法将反转录病毒5’LTR中的启动子用来控制编码NOI的cDNA的表达，或改变LTR的增强子/启动子以提供组织特异性表达或诱导性。当插入多个NOI时，额外的下游NOI可利用内部核糖体进入位点从多顺反子mRNA表达。
2.所述NOI可与内部异源启动子操作性连接。该排列使启动子选择具有更大的灵活性。额外的NOI仍然可以从5’LTR表达或可使LTR突变以防止感染靶细胞后的表达。
3.NOI与反向的调节控制元件一起插入5’LTR。可以包括含有增强子、启动子、内含子和3’区。因此可以实现紧密调节组织特异性的基因表达。
另外，我们现在已证明将反转录病毒载体、尤其是慢病毒载体装配为单个转录单位载体具有优势，由此使本发明的HRE/启动子构建物处于3’LTR中，使得产生的3’LTR复制引起调节序列的复制(即原病毒的5’LTR将含有从3’LTR复制的HRE/启动子构建物)。我们已经证明这种排列可以以协同方式增强对低氧的活化效应。因此优选使用其LTR中含有本发明HRE/启动子的反转录病毒载体。更准确地说，HRE/启动子构建物(任选地与任何额外的调节序列如组织特异性增强子元件一起)可以插入所述反转录病毒载体的3’U3区或5’U5区，最优选3’U3区。最好不将NOI插入LTR，因为在原病毒中产生两个拷贝可能减小反转录病毒载体可容纳的NOI的大小。然而，优选将NOI插入通常为env基因占据的反转录病毒载体的区段。
所述NOI可以包括或不包括选择标记。如果该载体含有不是选择标记的NOI，则可以通过与存在于另一个质粒上的选择标记共转染，将该载体引入包装细胞。该策略对于基因治疗有吸引力的优点是在最终的靶细胞中表达单一的蛋白，并且避免了选择标记的可能毒性和抗原性。然而，当所插入的基因不可选择时，该方法的缺点是，更难以制出产生高滴度载体储液的细胞。另外，通常更难以测定该载体的滴度。
目前用来设计表达两种或两种以上蛋白的反转录病毒载体的方法，依赖于三种通用的策略。这些策略包括(i)由一种启动子转录的可变剪接的mRNA表达不同的蛋白；(ii)使用5’LTR中的启动子和内部启动子，驱动不同cDNA的转录，和(iii)使用内部核糖体进入位点(IRES)元件，以允许由或者单一mRNA或者由可以从一个可读框表达的融合蛋白翻译多个编码区。
含内部异源启动子的载体已经广泛用来表达多个基因。内部启动子使得可以利用非病毒LTR的启动子/增强子组合，来驱动基因表达。多个内部启动子可以包括在反转录病毒载体中，已经证明它可以从其自身的启动子表达至少三种不同的cDNA。慢病毒慢病毒群可分为“灵长类”和“非灵长类”慢病毒。灵长类慢病毒的实例包括为人自身免疫缺陷综合征(AIDS)的致病因子的人免疫缺陷病毒(HIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类慢病毒群包括原型“慢病毒”维斯那/梅迪病毒(VMV)以及相关的羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)和新近描述的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。
慢病毒科和其它类型反转录病毒之间的不同之处在于，慢病毒具有感染分裂细胞和非分裂细胞的能力。相反，诸如MLV的其它反转录病毒不能感染非分裂细胞，诸如构成例如肌肉、脑、肺和肝脏组织的细胞。所以，在本发明中最好使用慢病毒载体，因为慢病毒能够感染各种非分裂细胞，相反，某些其它反转录病毒需要细胞分裂以稳定整合。
在反转录病毒科慢病毒亚科的不同成员的基础上，已经开发了许多载体，其中许多载体是专利申请的主题(WO-A-98/18815；WO-A-97/12622)。优选的慢病毒载体以HIV、SIV或EIAV为基础。由HIV-1构成的最简单的载体除缺失部分env编码区或取代nef编码区外，具有全部HIV基因组。特别是这些载体表达gag/pol，因此所有辅助基因均仅需要包膜来产生感染性病毒颗粒。在辅助基因中，vif、vpr、vpu和nef是非必需的。然而，新近已经描述了有效但缺乏大多数或所有辅助因子的载体，例如Blomer等，1997和Kim等，1998。因此本发明慢病毒载体优选缺乏至少一个辅助基因，更优选缺乏所有辅助基因。
基于HIV的慢病毒载体的一般优选形式为HIV 5’LTR和前导序列、某些gag编码区序列(以提供包装功能)、报道基因盒、rev效应元件(RRE)和3’LTR。在这些载体中，gag/pol、辅助基因产物和包膜功能或者由单质粒或者由两种或两种以上共转染的质粒供应，或者通过用HIV共转染含载体的细胞来提供。新近，已经进一步改善了慢病毒载体结构。例如，已经产生了自身失活的HIV载体，其中缺失HIV LTR，以将表达限于内部盒(Myoshi等1998)。
在优选的实施方案中，本发明的慢病毒载体为非灵长类慢病毒载体如EIAV。我们最近证实，产生有效克隆载体需要得自非灵长类慢病毒的载体基因组序列的量基本上小于关于HIV载体所述的量。我们已证实缺乏gag基因的大区段的基本EIAV载体足以有效包装，而且确实产生较高病毒滴度。所以，基本EIAV基因组载体通常包含启动子以及任选的含有能够指导依次含有以下EIAV元件的反转录病毒基因组的增强子含有一个R-区和一个U5区的部分5’LTR；得自含有一个功能性包装信号和部分gag编码序列的gag基因的5’非翻译区的序列；目的基因的插入位点和EIAV的3’LTR。所述3’LTR可以是杂种LTR，至少含有EIAV的多嘌呤序列段和R-U5区和取代所述U3区全部或部分的另一来源的序列。或者，可以替换在5’和3’LTR中的R区。WO-A-96/33623描述了替换反转录病毒载体基因组的U3和R区的方法。
gag基因部分优选含有gag编码区的前350个核苷酸内的核苷酸，更优选仅含有gag编码区的前150或109个核苷酸，特别优选仅约前109个核苷酸。
在本发明第一方面特别优选的实施方案中，hCMV-MIE启动子增强子用来指导反转录病毒RNA转录物的表达。例如本发明的低氧效应增强子(HRE)和SV40或MLV启动子可以替换U3区增强子。
基本EIAV载体还缺乏S2、Tat、Rev和dUTP酶基因，但是仍然可以用于载体的产生或用于转导分裂和非分裂细胞。通常通过反式提供gagpol和env功能使所述病毒基因组包装于细胞中。例如编码gagpol和env的DNA序列与如上所述的一般反转录病毒的基本载体一起共转染入细胞中。gagpol序列优选为非灵长类慢病毒来源。特别有利的是在5’LTR的末端和gagpol编码序列上游的gag的ATG起始密码子之间含有前导序列，以提供最大的gagpol表达。此外，最好是含有Rev和/或RRE序列，尽管这不是必须的，并可通过EIAVgagpol的密码子最优化消除。反转录病毒的断裂内含子技术原病毒DNA的转录再产生全长的病毒RNA基因组大小的RNA分子和通过RNA加工产生的亚基因组大小、的RNA分子。通常，所有的RNA产物均用作产生病毒蛋白的模板。通过RNA转录物剪接和翻译期间核糖体移码的组合，完成RNA产物的表达。
通过识别在将剪接序列的边界的短共有序列的RNA加工器(剪接体)在较高级的真核细胞中进行RNA转录物剪接。这些共有剪接位点遵循所谓的‘GT-AG规则’〔尽管在RNA序列中GT自然为GU)。5’位点或剪接供体(SD)在第一个外显子的边界具有高度保守的GT二核苷酸，3’位点或剪接受体(SA)在第二个外显子-内含子边界具有高度保守AG二核苷酸。这些共有序列赋予剪接过程方向性。已经证实剪接位点是种属性的-它们不具有特定RNA前体的特异性，可以由任何细胞剪接。所述剪接过程也取决于在待剪接掉所述区段中的称为分支位点的序列的存在。分支位点一般位于3’SA上游的18-40个核苷酸之间，并认为它被鉴定为正确剪接位点的最近的SA以连接至5’SD。
与其中所有内含子被有效剪接的大多数细胞mRNA不同，新合成的反转录病毒RNA必须转变为两个群体。一个群体保持未剪接，以用作基因组RNA，而另一群体进行剪接，以提供亚基因组RNA。
在简单反转录病毒中，一个群体的新合成的反转录病毒RNA保持未剪接，以用作基因组RNA并作为gag和pol的mRNA。另一群体进行剪接，将基因组RNA的5’部分融合至下游基因，最常见为env。用位于gag上游的剪接供体和pol 3’末端附近的剪接受体完成剪接。在剪接供体和剪接受体之间、通过剪接去除的内含子含有gag和pol基因。这一剪接事件产生包膜(Env)蛋白的mRNA。所述剪接供体通常位于gag上游，但在诸如ASLV的某些病毒中，剪接供体位于gag基因中的少数密码子，产生第一Env翻译产物，包括与Gag共同的少数氨基末端氨基酸残基。Env蛋白在膜结合多核糖体上合成，并通过细胞的囊泡输运转运至质膜，在此它被加入病毒颗粒中。
复杂的反转录病毒既产生单剪接转录物，也产生多剪接转录物，它们不仅编码env基因产物，而且编码数组对于这些病毒独特的调节蛋白和辅助蛋白。复杂的反转录病毒诸如慢病毒，尤其是HIV，提供了在反转录病毒感染期间可能发生的可变剪接复杂性的突出实例。例如，现在已知，HIV-1能够通过亚适剪接，由第一基因组转录物产生30种以上的不同mRNA。由于破坏竞争性剪接受体的突变可以引起剪接模式的变化，并且可以影响病毒的感染性，因此看来这种选择过程受到调节。
本发明的反转录病毒载体可利用高级真核细胞剪接5’SD和3’SA之间的序列的能力。在断裂内含子技术中，构建第一个含有能够产生功能性剪接供体位点(FSDS)的核苷酸序列(NS)和第二个能够产生功能性剪接受体位点(FSAS)的NS的反转录病毒载体；其中第一NS位于第二NS的下游并存在于反转录病毒载体的3’LTR(U3区)中的序列中，该序列因为反转录病毒载体的RNA形式反转录为整合入宿主细胞基因组的DNA形式而在5’LTR中复制。因为第一个能够产生FSDS的NS位于第二个能够产生FSAS的NS的下游，所以利用这些位点剪接将不在反转录病毒载体中进行。然而，在所述载体的反转录DNA形式如整合的原病毒中，则现在是所述第一NS位于第二NS的上游，由此产生功能性5’剪接供体-3’剪接受体对。因此，当从原病毒产生转录时，产生的RNA能够被剪接去除FSDS和FSAS之间的间插序列。根据从由原病毒产生的RNA转录物剪接的序列的性质，该方法具有几种用途。
可优选使用断裂内含子技术的优选实施方案涉及杂交载体系统(参见上文)。在该系统中，由第一病毒载体如腺病毒载体传递至第一靶细胞的反转录病毒基因组的布局使得所述第一NS位于第二NS下游。因此，不会发生采用第一NS作剪接供体和第二NS作剪接受体剪接掉第一NS和第二NS之间的序列，因为它们的方向错误。然而，第一靶细胞包装的病毒颗粒可以用来感染第二靶细胞。在第二靶细胞中，一般会发生反转录和病毒基因组的整合。这将产生功能性剪接供体/剪接受体布局，因为FSDS此后将位于5’LTR中，即FSAS的上游。然后发生剪接以去除FSDS和FSAS之间的序列。
见于原病毒的FSAS和FSDS之间的反转录病毒载体中的5’LTR和第二NS之间的核苷酸序列可以含有目的核酸序列(NOI)。所述NOI可以含有产生病毒颗粒必需的序列例如env或gagpol序列。因为NOI将从原病毒转录物剪接掉，所以原病毒将不能产生活病毒颗粒。这将例如允许构建含有编码病毒组分和目的基因产物如治疗性多肽的NOI腺病毒反转录病毒载体，它具有当在第一靶细胞中装配的病毒颗粒引入第二靶细胞时不能产生所述病毒组分的额外安全特征。
再一实施方案允许NOI在第二靶细胞中表达而不能在第一靶细胞中表达。在该实施方案的一个替代方法中，去除原病毒RNA转录物中FSDS和FSAS之间的间插序列使位于原病毒基因组中FSDS的5’调节序列邻近位于原病毒基因组中FSAS的3’的NOI的5’端，从而使所述调节序列现在操作性连接至NOI并可以指导从NOI转录，当所述间插序列存在时，所述调节序列不能操作性连接至NOI。尽管调节序列可以位于反转录病毒载体中的NOI的上游，但是在优选的实施方案中，调节序列位于反转录病毒载体中的3’LTR的U3区中的第一NS的上游，使其位于所述NOI的下游。所以，只有当反转录病毒RNA的反转录物在第二靶细胞中出现时，所述调节序列位于NOI的5’。
所以，总之，位于FSDS和FSAS之间(因此位于反转录病毒载体中的第二NS的上游)的NOI是通常从在第二靶细胞中的原病毒产生的病毒RNA转录物剪出的序列。所以这类NOI可以包括但不限于在第一细胞中装配反转录病毒颗粒所需要的反转录病毒序列。其中包括env序列、gagpol序列、编码必需辅助基因的序列和/或包装序列。因此位于原病毒基因组中的FSAS的下游(由此位于反转录病毒载体第二NS下游)通常包括但是一般不限于编码希望在第二靶细胞表达的基因产物如治疗产物的序列。
应该认识到的是，在腺病毒杂交系统方面，反转录病毒载体的参考物包括存在于第一腺病毒载体中的反转录基因组序列以及随后在第一靶细胞中产生后包装入病毒颗粒的RNA基因组。
如上所述，功能性剪接序列也需要发现于5’并邻近FSAS(因此邻近第二NS)的分支序列，所以应该存在合适的分支序列。还应该知道的是，构建断裂内含子需要现存功能性剪接供体位点的功能性失活，例如以防止在第一靶细胞转录的反转录病毒RNA基因组中剪接。通常采用标准技术可使GT二核苷酸共有序列突变例如突变为GC达到该要求。腺病毒腺病毒是一种双链线性DNA病毒，它不经过RNA中间体。根据所有显示可比较的遗传组织的基因序列同源性，将50种以上不同人血清型腺病毒分为6个亚群。人腺病毒C组血清型2和5(具有95％序列同源性)最常用于腺病毒载体系统中，通常与年轻人的上呼吸道感染相关。
本发明的腺病毒/腺病毒载体可以人来源或动物来源。关于人来源的腺病毒，优选的腺病毒为分类于C群尤其是2型(Ad2)、5型(Ad5)、7型(Ad7)或12型(Ad12)的腺病毒。更优选是Ad2或Ad5腺病毒。在动物来源的各种腺病毒中，可以应用犬腺病毒、小鼠腺病毒或鸟类腺病毒，诸如CELO病毒(Cotton等，1993)。关于动物腺病毒，优选应用犬来源的腺病毒尤其是CAV2腺病毒株[例如manhattan株或A26/61(ATCC VR-800)]。其它动物来源的腺病毒包括在申请WO-A-94/26914中引用的腺病毒，该文献通过引用结合到本文中。
如上所述，腺病毒基因组的结构在所有腺病毒群中是相似的，特定的功能一般位于所研究的每种血清型的相同位置。腺病毒基因组包括在每个末端反向重复序列(ITR)、包衣壳序列(Psi)、早期基因和晚期基因。主要早期基因已经分类为一系列的立即早期(E1a)、延迟早期(E1b、E2a、E2b、E3和E4)以及中间区(intermediate region)(参下图)。其中特别含有E1区的基因是病毒繁殖所必需的。主要的晚期基因包含在L1-L5区中。已经完全测序了Ad5腺病毒的基因组，并可数据库中获得(特别参见Genbank登记第M73260号)。同样，对其它腺病毒基因组的部分或全部(如Ad2、Ad7、Ad12)也已进行了测序。
为用作重组载体，通常对腺病毒进行修饰以使它不能在感染细胞复制。
因此，在现有技术中描述的构建物包括其中插入异源DNA序列、缺失病毒复制必需的E1区的腺病毒(Levrero等，1991；Gosh-Choudhury等，1986)。而且，为了改善载体的性质，已经提出腺病毒基因组中产生其它缺失或修饰。因此，已将热敏感性点突变引入ts125突变体，使失活72kDa DNA-结合蛋白(DBP)成为可能。用于本发明的重组腺病毒载体优选在其基因组的E1区中包括一个缺失。更准确地说，它在E1a和E1b区中包括一个缺失。按照特别优选的方式，E1区通过在Ad5腺病毒序列中缺失从核苷酸454至核苷酸3328的PvuII-BglII片段而失活(Genbank登记第M73260号)。在另一个优选的实施方案中，所述E1区通过缺失从核苷酸382至核苷酸3446的HinfII-Sau3A片段而失活。
其它腺病毒载体缺失病毒复制和/或繁殖必需的另一个区，即E4区。E4区参与调节晚期基因表达、稳定晚期核RNA、降低宿主细胞蛋白表达和参与有效复制病毒DNA。所以其中缺失E1区和E4区的腺病毒载体的病毒基因表达和转录背景噪音非常低。这类载体已描述于例如申请WO-A-94/28152、WO-Q-95/02697、WO-A-96/22378。此外，已经描述了携带修饰的IVa2基因的载体(WO-A-96/10088)。
按照优选的变异体，用于本发明的重组腺病毒载体另外在其基因组的E4区中具有缺失。更具体地说，E4区中的缺失影响所有可读框。作为准确的实例可以提及的缺失是核苷酸33466-35535或33093-35535。特别优选的载体包括整个E4区的缺失。这可以实现相当于核苷酸35835-32720的MaeII-MscI片段的缺失或切除。其它类型的E4区中的缺失描述于申请WO-A-95/02697和WO-A-96/22378，所述文献通过引用结合到本文中。
或者，缺失仅一个E4功能部分。该部分包括至少ORF3和ORF6框。作为实例，这些编码框可以分别以分别相当于核苷酸34801-34329和34115-33126的PvuII-AluI和BglII-PvuII片段形式从基因组缺失。在本发明的构架中也可以利用病毒Ad2 dl808和病毒Ad5 dl1004、Ad5dl1007、Ad5 dl1011或Ad5 dl1014的E4区的缺失。
以上给出的位置是指公开和可在数据库获得的野生型Ad5腺病毒序列。尽管较小的变异可以存在于不同腺病毒血清型之间，但是这些位置一般适用于由任何血清型，尤其是腺病毒Ad2和Ad7构建本发明的重组腺病毒。
此外，所产生的腺病毒可以在其基因组中具有其它变化。特别是可以缺失其它区以增加病毒的容量以及降低与病毒基因表达有关的副作用。因此，尤其可以缺失全部或部分的E3或IVa2区。然而关于E3区，特别优选保留编码gp19K蛋白的部分。该蛋白的确能够防止腺病毒载体成为免疫反应的对象，所述免疫反应(i)将限制其作用和(ii)可能具有不需要的副作用。根据具体方式，可缺失E3区，重新引入在异源启动子控制下的编码gp19K蛋白的序列。
本发明的多核苷酸/NOI可以插入所述重组基因组的不同位点。它可以插入作为所缺失或过剩序列的替代物的E1、E3或E4区。它也可以插入反式产生病毒所必需的序列以外的任何位点(ITR序列和包衣壳序列)。
因为E2区编码72kDa DNA结合蛋白、DNA聚合酶和引发启动DNA合成的蛋白需要的55kDa末端蛋白(TP)的80kDa前体，所以它是必需的。
制造缺陷更多的病毒的替代方法已经将所述病毒完全“去内脏”，仅保留病毒复制所需的末端重复序列。用第一代辅助病毒在293细胞系中使“去内脏的”或“无内脏的”病毒生长至高滴度。
重组腺病毒通常在包衣壳细胞系中产生，所述细胞系能够反式互补重组腺病毒基因组的一个或多个功能缺陷。其中一种细胞系例如为腺病毒基因组的一部分已经整合入其中的293细胞系。更准确地说，细胞系293是含有血清型5腺病毒(Ad5)基因组的左侧末端(约11-12％)的人肾脏胚胎细胞系，所述左侧末端包括左侧ITR、包衣壳区、包括E1a和E1b的E1区、编码蛋白pIX的区和编码蛋白pIVa2的区的部分。该细胞系能够反式互补E1区缺陷型(也就是说，缺乏全部或部分E1区)重组腺病毒，也就是说，缺乏全部或部分E1区和能够产生具有高滴度的病毒原种(stock)。该细胞系还能够在容许温度(32℃)下产生另外含有热敏感性E2突变的病毒原种。
已经描述了特别基于人肺癌细胞A549(WO-A-94/28152)或人成视网膜细胞(Hum.Gen.Ther.(1996)215)的其它能够互补E1区的细胞系。而且还描述了能够反式互补数种腺病毒功能的细胞系，例如互补E1和E4区的细胞系(Yeh等，1996a，b；Krougliak等，1995)和互补E1和E2区的细胞系(WO-A-94/28152，WO-A-95/02697，WO-A-95/27071)。
通常通过将病毒DNA引入包衣壳细胞系，然后在约2-3天后裂解细胞(腺病毒生活周期的动力学为24-36小时)，从而产生重组腺病毒。为了完成所述过程，所引入的病毒DNA可以是完整的重组病毒基因组，任选在细菌(WO-A-96/25506)或酵母(WO-A-95/03400)中构建，转染入所述细胞。它也可以是用来感染包衣壳细胞系的重组病毒。病毒DNA也可以以片段的形式引入，每个片段携带部分重组病毒基因组和一个同源区，所述同源区使其在引入包衣壳细胞后能够通过各个片段之间的同源重组重新构建重组病毒基因组。
可复制腺病毒也可以用于基因治疗。例如可将E1a基因插入在肿瘤特异性启动子调节下的第一代病毒。理论上，所述病毒感染入肿瘤后，它可以特异性在肿瘤中复制而不能在周围的正常细胞复制。该类型的载体可以用来直接通过裂解杀伤肿瘤细胞或用来传递“自杀基因”，例如在用丙氧鸟苷治疗后可以杀伤感染细胞和旁观者细胞的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSK tk)。
所述病毒基因也可以置于低氧效应调节元件的控制之下。杂种载体系统也可以应用杂种腺病毒/反转录病毒系统，由此使腺病毒的特征与反转录病毒基因组的遗传稳定性组合。这些杂种病毒载体利用腺病毒转导靶细胞，然后该靶细胞成为可以稳定感染相邻细胞的瞬时反转录病毒生产细胞。
本发明的杂种病毒载体系统包括包含一种或多种编码第二病毒载体的第一病毒载体，所述第一病毒载体能够感染第一靶细胞，并表达其中的所述第二病毒载体，所述第二载体能够转导第二靶细胞。
所以本发明的基因载体包括体外制备第一载体，该第一载体编码体内产生第二载体必需的基因。应用中，第二载体携带一个或多个选定的基因供插入第二靶细胞。所选定的基因可以是一种或多种标记基因和/或治疗基因(参见上文)。
第一病毒载体可以是各种不同的病毒载体例如反转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、疱疹病毒或痘病毒载体，或者在多第一病毒载体的情况下，它们可以是不同病毒来源的载体混合物。无论在何种情况下，所述第一病毒载体优选缺陷为它们不能独立复制。因此，它们能够进入靶细胞和传递第二载体序列，但是不能复制以进一步感染靶细胞。
在所述杂种病毒载体系统包括一个以上编码第二载体的第一载体的情况下，所有第一载体用来感染第一靶细胞群，通常为同时感染。优选具有单个编码所有第二病毒载体组分的第一病毒载体。
优选的单个或多个第一病毒载体为腺病毒载体。腺病毒载体在可以从体外培养物获得高滴度方面较其它病毒载体具有明显优势。与包膜病毒颗粒相比，腺病毒颗粒也相当稳定，所以更易于纯化和保藏。
所述第二病毒载体优选反转录病毒载体，更优选慢病毒载体。在第一靶细胞中表达装配必需基因和包装缺陷病毒载体颗粒产生第二载体。其缺陷为不能独立复制。因此，一旦第二反转录病毒载体转导第二靶细胞，就不能通过复制传播给其它靶细胞。
表达在第一载体DNA中编码的产生反转录病毒载体必需的基因可以产生第二载体。该类基因包括反转录病毒的gag-pol基因、包膜病毒的包膜基因和含有一个或多个治疗基因的缺陷型反转录病毒基因组。一般来说，缺陷型反转录病毒基因组包括使反转录能进行的序列，至少部分5’长末端重复序列(LTR)、至少部分3’LTR和包装信号。
重要的是，其中加入了一个或多个安全特征的第二载体对体内应用也是安全的，消除了重组产生能够独立复制的感染病毒的可能。
为了保证第二载体是复制缺陷的，它可由位于单个或两个以上的腺病毒或其它第二载体中的多个转录单位编码。因此，可以一个转录单位编码第二载体基因组、一个转录单位编码gag-pol以及一个转录单位编码env。或者可以组合两个以上的转录单位。例如编码gag-pol和env或env和基因组的核酸序列可以组合在一个转录单位中。其实施方法是本领域已知的。
本文所述的转录单位是含有编码序列和独立于任何其它编码序列、实现表达这些编码序列的信号的核酸区段。所以每个转录单位一般含有至少一个启动子、一个增强子和一个多腺苷酸信号。编码第二载体的转录单位的启动子和增强子最好在产生所述第二病毒载体的条件下，在所述第一靶细胞中有强活性，或能够被强诱导。所述启动子和/或增强子可以是组成型有效的，或其活性可以受组织限制或受时间限制。
以下描述可以加入到所述杂种病毒载体系统的安全特征。可以存在一种或多种这类特征。
首先，通过缺失同源区，可以避免编码所述第二载体组分的序列之间的序列同源性。同源区允许发生基因重组。在一个特定的实施方案中，用三种转录单位构建第二反转录病毒载体。第一转录单位含有在非反转录病毒启动子和增强子控制下的反转录病毒的gag-pol基因。第二转录单位含有在非反转录病毒启动子和增强子控制下的反转录病毒的env基因。第三转录单位包含在非反转录病毒启动子和增强子控制下的缺陷型反转录病毒基因组。在天然的反转录病毒基因组中，包装信号的位置使得正确起作用需要部分gag序列。通常，当因此构建反转录病毒载体系统时，包括部分gag基因在内的包装信号仍在所述载体基因组中。然而，在本发明的情况下，所述缺陷型反转录病毒基因组含有基本包装信号，它不包含与所述第一转录单位中的gag序列同源的序列。同样，在反转录病毒中，例如在莫洛尼鼠类白血病病毒(MMLV)中，在pol编码序列3’端和env5’端之间有重叠小区。通过改变或者pol编码序列3’端或者env 5’端的序列，以改变密码子用法，而不改变所编码蛋白的氨基酸序列，可以去除所述第一和第二转录单位之间的相应的同源性区域。
其次，通过用另一反转录病毒或另一有包膜病毒的包膜蛋白将一种反转录病毒的基因组假型化，使得避免env组分和gag-pol组分之间的同源区，可以避免产生有复制能力的第二病毒载体的可能性。在一个具体实施方案中，由以下三种组分构建所述反转录病毒载体第一转录单位含有非反转录病毒启动子和增强子控制下的反转录病毒的gag-pol基因。第二转录单位含有在非反转录病毒启动子和增强子控制下的另一可选包膜病毒的env基因。第三转录单位包含在非反转录病毒启动子和增强子控制下的缺陷型反转录病毒基因组。所述缺陷型反转录病毒基因组含有基本包装信号，它不含有与所述第一转录单位中的gag序列同源的序列。
假型化涉及例如基于慢病毒如HIV或马传染性贫血病毒(EIAV)的反转录病毒基因组，所述包膜蛋白可以是例如称为4070A的兼嗜性包膜蛋白。或者，反转录病毒基因组可以以MMLV为基础，包膜蛋白可以是例如在第一靶细胞中以非毒性量产生的得自另一病毒的蛋白，例如流感病毒的血细胞凝集素或水疱性口炎病毒的G蛋白。在另一替代方法中，所述包膜蛋白可以是修饰的包膜蛋白如突变的或工程包膜蛋白。可以制备或选择修饰以引入靶向能力或减少毒性或用于另一目的。
第三，通过采用以特定方式构建的两种转录单位，可以消除有复制能力的反转录病毒的可能性。第一转录单位含有在第一靶细胞中有活性的启动子-增强子(诸如hCMV启动子-增强子或组织限制启动子-增强子)控制下的gag-pol编码区。第二转录单位编码能够被包装入反转录病毒颗粒中的反转录病毒基因组RNA。第二转录单位含有包装、整合和反转录所必需的反转录病毒序列，也含有包膜病毒的env蛋白编码序列和一种或多种治疗基因的编码序列。
在优选实施方案中，按照杂种病毒载体系统包括编码反转录病毒第二载体的单个或多个腺病毒第一载体。用于本发明的腺病毒载体可以衍生自人腺病毒或一般不感染人类的腺病毒。所述载体优选衍生自2型腺病毒或5型腺病毒(Ad2或Ad5)或小鼠腺病毒或禽类腺病毒如CELO病毒。所述载体可以是有复制能力的腺病毒载体，但是更优选缺陷型腺病毒载体。腺病毒载体可以通过缺失一个或多个病毒复制所必需的组分而获得缺陷性。每个腺病毒载体一般在E1区中含有至少一个缺失。为产生传染性腺病毒载体颗粒，通过在人胚胎成纤维细胞系如人293细胞系传代所述病毒，从而补偿该缺失，所述细胞系含有包括E1基因的完整拷贝的Ad5左侧部分。异源DNA插入该类载体的容量可以高达约7kb。所以，该类载体可用于构建本发明的系统，该系统包括三个独立重组载体，每个载体含有一个构建反转录病毒第二载体的必需转录单位。
在其它腺病毒基因中含有其它缺失的替代腺病毒载体是本领域已知的，该类载体也适用于本发明。几种该类第二代腺病毒载体颗粒显示免疫原性降低(例如E1+E2缺失Gorziglia等，1996；E1+E4缺失Yeh等，1996)。延长缺失用来提供将多基因引入载体的额外克隆能力。例如以描述了25kb缺失(Lieber等，1996)和报道了缺失所有病毒基因的克隆载体(Fisher等，1996)，所述载体将允许引入35kb以上异源DNA。这类载体可以用来产生按照本发明的腺病毒第一载体，它编码用于构建反转录病毒第二载体的2-3个转录单位。
所描述的本发明的优选实施方案解决一个与腺病毒载体和其它病毒载体有关的一个主要问题，即来自这类载体的基因表达是瞬时的。由第一靶细胞产生的反转录病毒颗粒可以转导第二靶细胞，在所述第二靶细胞中的基因表达稳定地保持，因为所述反转录病毒载体基因组整合入宿主细胞基因组中。所述第二靶细胞不表达大量的病毒蛋白抗原，因此免疫原性低于用腺病毒载体转导的细胞。
用反转录病毒载体作为所述第二载体是有利的，因为它例如通过允许导向快速分裂细胞，而允许一定程度的细胞辨别。此外，反转录病毒的整合允许在靶组织中稳定表达治疗基因，包括在增殖性靶细胞中的稳定表达。
优选的是，所述第一病毒载体优先感染某种或某些细胞类型。所述第一载体更优选为定向载体，也就是说它与天然病毒相比组织嗜性改变，使得所述载体导向特定的细胞。术语“定向载体”不一定与术语“靶细胞”有关。“靶细胞”就是指是天然或定向载体能够转染或转导的细胞。
用于按照本发明的载体系统的第一靶细胞包括造血细胞(包括单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、粒细胞或任何这些细胞的祖细胞)；内皮细胞；肿瘤细胞；基质细胞；星形胶质细胞或神经胶质细胞；肌细胞；和上皮细胞。
因此，能够产生所述第二病毒载体的按照本发明的第一靶细胞可以是上述细胞类型中的任何一种。在一个优选的实施方案中，按照本发明的第一靶细胞是用一种缺陷型腺病毒载体转导的单核细胞或巨噬细胞，所述缺陷型腺病毒载体含有用于反转录病毒gag-pol的第一转录单位和能够产生可包装缺陷型反转录病毒基因组的第二转录单位。在这种情况下，所述第二转录单位最好处于在机体内患病位置中优先有活性的启动子-增强子的控制之下，其中所述患病位置诸如局部缺血位点或实体瘤的微环境。在本发明这方面一个特别优选的实施方案中，构建所述第二转录单位，使得将所述基因组插入所述第二靶细胞中时，产生一个内含子，它用来降低病毒env基因的表达，并允许有效表达治疗基因。
所述第二病毒载体也可以是定向载体。对于反转录病毒载体，这可以通过修饰所述包膜蛋白来完成。所述反转录病毒第二载体的包膜蛋白需要是无毒的包膜或可以以无毒量在所述第一靶细胞中生产的包膜，诸如MMLV兼嗜性包膜或修饰的兼嗜性包膜。在这种情况下，所述安全特征最好是缺失反转录病毒组分之间的区域或序列同源性。
所述第二靶细胞群体可以与所述第一靶细胞群体相同。例如，将本发明的第一载体传递至肿瘤细胞，导致可以转导其它肿瘤细胞的其它载体颗粒的复制和产生。或者，所述第二靶细胞群体可以不同于所述第一靶细胞群体。在这种情况下，所述第一靶细胞用作被治疗个体机体内的内源工厂，产生可以转导所述第二靶细胞群体的另外的载体颗粒。例如，所述第一靶细胞群体可以是用所述第一载体体内或活体外转导的造血细胞。然后，将所述第一靶细胞传递至或迁移至机体内诸如肿瘤的位点，并产生能够转导例如实体瘤中有丝分裂活性的肿瘤细胞的所述第二载体颗粒。
本发明允许在随后有效转导第二靶细胞所需的一种或多种治疗蛋白的作用位点或其附近，体内定位产生高滴度的缺陷型反转录病毒载体颗粒。这比或者采用缺陷型腺病毒载体或者采用单独的缺陷型反转录病毒载体更有效。
本发明也允许体内在非分裂细胞或缓慢分裂的细胞中产生诸如基于MMLV的载体的反转录病毒载体。先前仅有可能在诸如体外增殖的适应于组织培养的细胞的快速分裂的细胞中，或在体内的快速分裂的肿瘤细胞中，产生基于MMLV的反转录病毒载体。对于将基因传递至实体瘤的细胞(其中许多实体瘤细胞分裂缓慢)而言，以及对于应用非分裂细胞(诸如内皮细胞)和各种造血谱系细胞作为生产治疗蛋白产物的内源工厂而言，扩展能够产生反转录病毒载体的细胞类型的范围是有利的。启动子/增强子诱导或调节是指可以优先激活表达，例如在对细胞外信号的应答中可以改变表达。组成型表达是指以大致恒定的量产生；与调节表达相反。例如没有外部刺激的条件下，发生连续发生的组成型表达。
在载体中的本发明核酸优选操作性连接至能够在靶细胞中引起所述融合蛋白优先表达的表达控制序列。表达控制序列可以是例如在包括靶细胞的某些细胞类型中优先具有活性的启动子或增强子、在某些条件如低氧条件下优先具有活性的启动子或增强子。能够在低氧条件下引起优先表达的表达控制序列被称为低氧效应元件(Dachs等，1997 Nature Medicine 3，515)。
所述核酸可以处于启动子控制之下，所述启动子只有在巨噬细胞进入肿瘤时被低氧特异性激活。这有助于局部传递前体药物活化酶。本发明的该方面特别适用于这些前体药物如Tirapazamine，RSU1069，E09和丝裂霉素C，这些前体药物本身在例如优先存在于肿瘤的低氧情况下被显著活化。
所述核酸可以在表达调节元件的表达控制之下，通常在启动子或启动子和增强子的控制之下。所述增强子和/或启动子可以优先在低氧或局部缺血或低葡萄糖环境中有活性，使得所述核酸优先在特定的目的组织中表达，诸如在肿瘤环境、关节炎关节或其它局部缺血部位中表达。因此，可以减轻或消除对待治疗个体的任何显著生物效应或有害效应。增强子元件或赋予受调节表达的其它元件可以以多拷贝存在。同样，或另外，所述增强子和/或启动子可以优先在一种或多种特定的细胞类型中有活性，诸如巨噬细胞、内皮细胞或它们的组合中的任何一种或多种中有活性。其它实例包括呼吸道上皮细胞、肝细胞、肌细胞、心肌细胞、滑膜细胞(synoviocyte)、初级乳房上皮细胞(primary mammary epithelial cess)和有丝分裂后终末分化的非复制细胞，诸如巨噬细胞、神经元。
术语“启动子”以本领域正常的含义使用，例如为Jacob-Monod基因表达理论中的RNA聚合酶结合位点。
术语“增强子”包括结合于转录起始复合物的其它蛋白组分并由此促进由其相关启动子指导的转录起始的DNA序列。
本发明的启动子最好是组织特异性的。也就是说，它们能够驱动核酸在一种组织中转录，而在其它组织类型中主要保持“沉默”。
术语“组织特异性的”是指这样一种启动子，其活性不限于单一组织类型，但它们仍然显示选择性，因为它们在一类组织中可以有活性，而在另一类组织中活性较低或沉默。本发明启动子的所希望的特征是，它们在缺乏激活的低氧调节增强子元件的情况下，甚至在靶组织中，其具有的活性也相对低。达到这一点的一种方法是使用“沉默子”元件，它们在不存在低氧的情况下抑制选定启动子的活性。
许多上述组织特异性启动子可能在实施本发明中特别有利。在大多数情况下，这些启动子可以作为方便的适用于克隆入选定载体中的限制性消化片段来分离。或者，可以用聚合酶链式反应分离启动子片段。通过于引物的5’端加入限制性位点，可以便于扩增片段的克隆。
适用于心脏特异性表达的启动子包括来自鼠类心脏α-肌球蛋白重链(MHC)基因的启动子。合适的血管内皮特异性启动子包括Et-1启动子和von Willebrand因子启动子。
前列腺特异性启动子包括人腺激肽释放酶1(hKLK2)基因和前列腺特异性抗原(hKLK3)的5’侧翼区。
细胞特异性的启动子/增强子的实例包括巨噬细胞特异性启动子或增强子，诸如CSF-1启动子-增强子、或来自甘露糖受体基因启动子-增强子的元件(Rouleux等1994 Exp Cell Res 214113-119)。或者，可以使用在嗜中性粒细胞中优先有活性的启动子或增强子元件或淋巴细胞特异性增强子，诸如IL-2基因增强子。
通过存在一种或多种低氧效应增强子(HRE)元件，诱导在低氧条件下治疗基因提高的表达。RHE元件含有可以位于所述启动子和/或治疗基因上游(5’)或下游(3’)的多核苷酸序列。HRE增强子元件(HREE)通常为反式作用元件，通常长约10-300bp，它作用于启动子，以增加所述启动子控制下的基因的转录。最好是，选择所述启动子和增强子元件，使得由这些元件调节的基因的表达在存在正常供应氧的情况下最小，而在低氧或缺氧条件下向上调节。
术语“低氧”是指特定器官或组织接受的氧供应不足的情况。
低氧效应元件也可以选自例如红细胞生成素HRE元件(HREE1)、肌肉丙酮酸激酶(PKM)、HRE元件、B-烯醇化酶(烯醇化酶3；ENO3)HRE元件、内皮缩血管肽-1(ET-1)HRE元件和金属硫蛋白II(MTII)HRE元件。
低氧调节增强子的再一实例是转录因子HIF-1的结合元件(Dachs等1997 Nature Med 5515；Wang和Sememnza 1993 Proc Natl Acad SciUSA 904304；Firth等1994 Proc Natl Acad Sci USA 916496)。也发现低氧效应增强子元件与许多基因相连，包括红细胞生成素(EPO)基因(Madan等1993 Proc Natl Acad Sci 903928；Semenza和Wang 1992Mol Cell Biol 1992 125447-5454)。已经从肌肉糖酵解酶丙酮酸激酶(PKM)基因(Takenaka等1989 J Biol Chem 2642363-2367)、人肌肉特异性β-烯醇化酶基因(ENO3；Peshavaria和Day 1991 Biochem J 275427-433)和内皮缩血管肽-1(ET-1)基因(Inoue等1989 J Biol Chem 26414954-14959)中均分离出其它HREE。
当所述酶性活化结构域由巨噬细胞表达时，所述启动子和/或增强子应该是组成型有效。组成型启动子如巨细胞病毒(CMV)的实例是本领域已知的，可以使用其中任何一种。一种优选的启动子-增强子组合是人巨细胞病毒(hCMV)主要立即早期(MIE)启动子/增强子组合。我们发现工程表达前体药物活化酶如P450的巨噬细胞在例如治疗癌症中组成性产生特别优良的结果。这是特别令人惊奇的。宿主细胞和靶细胞本发明的多核苷酸构建物、核酸载体和病毒载体可以引入各种宿主细胞。宿主细胞包括原核细胞如细菌和真核细胞如酵母和高级真核细胞(例如昆虫细胞、哺乳动物细胞如人细胞)。宿主细胞可以用来繁殖非病毒和病毒载体，以例如制备含有本发明多核苷酸的核酸载体或制备高滴度病毒原种。
或者，含有本发明多核苷酸序列/NOI的宿主细胞可用于治疗，例如将以下讨论的巨噬细胞用于如体外治疗。
通常采用本领域技术人员熟知的技术如转化或转染将非病毒核酸和病毒载体引入宿主细胞。病毒载体也可以通过转染引入宿主细胞。
本发明的靶细胞是指通常需要治疗的生物体的细胞或得自所述生物的细胞而不是简单的细胞系。可以从所述生物体取出靶细胞，经处理后再输回或体内靶向。因此可以认为例如体内的肿瘤细胞是靶细胞。
靶细胞的实例包括肿瘤细胞(参见下文的肿瘤一览表)，尤其是低氧条件下的肿瘤细胞。所述靶细胞可以是能够经历细胞分裂的生长停滞的细胞，诸如肿瘤块中心部分的细胞或诸如HSC的干细胞或CD34+细胞。作为另一种选择，靶细胞可以是分化细胞前体，诸如单核细胞前体、CD33+细胞或粒细胞前体。所述靶细胞也可以是分化细胞，诸如神经元、星形胶质细胞、神经胶质细胞、小胶质细胞、巨噬细胞、单核细胞、上皮细胞、内皮细胞或肝细胞。可以在从人类个体分离后在体外转柒或转导靶细胞，或者可以直接在体内转染或转导靶细胞。
优选的宿主细胞/靶细胞包括其中表达EPAS的细胞，更优选其中表达EPAS但是不表达HIF-1(或非常低水平的表达)的细胞。
在特别优选的实施方案中，造血干细胞如巨噬细胞用作宿主细胞/靶细胞。如上所述，HSC是在哺乳动物产生所有血细胞谱系的多能干细胞。在诸如细胞-细胞的相互作用和存在可溶性细胞因子的微环境因素影响下，HSC分化为各种细胞谱系。由HSC产生四种主要的细胞谱系。这些谱系包括红细胞类谱系(红细胞)；巨核细胞谱系(血小板)；骨髓谱系(粒细胞和单核细胞)；和淋巴谱系(淋巴细胞)。特别是，骨髓谱系和淋巴谱系对于免疫系统的功能是关键性的。在组织特异性蛋白调节物网络的影响下，发生这些细胞的成熟，其中已经给出所述调节物许多名称，包括生长因子、细胞因子和白介素。
已将得自血流单核细胞的巨噬细胞的细胞作为传递载体，以将药物和治疗基因导向实体瘤。已经证实，巨噬细胞持续进入实体瘤，并在乳腺癌中血管形成差的局部缺血部位集聚。此外，在这些肿瘤中局部缺血诱导的坏死程度与肿瘤内巨噬细胞浸润的程度正相关。
单核细胞和巨噬细胞也浸润局部缺血损害，这是包括以下疾病在内的其它疾病状态的特征脑型疟、冠心病和类风湿性关节炎。因此单核细胞和巨噬细胞是适用于本发明的宿主细胞。尤其是含有本发明多核苷酸和/或载体如病毒载体的单核细胞和/或巨噬细胞适用于体外和体内法治疗与低氧有关的疾病。
分离HSC及其在培养物中维持和分化的方法在本领域(Santiago-Schwartz等，1992；Charbord等，1996；Dao等，1997；Piacibello等，1997)和WO-A-91/09938中可知。也报道了反转录病毒基因在一般意义上传递入HSC中(Duphar和Emmons，1994)。Dunbar等，1996也描述了反转录病毒介导的HSC转导并传递给患者的方法。
体内鼠类研究已经表明，在收获骨髓之前用5-氟尿嘧啶预处理供体小鼠，可以通过诱导原始细胞的循环并提高对反转录病毒感染和整合的敏感性，提高转导效率。靶细胞与反转录病毒产生细胞系的协同培养并利用能够每ml产生至少105病毒颗粒的细胞系，也已经提高了效率(Bodine等，1991)。事实上，在用1-50％或更多的携带原病毒基因组的细胞重建多个造血谱系的所有受体小鼠中，已经将基因成功转移入长期种群恢复细胞中(Fraser等，1990)。
当本发明使用体内传递核酸序列至HSC的载体时，所述载体最好是能够导向CD34+HSC的定向载体。
术语“定向载体”是指感染/转染细胞或在靶细胞中表达的能力限于宿主生物中某些细胞类型的载体，所述细胞类型通常是具有共同表型或相似表型的细胞。定向载体的一个实例是具有基因修饰包膜蛋白的定向反转录病毒载体，所述包膜蛋白结合于仅在宿主生物数目有限的细胞类型中发现的细胞表面分子。定向载体的另一个实例是含有仅允许一种或多种反转录病毒转录物在宿主生物一部分细胞类型中表达的启动子/增强子元件的载体。因此，可以为所述载体提供CD34特异性的配体，诸如导向CD34的抗体或免疫球蛋白样分子。当引入被治疗个体中时，这种载体将特异性地转染CD34+HSC。所述载体可以系统给予至外周循环。治疗用途相信本发明具有广泛的治疗适用性-取决于特别是选择的一种或多种NOI、前体药物活化结构域和/或前体药物。另外，或在替代方法中，本发明可以用于治疗WO-A-98/09985中所列的疾病。为了易于参考，现在提供部分该表巨噬细胞抑制活性和/或T细胞抑制活性和由此的抗炎活性；抗免疫活性，即对细胞免疫应答和/或体液免疫应答的抑制效应，包括与炎症不相关的应答；抑制巨噬细胞和T细胞附着于细胞外基质组分和纤连蛋白的能力，以及向上调节T细胞中fas受体的表达；抑制不想要的免疫反应和炎症，包括关节炎，包括类风湿性关节炎、与过敏性相关的炎症、变态反应、哮喘、系统性红斑狼疮、胶原疾病和其它自身免疫病、与动脉粥样硬化相关的炎症、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化性心脏病、再灌注损伤、心博停止、心肌梗塞、血管炎症疾病、呼吸窘迫综合征或其它心肺疾病、与消化性溃疡、溃疡性结肠炎和其它胃肠道疾病相关的炎症、肝纤维变性、肝硬变或其它肝病、甲状腺炎或其它腺体疾病、肾小球性肾炎或其它肾病和泌尿学疾病、耳炎或其它耳鼻咽疾病、皮炎或其它皮肤病、牙周病或其它牙病、睾丸炎或附睾炎(epididimo-orchitis)、不育症、睾丸创伤或其它免疫相关的睾丸疾病、胎盘功能障碍、胎盘机能不全、习惯性流产、子痫、先兆子痫和其它免疫和/或炎症相关的妇科疾病、后色素层炎、中色素层炎、前色素层炎、结膜炎、脉络膜视网膜炎、眼色素层视网膜炎(uveoretinitis)、视神经炎、眼内炎症例如视网膜炎或囊性斑状水肿(cystoid macular oedema)、交感性眼炎、巩膜炎、色素性视网膜炎、退行性fondus病的免疫和炎性组分、眼外伤的炎性组分、由感染引起的眼炎、增生性玻璃体-视网膜病(vitreo-retinopathy)、急性局部缺血性视神经病、例如在青光眼过滤手术后的过度瘢痕形成、针对眼植入物的免疫和/或炎性反应以及其它免疫和炎症相关的眼病、与自身免疫病相关的炎症或在中枢神经系统(CNS)或任何其它器官中免疫和/或炎症抑制将为有益的病症或障碍、Parkinson病、由治疗Parkinson病引起的并发症/或副作用、AIDS相关的痴呆综合征HIV相关的脑病、Devic病、Sydenham舞蹈病、早老性痴呆和CNS的其它退行性疾病、病症或障碍、中风的炎性组分、小儿麻痹后综合征、精神障碍的免疫和炎性组分、脊髓炎、脑炎、亚急性硬化性全脑炎、脑脊髓炎、急性神经病、亚急性神经病、慢性神经病、Guillaim-Barre综合征、Sydenham舞蹈病、重症肌无力、脑假肿瘤、Down综合征、Huntington病、肌萎缩性侧索硬化、CNS压迫或CNS外伤或CNS感染的炎性组分、肌肉萎缩和营养不良的炎性组分、以及中枢神经系统和外周神经系统的免疫和炎症相关的疾病、病症或障碍、外伤后炎症、脓毒性休克、传染病、手术的炎症并发症或副作用、骨髓移植或其它移植并发症和/或副作用、例如由于感染病毒载体引起的基因治疗的炎症和/或免疫并发症和副作用、与AIDS相关的炎症、为了遏止或抑制体液和/或细胞免疫应答、为了通过减少单核细胞或淋巴细胞的量来治疗或减轻单核细胞或白血病增生性疾病例如白血病、在移植天然或人工细胞、组织或器官(诸如角膜、骨髓、器官、晶状体、起博器、天然或人工皮肤组织)的情况下用于预防和/或治疗移植排斥。
尤其是本发明的多核苷酸、核酸载体、病毒载体和宿主细胞可用于治疗肿瘤。可以用本发明治疗的肿瘤实例包括但不限于包括成骨性肉瘤和软组织肉瘤的肉瘤；诸如乳腺癌、肺癌、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、子宫癌和卵巢癌的癌症；包括Hodgkin和非Hodgkin淋巴瘤在内的淋巴瘤；成神经细胞瘤；黑素瘤；骨髓瘤；Wilms肿瘤；和白血病，包括急性成淋巴细胞型白血病和急性成髓细胞型白血病；神经胶质瘤和成视网膜细胞瘤。
本发明特别有利的特征核酸序列可以在低氧细胞中表达，而不在正常氧条件下的细胞中表达。因此本发明的核酸序列、核酸载体、病毒载体和宿主细胞可用于临床治疗各种特征为低氧的病症。特征为低氧症状的病症的实例包括中风、深部静脉血栓形成、肺部栓塞和肾衰竭。称为心肌梗塞的心脏组织的细胞死亡主要是因为由局部缺血和/或局部缺血后再灌注引起的组织损害。其它实例包括脑型疟和类风湿性关节炎。
特别优选将本发明的核酸序列、核酸载体、病毒载体和宿主细胞用于临床治疗实体瘤如卵巢肿瘤，尤其是包含低氧状态的肿瘤细胞的肿瘤。治疗可以达到肿瘤生长速率降低、肿瘤生长速率的停滞或真正的肿瘤块的缩小而不一定引起患者的所有恶性肿瘤细胞的完全编程性细胞死亡/坏死性死亡。
本发明的核酸序列、核酸载体、病毒载体和宿主细胞也可用于治疗预防性药物。因此，用于本发明的前体药物可以通过预防实现治疗效应。例如，当诊断出发生癌症的风险增加时，本发明可以用来为风险个体进行疫苗接种。
用于预防的适用性可以以对癌症的遗传素因为依据，例如因为BRCA-1基因、BRAC-2基因(Cornelisse等，1996)或另一相关基因中的一个或多个突变而发生的乳腺癌或卵巢癌。给药方法所以，本发明的核酸序列、核酸载体、病毒载体和宿主细胞可以用来将治疗基因传递给需要治疗的人或动物。
本发明的核苷酸序列可以以裸核酸构建物直接给予，还优选含有与宿主细胞基因组同源的侧翼序列。包括生物发射转化和脂质转染的数种已知技术可增强哺乳动物细胞摄取裸核酸构建物。或者，所述核酸序列可以作为包括质粒载体或病毒载体、优选慢病毒载体的核酸载体的一部分给予。
优选所述载体(即裸核酸构建物或例如包含所述多核苷酸的病毒载体)与药学上可接受的载体或稀释剂组合以产生药用组合物。所以，本发明也提供通过基因治疗治疗个体的药用组合物，其中所述组合物包含治疗有效量的本发明的核酸序列、载体或病毒载体以及药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或辅助剂，所述序列或载体包含一种或多种可传递的治疗性和/或诊断性NOI或由其产生或得自其的病毒颗粒。所述药用组合物可以用于人类或动物用途。
药用载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据计划的给药途径和标准药学实践来选择。合适的载体和稀释剂包括等渗性盐溶液，例如磷酸盐缓冲液。所述药用组合物可以包含作为载体、赋形剂或稀释剂的或除此之外的任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂和可以辅助或增加病毒进入靶位点的其它载体剂(诸如脂质传递系统)。
可以配制胃肠外、肌内、静脉内、颅内、皮下、眼内或经皮给予的药物组合物。
所述药用组合物可以适当地通过以下任何一种或多种方式给予吸入；栓剂或阴道栓剂形式；外用洗剂、溶液剂、乳膏、软膏或撒布粉剂(dusting powder)形式；通过使用皮肤贴剂；口服，为含赋形剂(诸如淀粉或乳糖)的片剂形式、或单独的或结合赋形剂的胶囊或ovule形式、或含调味剂或着色剂的酏剂、溶液剂或悬浮液形式；或它们可以胃肠外注射，例如阴茎海绵体内、静脉内、肌内或皮下注射。对于胃肠外给药，所述组合物最好以无菌水溶液形式使用，所述水溶液可以含有其它物质，例如足够的盐或单糖，以使得溶液与血液等渗。对于颊或舌下给药，所述组合物可以以用常规方法配制的片剂或锭剂给予。
所述药用组合物以含有用于基因治疗的治疗基因的核酸序列/载体可以掺入合适区域的细胞的方式给予。
在该组合物中的活性成分含量为所述制剂的约0.1％-99％(重量)。“药学上可接受的”是指所述成分必须与组合物的其它成分匹配以及是患者生理上可接受的。
采用易于获得的药学或兽医设备，以常规方式配制本发明用途的药用组合物。因此，所述活性成分或者单独或者任选与其它活性物质一起和一种或多种常规载体、稀释剂和/或赋形剂掺入产生常规格林(galenic)制剂如片剂、丸剂、散剂、锭剂、小囊剂、扁囊剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气雾剂、软明胶胶囊剂和硬明胶胶囊剂、栓剂、无菌注射液、无菌包装散剂等。
合适载体、赋形剂和稀释剂的实例有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、aglinates、黄芪胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水糖浆水、水/乙醇、水/乙二醇、水/聚乙烯、乙二醇、丙二醇、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油或脂肪物质如硬脂或它们的合适混合物。所述组合物还可以含有润滑剂、湿润剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、甜味剂、调味剂等。采用本领域公知的方法配制所述制剂以在给予患者后快速释放、缓慢释放或延迟释放活性成分。
所述组合物优选以单位剂型配制，例如每单位剂型含有约0.1-500mg活性成分。
活性成分的准确剂量和治疗疗程取决于许多因素，包括患者的年龄和体重、待治疗的具体病症和其严重程度、以及给予途径。一般来说，有效剂量每天每公斤体重约0.01-20mg，例如每天约0.05-10mg/kg，每天给予一次或多次。所以，成人的合适剂量为每天10-100mg，例如每天20-50mg。
给药方法可以是本领域已知的任何合适方法，包括例如口服、胃肠外(例如肌内、皮下、腹膜内或静脉内)、直肠或局部给药。
当用本发明的病毒载体将本发明的核酸序列传递至细胞时，所给予的病毒量为103-1010pfu、优选为105-108pfu、更优选106-107pfu。当注射时，通常给予1-10ml在药学上可接受的合适载体或稀释剂中的病毒。
当所述核酸序列/载体以裸核酸给予时，所给予的核酸量通常为1μg-10mg，优选100μg-1mg。
当NOI处于诱导型调节序列控制下时，仅需要其在治疗期间诱导基因表达。一旦治疗完成，去除诱导物，停止表达NOI。这具有明显的临床优势。该系统例如可以涉及例如给予抗生素四环素，以通过其对tet阻抑物/VP16融合蛋白的作用激活基因表达。另一系统包括应用去铁敏诱导HRE。
采用本发明的多核苷酸/载体时，应用组织特异性启动子有助于治疗疾病。例如几种神经性疾病是特定基因产物在唯一的一小亚群细胞异常表达引起的。只能在相关的受影响细胞类型中表达治疗基因是有利的，尤其是当这类基因在其它细胞类型中表达时具有毒性时。
将本发明的修饰HSC以合适的制剂给予患者或有风险的个体。所述制剂可以包含等渗盐水溶液、缓冲盐溶液或组织培养基。通过大剂量注射或通过静脉内输注给予所述细胞，或将所述细胞直接给予肿瘤部位或给予骨髓，其浓度例如为约106到大约1012细胞/剂，优选至少为108或1010细胞/剂。
首先处理所述个体，以耗尽骨髓干细胞，或用一种或多种诸如G-CSF的细胞因子进行处理，以增加干细胞移动到外周血中，或用一种或多种细胞因子治疗，以增强骨髓的种群恢复。也设想了这类处理的组合。本发明的疗法可以与目前可利用的抗癌疗法联合。
在用于干细胞工程的载体编码前体药物活化酶的情况下，癌症患者另外用相应的前体药物治疗，按照本领域已知的原理，采用适当的方案给药。
当从待治疗个体中取出HSC并用所述载体体外转染或转导时，在引入一种或多种所述NOI之前或之后，将所述细胞一般在培养物中扩增。当在合适的条件下体外培养时，或在体内接受合适的信号时，HSC具有能力分化为内皮细胞、骨髓样细胞、树突细胞和免疫效应细胞的其它细胞类型，其中所述免疫效应诸如嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核巨噬细胞和NK细胞。
这涉及应用组织培养法，所述方法是本领域已知的，包括暴露于细胞因子和/或生长因子以维持HSC(Santiago-Schwartz等，1992；Charbord等1996；Dao等，1997；Piacibello等，1997)。也可以加入诱导HSC分化的药物。
除对低氧应答外，已知所述HRE元件对模拟低氧的化学诱导物应答。其中两种这些诱导物是已知的，它们是氯化钴和去铁敏(Meliillo等，1996；Wang和Semenza 1993b)。因此，其中采用HRE的本发明制品可以用来治疗给与模拟低氧的化合物的疾病，例如使用化学激活物去铁敏或类似的化学物质)治疗成神经细胞瘤(Blatt，1994)、β地中海贫血(Giardina和Grady，1995)、早老性痴呆(Crapper等，1991、VEGF缺乏(Beerrepoot等，1996)、红细胞生成素缺乏(Wang和Semenza1993b)和用以增强肿瘤化疗(Voest等，1993)。本发明制品可以与模拟低氧的化合物同时、序贯或独立给予。
所述给予途径和剂量仅供参考，因为熟练的执业医师能够容易地确定任何具体患者和病情的最佳给予途径和剂量。
用于预防的适用性可以以对癌症的遗传素因为依据，例如因为BRCA-1基因、BRAC-2基因(Cornelisse等，1996 Pathol Res Pract 192684-693)或另一相关基因中的一个或多个突变而发生的乳腺癌或卵巢癌。
目前认为可能重要的是确定其中具体制品是安全和有效的患者。这是基于在不同个体的遗传变异可能引起药物效应的变化的认识。
所以，本发明提供测试个体DNA在药物代谢酶中的多态性，如果合适然后给予本发明前体药物活化剂的方法。
根据本发明，可以使用本领域技术人员水平内的标准分子生物学技术。这类技术在文献中进行了全面地描述。参见例如Sambrook等(1989)Molecular Cloninga laboratory manual；Hames和Glover(1985-1997)DNA Cloninga practical approach，第1-IV卷(第2版)；在McCafferty等(1996)“Antibody EngineeringA Practical Approach”中给出了免疫球蛋白基因的工程方法。
应该理解的是，以上所述的本发明各个部分、方面和实施方案的特征一般同样适用于其它部分、方面和实施方案mutatis mutandis。
现在参照以下非限制性实例进一步详细描述本发明尽管在基因治疗中以采用人NADPH细胞色素c还原酶为例说明本发明，但是它适用于得自任何物种的任何P450还原酶并可以用蛋白工程方法进行改进以提高酶活性，以及适用于任何其它天然、遗传工程或合成前体药物活化酶，例如DT-二磷酸酶、胸苷激酶、大肠杆菌硝基还原酶和羧肽酶G2。实施例1将核靶向肽加入P450R。[图7.1]通过采用重组DNA技术领域一般技术人员了解的标准方法制备杂种DNA，从而制备肽或蛋白融合物。例如按文献中所述方法，例如Sambrook等(1989)Molecular Cloninga laboratory Approach；Hames和Glover(1985-1997)DNA Cloninga practical approach，第1-IV卷(第2版)。将杂合基因插入合适载体以传递至哺乳动物细胞。可应用许多类型的载体，对它们已经进行了详细描述(例如Lever和Goodfellow 1995，Brit.Med.Bull.51，Number 1，基因治疗)并为一般技术人员所知。例如为了生产能够表达在该实施例和以下实施例中所述的前体药物活化酶的反转录病毒载体，将相关的编码区插入反转录病毒载体中，其中从强启动子如hCMV-MIE启动子产生含有P450编码序列的转录物。合适质粒为pHIT111(Soneoka等1995，Nucl.AcidsRes.23；628-633)，然后采用标准分子生物学技术插入所需的基因以取代LacZ基因。然后，将所得质粒转染入FLYRD18或FLYA13包装细胞系(Cosset等1995 J.Virol.69；7430-7436)，并在1mg/ml G418中选择转染的细胞。G418抗性包装细胞产生高滴度能够感染人细胞的重组反转录病毒。然后用该病毒制剂感染人癌细胞，并可以注射入体内肿瘤。然后由所述肿瘤细胞表达前体药物活化酶。
在pHIT111中，采用MoMLV LTR启动子-增强子在靶细胞中表达治疗基因。也可以修饰该载体使得治疗基因由内部启动子-增强子转录，例如主要在肿瘤细胞中具有活性或含有低氧调节元件的内部启动子-增强子。一种合适的含HRE增强子由截短的HSV TK启动子以及三个拷贝的小鼠PGK HRE(Firth等1994 Proc Natl Acad Sci USA916496-6500)组成。将描述于例如WO95/21927中的合成寡核苷酸插入pHIT1113’LTR中的NheI和XbaI位点之间(Soneoka等，同上)，产生其中在靶细胞中的基因表达处于低氧控制下的反转录病毒载体。以相同方式构建的一种替代的反转录病毒载体为示于图6a的pKAHRE。其它可用载体主链示于图6b。
为了操作和分析P450R基因的编码序列，将其如下亚克隆入哺乳动物细胞表达载体-序列ID NO1是人P450R cDNA(Shephard等1992，Arch.Biochem.Biophy.294168，GenBank登记号S90469，参见图1a)。
用常规PCR扩增法从人胎盘cDNA获得为EcoRI片段的P450还原酶cDNA，连接入pBlueScript II载体形成P450R.1。
为了构建P450还原酶的核靶向衍生物，去除ER锚着结构域，产生非锚着P450还原酶(alP450)，并加入核定位信号。
P450还原酶的功能性结构域示于图1b。
SEQ ID NOalP450R序列示于图2A。
采用以下引物的PCR扩增从质粒pP450R.1获得SV40NLS替代ER结构域的任何P450还原酶衍生物(alP450R，参见图2a的SEQ ID NO3序列)。
NLS-alP450 5’-引物SEQ ID NO7。
cccgccgcca ccatgCCAAA AAAGAAGAGA AAGGTATCCT CTGTCAGAGAGACGCTTTG(61mer)
它含有以下组分1.Kozak前导序列(Peakman等1992，专利公布号EP0486170-A/2，GenBank登记号A18727)。下划线。
2.SV40大T抗原的运入核信号序列(Fiers等，1978，Nature 273113，也参见Nigg 1997，Nature 386779，GenBank登记号V01380)。
3.alP450R的5’区(Smith等1994，PNAS 918710图3A)。
alP450 3’-引物SEQ ID NO8。alP450R的3’-区CTAGCTCCAC ACGTCCAGGG AGTAG(25mer)将所得的PCR片段亚克隆入pCIneo载体(得自Promega)多克隆区的SmaI位点。
SEQ ID NO9。pCINeo的多克隆位点gctagctcga gaattcacgcg tggtacctct agagtcgaCC CGGGcggccg c(NheI-XhoI-EcoRI-MluI-XbaI-AccI/SalI-SmaI-NotI)最终的融合物结构示于图7.1。实施例2将核靶向肽加入P450R的功能性结构域(FN)。[图7.2]P450还原酶的功能性片段(FN片段)(Smith等1994，PNAS 918710)示于图2B。如下构建核靶向FN-产生编码以下融合蛋白的DNA序列的PCR片段-SEQ ID NO10和11。SV40NLS(图3)SEQ ID NO5和5。P450还原酶的FN片段。P450还原酶FN片段的序列示于图2B。
采用以下引物由pP450R.1(实施例1)扩增PCR片段-FN 5’-引物SEQ ID NO12。该序列含有Kozak翻译起始序列(小写字母)、SV40NLS(大写字母)和FN片段的5’-区(下划线黑体)ccgccgccaccatgC CAAAAAAGAA GAGAAAGGTACGCCAGTACGAGCTTGTGGTC CACA(60mer)FN 3’-引物SEQ ID NO13。FN片段的3’-编码区CTAGCTCCAC ACGTCCAGGG AGTAG(24mer)将PCR片段亚克隆入pCIneo载体的SmaI位点，产生SV40NLS-FN(图7.2)。实施例3 构建bFGF-alP450R病毒载体[图7.3]按实施例1所述制备融合物。
bFGF的18kD同种型(Prats等1989，PNAS 861836，参见图4B；GenBank登记号J04513)。
构建在bFGF的18kD同种型的N-末端和C-末端含有非锚着P450还原酶的杂种蛋白(图2A)。采用两个PCR反应，从bFGF-pUC18质粒(得自R&D系统)去除bFGF序列产生bFGF片段，以及从p450R.1去除alP450R序列。然后用SalI消化这两种片段，连接在一起。应用以下引物-bFGF 5’-引物SEQ ID NO14。它引导具有Kozak前导序列(下划线)的18kD同种型的5’-编码区。cccgccgcca ccatggcagc cgggagcatc accacg(36mer)bFGF 3’-引物SEQ ID NO15。它引导具有在前的SalI限制位ggcgGTCGACgct cttagcagac attggaaga(32mer)点(用大写字母表示)的bFGF的3’-编码区alP450R 5’-引物SEQ ID NO16。它引导具有在前的SAlI限制位点(大写字母表示)alP450R的5’-编码区ggcgGTCGAC tcc tctgtcagag agagcagctt tg(35mer)alP450R 3’-引物SEQ ID NO17。它引导alP450R的3’-编码区ctagctccac acgtccaggg agtag(24mer)然后用SalI消化两个PCR片段bFGF和alP450R，纯化，然后彼此相互连接。然后将连接的DNA亚克隆入哺乳动物表达载体pCIneo的SalI位点(图7.3)。
在某些情况下，优选用柔性接头分隔蛋白结构域。例如但不限于序列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3(Somia等1993 PNAS 90，7889)。这是重组DNA技术和蛋白表达领域一般技术人员熟知的方法。
例如为了使柔性接头(flexlink)位于TTS和alP450或FN蛋白结构域接点之间，可应用一组替代引物制备以下片段引物SalI-flexlink-alP450RSEQ ID NO18。黑体序列代表在高表达的基因中的罕见密码子(Haas等1996 Curr.Biol.，6，315)。下划线序列为alP450R的5’区。5’-ggcgGTCGAC gga ggt gga ggt tcg GGC GGG GGC GGC AGT GGG GGC GGCGGG AGTtcc tctgtcagag agagcagctt tg实施例4构建bFGF-FN表达载体[图7.4]通过PCR扩增从bFGF/PUC18质粒(R&D系统)获得编码18kDbFGF蛋白(见图3B)和FN结构域(图2B)的融合蛋白产物的cDNA片段，所述FN片段采用以下引物从质粒pP450R.1获得bFGF引物对于bFGF 5’-和3’-引物参见实施例3。
FN 5’-引物SEQ ID NO21。它引导具有在前的SalI限制位点的5’-编码区ggcgGTCGAC cgc cagtacgagc ttgtggtcca ca(35mer)FN 3’-引物SEQ ID NO13。FN片段的3’-编码区CTAGCTCCAC ACGTCCAGGG AGTAG(24mer)然后用SalI消化两个PCR片段bFGF和FN，纯化，然后彼此相互连接。然后将连接的DNA亚克隆入哺乳动物表达载体pCIneo的SalI位点(图7.4)。
为了使柔性接头位于bFGF和FN结构域之间，可使用一个替代5’引物引物SalI-flexlink-alP450RSEQ ID NO22。
5’-ggcgGTCGAC gga ggt gga ggt tcg GGC GGG GGC GGC AGT GGG GGC GGCGGG AGT cgccagtacgagc ttgtggtcca ca黑体序列代表在高表达的基因中的罕见密码子(Haas等1996 CurrBiol.，6，315)。下划线序列为FN的5’区。实施例5构建pAntp-alP450R表达载体[图7.5]SEQ ID NO53和54。果蝇触角足蛋白同源框肽(pAntp，Laughon等1986 Mol.Cell.Biol.64676)。
采用以下引物，从p903G质粒PCR扩增pAntp和从质粒pP450R.1扩增非锚着P450R获得编码pAntp和alP450RD的融合蛋白产物的cDNA片段pAntp 5’-引物SEQ ID NO23。它引导具有Kozak前导序列(下划线)的pAntp的5’-编码区cccgccgcca ccatggaacg caaacgcgga aggcagacat(40mer)pAntp 3’-引物SEQ ID NO24。它引导具有SalI限制位点的3’-编码区ggcgGTCGACgtt ctccttcttc cacttcatgc gccga(38mer)alP450R 5’-引物SEQ ID NO16。它引导具有在前的SalI限制位点的5’-编码区ggcgGTCGACtcc tctgtcagag agagcagctt tg(35mer)alP450R 3’-引物SEQ ID NO17。它引导3’-编码区ctagctccac acgtccaggg agtag然后用SalI消化两个PCR片段pAntp和alP450R，纯化后使其彼此相互连接。再后将连接的DNA亚克隆入哺乳动物表达载体pCIneo的SmaI位点(图8.5)。
按以上实施例所述，可用替代引物来插入柔性接头。
为了增强pAntp融合物从细胞分泌，将分泌信号加入N-末端。合适信号可衍生自5T4单链抗体序列(图3F)。
PAntp分泌5’引物SEQ ID NO28。它使Kozak翻译起始位点和分泌信号置于pAntp肽的5’末端。大写字母表示相当于pAntp的序列，下划线为Kozak起始序列。ccaccatgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtccactccaaacgcggaaggcagacaGAACGCAAACGCGGAAGGCAGACAT(105mer)实施例6构建pAntp-FN表达载体[图7.6]按实施例5所述，通过PCR扩增从含有pAntp的质粒例如p903G获得编码pAntp的融合蛋白产物的cDNA片段。采用以下引物，从质粒pP450R.1获得FN片段(见图2B)pAntp的5’-引物和3’-引物见实施例5FN的5’-引物和3’-引物见实施例4。
然后用SalI消化两个PCR片段pAntp和FN，纯化后使其彼此相互连接。再后将连接的DNA亚克隆入哺乳动物表达载体pCIneo的SmaI位点(图7.6)。或可使用pAntp分泌5’引物、SEQ ID NO28。实施例7构建VP-alP450R表达载体[图7.7]SEQ ID NO55和56。1型单纯疱疹病毒间层蛋白VP22(Elliott和O’Hare 1997 Cell 88223，GenBank登记号X14112)。
采用以下引物，通过PCR扩增从含有VP-22的质粒pGE109和通过PCR扩增从质粒pP450R.1获得VP22融合至alP450R的融合蛋白产物VP22 5’引物SEQ ID NO29。它引导具有Kozak前导序列(下划线)的5’-编码序列。cccgccgcca ccatgacctc tcgccgctcc gtgaag(36mer)VP22 3’引物SEQ ID NO30。它引导3’-编码区，并含有SalI限制位点。ggcgGTCGACctc gacgggccgt ctggggcgag a(34mer)alP450R的5’-和3’-引物参见实施例3。
然后用SalI消化两个PCR片段VP-22和alP450R，纯化后使其彼此相互连接。再后将连接的DNA亚克隆入哺乳动物表达载体pCIneo的SmaI位点(图7.7)。实施例8构建VP-FN表达载体[图7.8]按实施例7所述，采用以下引物通过PCR扩增从pGE109获得编码VP-22融合蛋白产物cDNA片段(参见3D)和从质粒pP450R.1获得FN片段(见图2B)VP22 5’-引物和VP22 3-’引物见实施例7FN 5’-引物和VP22 3’-引物见实施例4。
然后用SalI消化两个PCR片段pAntp和FN，纯化后使其彼此相互连接。再后将连接的DNA亚克隆入哺乳动物表达载体pCIneo的SmaI位点(图7.8)。实施例9A构建5T4scFv-PEA-alP450R表达载体[图7.9]构建该融合蛋白涉及PCR扩增，然后连接三种DNA片段形成完整的插入物。第一个片段编码抗肿瘤抗原5T4的单链可变抗体片段的蛋白产物。
SEQ ID NO26。图3F为5T4 scFv的编码序列。采用以下引物通过PCR扩增从含有该序列的常见质粒pPs-5T4获得该序列片段15T4 scFv5T4 scFv 5’-引物SEQ ID NO31。该引物提供5T4 scFv序列的翻译起始信号和分泌信号区(图3F)。ccaccatggg atggagctgt atca(24mer)5T4 scFv 3’-引物SEQ ID NO32。它引导具有HindIII限制位点的5T4 scFv片段的3’-区。ggccAAGCTTccg tttgatttcca gcttggag(32mer)
片段2PEA片段SEQ ID NO33和34。铜绿假单胞菌外毒素A结构域II的蛋白(PEA，GenBank登记号K01397和M23348)(图3E)。采用以下引物可获得作为PCR片段的该蛋白PEA 5’-引物SEQ ID NO35。它引导具有HindIII限制位点的5’-编码区。ggcgAAGCTTggc agcctggccg cgctgaccgcg ca(35mer)PEA 3’-引物SEQ ID NO36。它引导具有EcoRI限制位点的3’-编码区。ggcgGAATTCgtt ggccgcgccc cggtcgtcgt t(34mer)片段3alP450R片段采用以下引物通过PCR扩增从质粒pP450R.1获得编码alP450R的第三个cDNA片段(见图2A)alP450R 5’-引物SEQ ID NO37。它引导具有EcoRI限制位点的5’-编码区。ggcgGAATTCtca gctcttagca gacattggaa g(34mer)alP450R3’-引物见实施例3的SEQ ID NO17。
然后用HindIII消化第一个和第二个PCR片段后使其连接在一起。再用EcoRI消化所述连接物和第三个PCR片段后连接形成全长插入物。将全长插入物亚克隆入pCIneo表达载体的SmaI位点(图7.9)。实施例9B构建5T4scFv-alP450R-MTS表达载体[图7.13]构建该融合蛋白需要进行PCR扩增，然后将三种DNA片段连接形成完整的插入物。如实施例9A，第一个片段编码抗肿瘤抗原5T4的单链可变抗体片段的蛋白产物。
SEQ ID NO26。图3F为5T4 scFv的编码序列。采用以下引物通过PCR扩增从含有该序列的常见质粒pPs-5T4获得该序列片段15T4scFv5T4scFv 5’-引物SEQ ID NO31。该引物提供5T4scFv序列的翻译起始信号和分泌信号区(图3F)。ccaccatggg atggagctgt atca(24mer)5T4scFv 3’-引物SEQ ID NO32。它引导具有HindIII限制位点的3’-区。ggccAAGCTTccg tttgatttcca gcttggag(32mer)片段2alP450R采用以下引物通过PCR扩增从质粒pP450R.1获得编码alP450R的第二个cDNA片段(见图2A)alP450R 5’-引物SEQ ID NO38。它引导具有HindIII限制位点的5’-编码区。ggccAAGCTTtca gctcttagca gacattggaa g(34mer)alP450R 3’-引物SEQ ID NO39。它引导具有EcoRI限制位点的alP450R 3’-编码区。gccgGAATTCgct ccacacgtcc agggagtag(32mer)片段3MTS采用以下引物通过PCR扩增获得编码膜转位序列(MTS)的第三个片段MTS 5’-引物SEQ ID NO40。引导具有EcoRI限制位点的5’-编码区。gccgGAATTCgca gccgttcttc tccctgttct tcttgccgca ccc(46mer)MTS 3’-引物SEQ ID NO41。它引导3’-编码区。
ttagggtgcg gcaagaagaa cagggagaag aacggctgc(39mer)然后用HmdIII消化第一个和第二个PCR片段后使其连接在一起。再用EcoRI消化所述连接物和第三个PCR片段后连接形成全长插入物。将全长插入物亚克隆入pCIneo表达载体的SmaI位点(图7.13)。实施例10A构建5T4scFv-PEA-FN表达载体[图7.10]构建该载体涉及PCR扩增，然后连接三种DNA片段形成插入物。如实施例9A所述获得编码抗肿瘤抗原5T4的单链可变抗体片段的蛋白产物的第一个片段。
如实施例9A所述获得编码铜绿假单胞菌外毒素A结构域II的蛋白(PEA，GenBank登记号K01397和M23348)的第二个cDNA片段。
PEA 5’-和3’-引物同实施例9A。
采用以下引物，通过PCR从质粒pP450R.1获得编码FN的第三个cDNA片段(见图2B)FN 5’-引物SEQ ID NO32。它引导具有EcoRI限制位点的5’-编码区。ggcgGAATTCcge cagtacgagc ttgtggtcca ca(35mer)FN 3’-引物同实施例4。
然后用HindIII消化第一个和第二个PCR片段后使其连接在一起。再用EcoRI消化所述连接产物和第三个PCR片段后连接形成全长插入物。将全长插入物亚克隆入pCIneo表达载体的SmaI位点(图7.10)。实施例10B构建5T4scFv-FN-MTS表达载体构建该载体涉及进行PCR扩增，然后将三种DNA片段连接形成插入物。如实施例9A获得编码抗肿瘤抗原5T4的单链可变抗体片段的蛋白产物的第一个片段。
采用以下引物，通过PCR扩增从质粒pP450R.1获得编码FN的第二个片段(见图2B)FN 5’-引物SEQ ID NO43。它引导具有HindIII限制位点的5’-编码区。ggccAGGTTCcgc cagtacgagc ttgtggtcca ca(35mer)FN 3’-引物SEQ ID NO44。它引导具有EcoRI限制位点的3’-编码区。gccgGAATTCcta gctccacacg tccagggagt ag(35mer)如实施例9B通过PCR扩增获得编码MTS的第三个片段。
然后用HindIII消化第一个和第二个PCR片段后使其连接在一起。再用EcoRI消化所述连接产物和第三个PCR片段后连接形成全长插入物。将全长插入物亚克隆入pCIneo表达载体的SmaI位点(图7.14)实施例11构建P4502B6/FN融合蛋白[图7.11]SEQ ID NO33。P4502B6的编码区(Yamano等1989 Biochemistry，28，7340；GenBank登记号JO2864)(图4)。采用以下引物将其作为NheI至XhoI片段亚克隆入pCI-Neo中。
2B6 Nhe 5’引物SEQ ID NO34ggcgGCTAGC cagaccatggaactcagcg(29mer)2B6 Nhe 3’引物SEQ ID NO35。该引物修饰所述蛋白的C-末端，以去除终止密码子并用XhoI位点代替它。用NheI和XhoI消化所述PCR片段，并亚克隆入pCINeo产生含有截短P450的pCI-Neo。ggcgCTCGAG gcggggcaggaagcggatctgg(32mer)用以下引物构建flexi-link FN片段Flexi-FN 5’引物SEQ ID NO36。该引物使SalI限制位点位于FN片段的N-末端的柔性接头之前。小写黑体字为接头中的罕见密码子；下画线为FN中的序列；大写字母为SalI位点。-ggcgGTCGAC gga ggt gga ggt tcg GGC GGG GGC GGC AGT GGG GGC GGCGGG AGT cgc cagtacgagc ttgtggtcca ca(80mer)FN 3’引物同实施例4。CTAGCTCCAC ACGTCCAGGG AGTAG(24mer)用NheI和XhaI消化2B6 PCR，连接至SalI消化的FN片段，纯化所述片段后，将其连接入XhoI/SmaI消化的pCIneo[图7.11]。实施例12构建P450和P450R的双表达盒[图7.12]采用以下引物将P450 2B6作为NheI/XhoI片段亚克隆入pCINeo中
2B6 Nhe 5’引物SEQ ID NO37ggcgGCTAGC cagaccatggaactcagcg2B6末端3’引物SEQ ID NO38。该引物保留真正的翻译终止信号5’ggcgCTCGAG tcagcggggcaggaagcggatctggSEQ ID NO39。衍生自FMDV R100的内部核糖体位点(IRES，图5，Escarmis等1992 Virus Res.26，113)。
将其插入含有上述2B6序列的质粒pCI-Neo的XhoI位点中。用衍生自图6所示序列的相关5’和3’引物分离作为XhoI/SalI片段的IRES。所产生的质粒用SalI消化，插入得自P450R.1的XhoI/SalI片段。最终结构示于图7.12。实施例13构建P450/FN和VP-FN的双表达盒构建含有活性P450和P450R实体的编码区的组合物。一个实例是共表达VP-FN和P450FN。
将实施例8所述构建的融合物(图8.8)插入反转录病毒COI的HpaI位点(图6b)，和将实施例11所述的融合构建物(图7.11)插入COI的XhoI位点。这产生环磷酰胺、Tirapazamine和丝裂霉素C最大敏感性的载体(图8)。实施例14构建表达修饰的前体药物活化酶的反转录病毒载体用诸如FLYRD18(Cosset等)的包装细胞系系统产生RRV。将含待包装的载体基因组的质粒载体转染入上述包装细胞系(Cosset FL等1995，J Virol 69 7430-7436)，以衍生生产细胞系。含载体基因组的合适质粒为pHIT111(Soneoka等1995，Nucl Acids Res 23，628-633)。采用标准分子生物学技术，插入所需的治疗基因以取代pHIT111中的LacZ基因。可以将诸如HRE的调节元件和/或增强子元件相似地引入pHIT111中反转录病毒的LTR中，以取代反转录病毒增强子，以确保调节表达治疗基因。然后，将该质粒与适用于FLYRD18细胞的选择标记(例如pSV2neo)一起共同转染，并在1mg/ml G418(Sigma)中选择转染的细胞。一种替代载体是PKAHER，它是基于MLV的单一转录单位载体(图6)。治疗基因的表达受低氧效应启动子的控制(3×PGK，Dachs等在所引用的书中)。将编码所述前体药物活化酶的基因替换为所示的nlsLAcZ。特别适用于表达多转录单位的替代载体为COI(图6)。这是用CMV增强子替代MLV增强子(阴影框)的基于MLV的载体。将编码所述前体药物活化酶的基因插入Bam/Sal/Hpa多接头或Stu/Xho多接头中。必要时用合适的接头修饰待插入片段末端，产生合适的匹配限制位点。或者将不同的基因插入每个接头部位(图8)。
另一方面可以使用慢病毒，这将更详细地在实施例14B中描述。实施例14B产生表达P450的EIAV载体基因组构建物详细描述peg HRElacZ描述于专利申请第9901906.9号，重复如下。pEGASUS4(也就是pEGASUS1)、pONY4.0、pONY4.1、pONY3.1、pHORSE3.1描述于PCT/GB98/03876，也描述如下。OBhrel三联体(trimer)包括连接至SV40启动子(斜体)天然取向的小鼠PGK的-307/-290(Firth等，1995)。GCTAGAGTCGTGCAGGACGTGACATCTAGTGTCGTGCAGGACGTGACANhel HREHRETCTAGTGTCGTGCAGGACGTGACAGCTAGCCCGGGCTCGAGATCTGCGHRE XbalATCTGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATCGCTGACTAATTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTG起始 起始该启动子序列被定义为OBhrel。所产生的质粒命名为质粒OB37。pEGASUS-4(也就是pEGASUS-1)已经将低氧效应启动子构建到慢病毒载体pEGASUS-1(也就是pEGASUS-4(+))和相关的载体pONY2.1中。这两种载体均衍生自感染性原病毒EIAV克隆pSPEIAV19(Payne等1998；登记号U01866)。以下描述这些质粒的构建(取自英国专利申请第9727135.7)。pONY2.1将EIAV 5’LTR插入pBluescript II KS+(Stratagene)构建质粒pONY1。用pfu聚合酶和下列引物-5’GCATGGACCTGTGGGGTTTTTATGAGG和3’GCATGAGCTCTGTAGGATCTCGAACAGAC通过PCR从pSPEIAV19扩增EIAV 5’LTR。所扩增的产物通过5’突出端的补平而平端化，并插入用BssHII切割、已用T4 DNA聚合酶去除3’突出端平端化的pBluescript II KS+中。该构建物称为pONY1，其取向是与pBluescript II KS+的β-半乳糖苷酶相关的5’至3’。PONY测序显示没有突变。
通过去除Hind III/Hind III片段使pSPEIAV19的env区缺失，产生pSPEIAV19ΔH。然后将pSPEIAV19ΔH的MluI/MluI(216/8124)片段插入用MluI切割的pONY1中，产生pBluescript II KS+中的野生型原病毒克隆(pONY2ΔH)。然后进行pBluescript II KS+的BssHII消化(619/792)，获得多克隆位点。通过5’突出端补平使其平端化，并连接至用BglII和NcoI切割(1901/4949-在pol中)并通过5’突出端补平平端化的pONY2ΔH。其取向为与EIAV序列有关的3’至5’。该克隆称为pONY2.1。
将pLNCX(Genbank登记号M28246)(PstI/HindIII)插入pSP72(Promega；Genbank登记号X65332)中产生pSPCMV。将pTIN414(Cannon等，1996)β-半乳糖苷酶基因插入pSPCMV(XhoI/SphI)，制备pSPlacZ。用pAD.RSVbgal(Stratford-Perricaudet等，1992)的SV40 T抗原核定位信号替代5’末端至β-半乳糖苷酶基因，产生pSPnlslacZ(XhoI/ClaI)。pSPlacZ和pSPnlslacZ的CMV核定位和非核定位的β-半乳糖苷酶用PstI切除，插入EIAV 5’至3’方向的pONY2.1的PstI位点。这些构建物称为pONY2.1nlslacZ和pONY2.1lacZ。pEGASUS-1这是只含有EIAV序列(268nt-675nt和7942nt-8292nt)的759nt的基于EIAV的载体。采用引物PPTEIAV+(Y8198)GACTACGACTAGTGTATGTTTAGAAAAACAAGG和3’NEGSpeI(Y8199)CTAGGCTACTAGTACTGTAGGATCTCGAACAG，通过PCR从pONY2.1获得包含EIAV多嘌呤序列段(polypurine tract)(PPT)和3’LTR的序列。纯化产物，用SpeI消化并连接入用SpeI消化和用碱性磷酸酶处理制备的pBS II KS+。转化入大肠杆菌XL-1Blue后筛选获得存在其中3’TLR的U5区邻接pBS II KS+接头的NotI位点的取向的3’LTR的菌落。测定所克隆的插入物的序列，证明它只含有一个EIAV克隆pSPEIAV19的变化。这是位于R区的碱基3和碱基4之间的‘C’插入。相同的改变见于PCR反应中所用的模板。该克隆命名为pBS.3’LTR。
然后将报道基因盒CMV启动子/LacZ引入pBS.3’LTR的Pstl位点。从pONY2.1获得作为PstI片段的CMV/LacZ盒。将连接上述片段的连接反应物转化入大肠杆菌XLlBlue。采用标准方法将其转染入细胞系293T中，评价其中CMV/LacZ插入物取向使得LacZ基因邻接3’LTR的许多克隆的CMV/LacZ盒活性。选择转染后48小时用X-gal显色产生蓝细胞的克隆供后续使用。该克隆命名为pBSCMVLacZ.3’LTR。
在表达载体pCI-ENeo中构建EIAV载体的5’区，pCI-ENeo载体是pCI-Neo(Promega；Genbank登记号U47120)的衍生物，它通过含有得自以上定义的全长CMV启动子的5’末端的约400个碱基对而被修饰。采用引物VSAT1(GGGCTATATGAGATCTTGAATAATAAAATGTGT)和VSAT2(TATTAATAAC TAGT)并用pHIT60(Soneoka等，1995)作模板，通过PCR扩增获得所述400个碱基对片段。用BglII和SpeI消化所述产物，并连接入同样消化的pCI-Neo中。
用pSPEIAV19作模板DNA，采用引物CMV5’EIAV2(GCTACGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGGGCACTCAGATTCTG[下划线序列退火至EIAVR区])和3’PSI.NEG(GCTGAGCTCTAGAGTCCTTTTCTTT TACAAAGTTGG)扩增R区至gag编码区(nt 268-675)的nt 150的EIAV基因组的片段。引物CMV5’EIAV2的5’区含有紧接CMV启动子转录起始位点上游的序列，可用SacI(黑体)切割。3’PSI.NEG结合根据缺失分析定义的EIAV包装序列的3’，并含有XbaI位点。
用SacI和XbaI修整PCR产物，并连接入用相同酶消化制备用于连接的pCI-Eneo中。该操作使EIAV R区起始于CMV启动子的转录起始点，由此产生的转录产物从EIAV所用的真正起始位置起始并延伸至包装信号的3’-侧。对限制分析评价视为正确的克隆进行测序。选择称为pCI-Eneo.5’EIAV的克隆以用于后续工作。
在下一步骤中，将在pBS.CMVLacZ.3’LTR中的CMVLacZ和3’LTR盒引入pCI-Eneo.5’EIAV中。用ApaI消化pBS.CMVLacZ.3’LTR，用T4 DNA聚合酶去除3’突出端，然后用NotI消化。用标准分子生物学技术纯化含有CMVLacZ.3’LTR的片段。用SalI消化，然后用T4 DNA聚合酶将5’突出端补平，从而由pCIEneo.5’EIAV制备用于与所述片段连接的载体。然后用NotI消化所述DNA，在用于连接反应之前进行纯化。转化入大肠杆菌XL-1bLUE后，通过限制分析筛选存在插入物的菌落，以鉴定称为pEGASUS-1的需要克隆(注意它真正表示pEGASUS-4(+)，是一种含有紧靠EIAV R-U5-psi区下游的EIAV RR3的pEGASUS-1-详见下文)。pEGASUS-4(+)通过引入另外的元件可对EIAV载体pEGASUS-1进行改进，以提高滴度。引入这类元件的适当位点是位于包装信号3’的XbaI和pEGASUS-1的CMV/LacZ上游之间的SalI位点。例如EIAV的RRE可以插入此位点。
如下通过PCR扩增获得以上定义的EIAV RRE。用pONY2.10LacZ作模板，进行两次扩增获得两份EIAV RRE。采用引物ERRE1(TTCTGTCGACGAATCCCAGGGGGAATCTCAAC)和HRRE2(GTCACCTTCCAG AGGGCCCTGGCTAAGCATAACAG)获得5’-元件，用ERRE3(CTGTTATGCTTAGCCAGGGCCCTCTGGAAGGTGAC)和ERRE4(AATTGCTGACCCCCAAA ATAGCCATAAG)获得3’-元件。这些产物将可以相互退火，所以可用于第二个PCR反应，以获得‘编码’EIAVRRE的DNA。首先不用引物ERR1和ERRE4将第二个PCR扩增进行10个循环，然后将这些引物加入反应中，再进行10个循环的扩增。用SalI消化产生的PCR产物和pEGASUS-1，连接并转化入大肠杆菌XL-1Blue中。选择其中EIAV RRE处于正向或负向的克隆供进一步处理。这些载体质粒称为pEGASURS-4(+)(见图20)和pEGASUS-4(-)。pONY HRE luc/lac切除作为XbaI/AscI片段的pONY2.1中的CMV启动子，用含有MluI/XbaI位点的寡核苷酸替代。因而这使得可以插入自OB37分离的MluI/XbaI片段，产生pONY HRE luc/lac。去除作为Ncol片段的荧光素酶编码序列，连接主链产生pONY HRElac。同样，去除作为XbaI/SalI的lacZ后，连接主链，产生pONY HREluc。pEGHRELacZ/luc用EcoRI从EIAV载体质粒pEGASUS-1切除CMV启动子lacZ盒，用含有SacI和Bsu36位点的合成寡核苷酸替代。这使得可以分别从作为SacI/Bsu36和SacI/EcoRI片段的pONY HRE luc和pONYHRE lac克隆HRE luc/HRE lac盒。最终的载体称为pEG-HRE-lacZ和pEG-HRE-luc。
用同一方法，构建pEGHRE载体，以表达取代lacZ或Luc基因的治疗基因，例如以上所列的任一治疗基因。分别用SacI/Bsu36和SacI/EcoRI从pEG-HRE-lacZ或pEG-HRE-luc切除lacZ/luc片段以及连接含有编码序列的合适片段，从而将这些片段克隆入pEGHRE载体。可用的治疗基因实例为编码抗血管生成因子血小板反应蛋白-1的基因(Genbank登记号X04665)。
为了构建没有复制能力的EIAV载体系统，我们已经采用由Payne等(1994，J Gen Virol.75425-9)描述的感染性原病毒克隆pSPEIAV19(登记号U01866)作为起始点。按照Payne等(同上)的计数系统，通过去除相当于配位5835/6571的Hind III/Hind III片段来简单地缺失部分env，从而构建起始的基于EIAV的载体。用在pTIN500的SV40早期启动子控制之下的嘌呤霉素抗性基因替换该片段(Cannon等1996 J.Virol.708234-8240)，产生pESP。
所以，构建包括三个转录单位的再一载体系统，以产生下列结构1)载体基因组RNA；2)env和3)gag-pol。为了保证产生足够的每一组分，所述env和gag-pol转录单位从在所选择的人包装细胞系中具有活性的启动子-增强子转录。这样，产生足够的gag-pol和最可能的tat，以保证有效产生可转导的载体颗粒。
如下构建在基因组的pol区中具有报道基因的载体基因组。通过将用PCR从pSPEIAV19扩增的EIAV LTR插入pBluescript II KS+(Stratagene)，构建称为pONY1的质粒。用下列引物，采用pfu聚合酶经PCR扩增EIAV克隆pSPEIAV19的5’LTR5′GCATGGACCTGTGGGGTTTTTATGAGG3′GCATGAGCTCTGTAGGATCTCGAACAGAC通过5’突出端补平平端化所述扩增子，并将其插入用Bss HII切割、用T4 DNA聚合酶去除3’突出端平端化的pBluescript II KS+中。该构建物称为pONY1，取向为与pBluescript II KS+β-葡萄糖苷酶有关的5’至3’。pONY1的测序显示没有突变。
在HindIII/HindIII位点缺失pSEIAV19的env区，产生pSPEIAV19DH。用Mlu I(216/8124)切割载体基因组pSPEIAV19DH，插入Mlu I(216)切割的pONY1中，制备pONY2。进行pBluescript IIKS+的Bss HII消化(619/792)，获得多克隆位点。通过5’突出端补平平端化，连接至用Bgl II和Nco I(1901/4949)切割并通过5’突出端补平平端化的pONY2。其取向是与EIAV序列有关的3’至5’。这被称为pONY2.1。将pLNCX(登记号M28246)(Pst I/Hind III)插入pSP72(Promega)中产生pSPCMV。将得自pTIN414(Cannon PM等J.Virol.70，8234-8240)的β-葡萄糖苷酶基因插入pSP72(Xho I/Sph I)中，制得pSPlacZ。用得自pAD.RSVbgal(J.Clin.Invet.90626-630，1992)的SV40 T抗原核定位信号替换β-葡萄糖苷酶基因的5’端。用Xho I/Cla I切割pAD.RSVbgal，将其插入Xho I/Cla I pSPlacZ中，制得pSPnlslacZ。得自pSPlacZ和pSPnlslacZ的CMV核定位和非核定位的β-葡萄糖苷酶用Pst I切除，插入EIAV中5’至3’取向的pONY2.1的Pst I位点。这些构建物称为pONY2.1nlslacZ和pONY2.1lacZ。
从hCMV-MIE启动子-增强子表达gag-pol基因。具体地说，用Mlu I(216/8124)切割gagpol pSPEIAV19DH，并插入Mlu I切割(216)的pCI-Neo(Promega)中制备pONY3。
载体基因组pONY2.1lacZ含有gag的1377 nt。用RNA二级结构预测(“http//www.ibc.wustl.edu/～zuker/rna/”)鉴别在gag的前导序列和5’末端中的可能的茎-环结构。根据这些预测，在pONY2.1lacZ的gag区中制备了4个缺失。采用标准技术经PCR诱变达到缺失。pONY2.11lacZpONY2.1lacZ含有gag的1377nt(从1901nt位缺失)pONY2.1lacZ含有gag的354nt(从878位缺失)pONY3.1在pONY3中具有gagpol编码序列起始之前的延长的5’非翻译区。该异常长序列可能危及gagpol盒的表达。为了提高gagpol表达，修饰pONY3，以去除留下的5’LTR。用NarI和Eco RV切割pONY3可实现该目的。将2.4kb片段在Cla I和Eco RV位点插入pBluescriptKS+(Stratagene)，制得构建物pBSpONY3.0。用Xho I和Eco RV切割pBSpONY3.0。将2.4kb片段在XhoI和Eco RV位点插入pONY3，制得pONY3.1。
该操作去除5’LTR直至在引物结合区(386nt)中的Nar I位点。该构建物滴度增加2倍，而且提高蛋白表达(图9)。
同pONY3一样，pONY3.1编码gag、gagpol、Tat、S2和Rev。因为S2突变试验表明S2在生产系统或EIAV载体基因组中均不需要，所以可以设计不含S2的gagpol表达构建物。产生了两个这样的构建物pHORSE和pHORSE3.1。pHORSE采用pONY3作模板DNA，用EGAGP5’OUTER/EGAGPINNER3和EGAGP3’OUTER/EGAGPINNER5经PCR扩增制备pHORSE。纯化两种PCR产物，合并产物，用引物EGAGP5’OUTER/EGAGP3’OUTER再扩增。将该产物插入pSP72的Xho I和Sal I位点，制备pSP72EIAVgagpolO’lap。用Pvu II和Nco I切割pONY3，将4.3kb片段插入用Pvu II和Nco I切割的pSP72EIAVgagpolO’lap中，制得pSPEGP。用Xho I和Sal I(4.7kb)切割，在Xho I和Sal I位点插入pCI-Neo中。该构建物称为pCIEGP。用Sal I(0.7kb)从pEGASUS切除RRE，在Sal I位点插入pCIEGP构建物制得pHORSE。
当分析该构建物在存在或不存在pCI-Rev(表达EIAV Rev可读框的构建物，见上文)的情况下的蛋白表达，发现如所预期的一样是Rev依赖性的。然而，蛋白表达较pONY3.1低得多。另外，当用于病毒生产时，其病毒滴度较pONY3.1低100倍。pHORSE3.1意想不到的是，当将pONY3.1的前导序列(包括从5’LTR的U5的末端至gag 383-524nt的ATG起始密码子的序列)插入pHORSE制得pHORSE3.1时，蛋白表达和病毒产生得到改善。用pONY3.1的1.6kbXho I/Xba I替换pHORSE的1.5kb Xho I/Xba I制得pHORSE3.1。用pHORSE3.1获得的滴度与pONY3.1相似。与pONY3.1相比，pHORSE3.1的病毒滴度略微降低的原因可能是因为pHORSE3.1需要四个质粒共转染(因为该系统是Rev依赖性的)。所以我们的结论是，基本的EIAV载体系统应该含有该前导序列，以使gagpol表达最大化。pONY4和pONY4.1pONY2.1llacZ在gag中具有一个缺失，使得只留下gag ORF的373bp。用pEGASUS-1的CMV LTR替换5’LTR制得pONY4。用BglII/Xho I切割pEGASUS-1，释放出3.2kb片段(含有CMV LTR)，将其插入用Bgl II/Xho I切割的pSP72中。该构建物命名为pSPPEG213。用Hpa I/Nar I切割它，将1.3kb片段(包含CMV LTR)插入Nae I/Nar I切割的pONY2.11lacZ中。pONY4.1在lacZ基因的下游(Sfu I和Sal I位点之间)含有一个缺失(2.1kb)，使得tat、S2、env、rev和RRE丢失或严重截短。通过将其用Sfu I/Sal I切割、Klenow聚合酶平端化并重接，制得pONY4.1。用作为平端片段得自pEGFP-Nl(Clontech)的GFP基因(Bam HI/Xba I消化，然后用Klenow聚合酶平端化)替换pONY4的lacZ基因(Sac II/Kpn I消化，然后用Klenow聚合酶平端化)制备pONY4G。诱导型-HREpEGHREP450用Not I切割pegHRElacZ(纯化含有HRE增强子/SV40启动子和lac Z基因的3.9kb片段)。将该片段插入用Not I切割的pBluesctiptKS+(Stratagene)中制得pBHRElacZ。其取向使得lac Z和Amp基因为相同方向。该质粒现在用来经Nco I/Sph I位点插入任何目的核苷酸序列取代处于HRE控制之下的lac Z。然后经Not I位点将该盒插入EIAV载体基因组质粒pegHRElacZ。
用(登记号M29874，也称为CYP2B)引物5’P450和3’P450经PCR扩增P450。所述PCR的靶可以是肝脏cDNA或含有P450的质粒。5’P450 SEQ ID NO59TTTTCAGACCATGGAACTCAGCGTCC(下划线＝Nco I)3’P450 SEQ ID NO60ATCGCATGCTCAGCGGGGCAGGAAGCGGATC(下划线＝Sph I)这是P450，用Nco I切割PCR片段，纯化0.3kb片段，并插入用Nco I切割的pBHRElacZ。获得质粒pBHREP450del。用Aat II/Sph I切割所述PCR片段，将1.3kb片段插入用Aat II/Sph I切割的质粒pBHREP450del(纯化的3.9kb)中。获得质粒pBHREP450。用Not I切割它，然后插入用Not I切割的pegHRElacZ，获得pegHREP450。pONY4HREP450用Not I/Sph I切割pBHREP450，释放出1.8kb HRE P450，用T4DNA聚合酶将其末端平端化，然后插入用Pst I切割的pONY4.0中，末端平端化获得pONY4HREP450。pONY4.1HREP450用Not I/Sph I切割pBHREP450，释放出1.8kb HRE P450，用T4DNA聚合酶将其末端平端化，然后插入用Pst I切割的pONY4.1中，末端平端化获得pONY4.1HREP450。组成型-CMVpEGASUS4P450用Bsm I/Sph I切割pBHREP450获得1.5kb片段，用T4 DNA聚合酶将其末端平端化，然后插入用Xho I/Spl I切割、T4 DNA聚合酶平端化的pEGASUS4中，获得pEGASUS4P450。pONY4.0P450用Bsm I/Sph I切割pBHREP450获得1.5kb片段，用T4 DNA聚合酶将其末端平端化，然后插入用Xho I切割、T4 DNA聚合酶末端平端化的pONY4.0中，获得pONY4.0P450。pONY4.1P450用Bsm I/Sph I切割pBHREP450获得1.5kb片段，用T4 DNA聚合酶将其末端平端化，然后插入用Xho I切割、T4 DNA聚合酶末端平端化的pONY4.0中，获得pONY4.1P450。制备VSV-G假型化EIAV上述载体基因组用于与EIAVgagpol表达质粒pONY3.1和VSV-G包膜的三质粒共转染产生EIAV病毒载体。
因为VSV-G的毒性，所以必需具有一定形式的调节表达。在TE671中已经描述了温敏型VSV-G细胞系。
除此之外已描述了tet诱导系统(J Virol 1999 Jan；73(1)576-84，用于慢病毒载体的包装细胞系。Kafri T，van Praag H，Ouyang L，GageFH，Verma IM)。Rabies-G假型化EIAV上述载体基因组用于与EIAVgagpol表达质粒pONY3.1和Rabies-G包膜的三质粒共转染产生EIAV病毒载体。实施例15用单核细胞/巨噬细胞或干细胞传递增强的前体药物活化酶在实验室规模用标准技术(Sandlie和Michaelsen 1996述于Antibody engineeringa practical approach。McCafferty等编辑，第9章)和大规模时经淘析(例如得自CellPro的Ceprate)从人外周血分离外周血单核细胞。经粘附至塑料过夜，富集贴壁细胞(基本上为单核细胞)，然后把贴壁细胞培养1-3周，使细胞沿巨噬细胞分化通路分化。或者可通过CD14免疫磁性细胞分选富集。CD14LPS和LBP受体(Wright SD等(1990)Science 2491431)。用该方法可以从外周血获得的分离收率为95-99％纯度和90％以上的回收率而无活力丧失。各种转染法可用来将载体引入单核细胞和巨噬细胞中，包括粒子介导的DNA传递(生物发射)、电穿孔、阳离子剂介导的转染(例如用Superfect、Qiagen)。按照生产商的指南实施其中每一种方法，并根据具体生产商详细说明考虑改变参数以达到最佳结果。另一方面，可用病毒载体，例如缺陷型腺病毒载体(Microbix Inc或QuantumBiotechnologies Inc)或反转录病毒如描述于图6中的病毒载体。
用G-CSF和/或环磷酰胺活化后从外周血收获干细胞(Cassel等1993 Exp Hematol.21，585)。以10g/kg/天剂量皮下给予G-CSF(Amgen)7天。用CellPro干细胞分离系统进行单采血液成分术(apheresis)和干细胞的富集(Cassel等在所引用的书中)。在4g/ml硫酸鱼精蛋白和20ng/ml IL-3(Sandoz)、50ng/ml IL-6(Sandoz)、100ng/ml SCF(Amgen)存在下，以105细胞/ml在RRV生产细胞(实施例1)用过的培养基中培养干细胞富集群体(Santiago-Schwartz等1992，JLeuk Biol 52，274；Charbord等1996，Br J Haematol 94，449；Dao等1997，Blood 89，446；Piacibello等1997，Blood，89，2644)。也可以加入其它细胞因子和/或所述(Dunbar等1996，Hum Gene Ther，7，231)制备的自身基质细胞。24小时后，将细胞离心，并再悬浮于上述具有生长因子和硫酸鱼精蛋白新鲜的含RRV培养基中。再过24小时后，重复该步骤，再将细胞培养长达48小时。此后，用胰蛋白酶处理细胞，通过离心在新鲜培养基中洗涤数次，再悬浮于Plasma-Lyte A用于再输注。再输注的总体积约为25-50ml。为患者输注多至2小时。输注的细胞数目至少为105细胞，可以高达约1012细胞。
在再输注之前，也可以按照公开的方法(Haylock等(1992)，Blood801405-1412)使细胞沿骨髓细胞分化途径成熟。
用能够在人细胞中表达增强的前体药物活化酶的表达载体转染单核细胞、巨噬细胞或干细胞。包括上述慢病毒载体的反转录病毒载体是合适的。对于组成型的高水平表达，在利用hCMV-MIE启动子-增强子pCI(Promega)的载体中增强的前体药物活化酶。对于低氧诱导型表达，用含有至少一个HRE的启动子替换hCMV启动子。实施例16含有改进的前体药物活化酶的肿瘤细胞对环磷酰胺、Tirapazamien和丝裂霉素C的敏感性人肿瘤细胞系(Houlbrook等1994，Oncol(Life Sci.Adv.)13，69)得自美国典型培养物收藏中心，作为单层细胞生长于补充有2mM谷氨酰胺和10％(v/v)胎牛血清的RPMI 1640培养基中。
如Patterson等(同上)所述，用电穿孔技术将质粒引入人癌细胞系，尤其是乳腺癌MCF-7、MDA468、T47D和NSCLC细胞系。简而言之，用细胞刮棒收获指数生长细胞，洗涤并悬浮于‘cytomix’缓冲液(Van den Hoff等1992，Nucl.Acid Res.20，2902)。5×106细胞与10ug线性质粒混合，在4℃、960μF、280V，BioRad，进行电穿孔。以低密度平板接种细胞，在抗生素G418中选择存活的细胞。挑出各个G418抗性集落，扩大产生独立的克隆。如下所述或按Patterson等所述分析克隆细胞内的P450R蛋白的分布和酶活性。或按Soneoka等(在所引用的书中)所述用反转录病毒转染细胞而传递基因。
为了检测P450还原酶，首先在含有10mM HEPES(pH7.4)、1mMEDTA、0.5mM苯甲酰胺、0.5mM PMSF、1ug/ml胰蛋白酶抑制剂的缓冲液中经液氮冻融细胞制备细胞裂解液。在4℃以1600g离心去除细胞碎片。将所获得的上清液分为二等份。一份在加入甘油至10％后作为完整细胞裂解液储存。另一等份以105,000g于2℃离心45分钟。干燥所得的膜沉淀，并再悬浮于TRIS缓冲盐溶液(pH7.4)中。
通过检测NADPH依赖性细胞色素c的还原，从而用分光光度法测定P450还原酶活性。反应物含有400μl细胞色素c(终浓度50uM)、100ul 10mM氰化钾(终浓度1mM)和10-300ug蛋白裂解物，该裂解物可以是完整的细胞裂解物或膜部分(10-100ul体积)。用100mM磷酸缓冲液pH7.6将反应物体积制成100μl。将反应物平衡至37℃后，加入20ul 20mM NADPH(终浓度200ul)开始反应。于550nm监测细胞色素c相对于没有NADPH的空白的还原速率3分钟。计算开始的反应速率，将其表示为每mg裂解蛋白每分钟还原的细胞色素c nmol，假定消光系数为21mM-1。根据CO(一氧化碳)结合光谱检测P450浓度(Omura和Sato，1964，J.Biol.Chem.239，2370)。
为了测定酶在细胞中的位置，用聚焦显微镜(confocal microscope)对其进行分析。为进行聚集显微镜分析，将细胞生长于盖玻片上。洗涤单层细胞在1∶1丙酮∶乙醇中固定，用1％BSA封闭，然后与1/100稀释度的兔抗人P450还原酶多克隆抗体(Smith GCM，Tew DG和Wolf CR 1994 PNAS USA 918710-8714)孵育，接着用抗兔IgG FITC缀合的第二抗体(Becton Dickinson)处理。用BioRad MRC1000或MRC1004检测细胞。野生型P450R、alP450R和FN的分布与NLS衍生物的分布相似。
如下分析细胞对前体药物的敏感性；-i)Tirapazamine IC50如Seng和Ley，1972，Angew.，Chem.，Int.XI.1009和Adams等1984，Br.J.Cancer，49，571所述，用标准化学方法合成Tiapazamine。
用MTT增殖测定法确定剂量反应曲线。其基础是活细胞能够转化可溶性四唑鎓盐MTT为紫色甲晶体的能力(Mossma 1983 J.Immunol.Methods.65，55)。将含有以103/孔密度接种细胞的平行的96孔板孵育长至8天。每天检测所述板的甲产生量，每天根据光密度对所产生的细胞的标准曲线获得细胞数。IC50值是与未处理的对照相比，光密度降低50％所需要的药物浓度，将其用来测量对特定处理的细胞敏感性。在低氧条件下细胞与Tirapazamin接触3小时，使其生长96小时后进行MTT测定。当催化剂诱导的低氧结合使用氮气吹扫塑料制品和试剂时，一般按Patterson等1995(在所引用的书中)和Patterson等1997(在所引用的书中)改进法保持低氧。ii)环磷酰胺IC50环磷酰胺购自Sigma化学公司。为了测试药物敏感性，以4×104细胞/孔接种于6孔培养板中。接种后20小时加入CP。细胞生长长至7天。用以上所述MTT检测法或按Chen等1996在所引用的书中所述的通过锥虫蓝染料排斥法染色活细胞确定最终的活细胞数。iii)丝裂霉素C(MMC)IC50丝裂霉素C得自Sigma化学公司。为了测试药物敏感性，将以5×103细胞接种于96孔微量滴定板中。接种后16小时用稀释的MMC处理细胞3小时。细胞生长7天，然后用以上所述MTT检测法检测细胞存活率(Bligh等1990在所引用的书中)。实施例17通过协同培养分析旁观者效应将工程表达TTS-P450R融合蛋白的细胞与非工程细胞(对照细胞)以各种比率混合。评价用前体药物处理后的细胞活力。比较所述IC50和工程细胞与非工程细胞的均相培养物的IC50。当细胞死亡百分率大于混合物中的工程细胞的原先的百分率时，表明存在旁观者效应。为了确定是否需要细胞与细胞的接触，将对照细胞接种于培养板上，并将工程细胞加入COSTAR插入物中。加入药物，对照细胞的存活率指示产生自工程细胞的可扩散因子。Chen等在所引用的书中描述了测定ep的旁观者效应的方法。实施例18分析增强的前体药物活化酶的体内效力在裸鼠产生工程表达各种增强的前体药物活化酶或组合物的肿瘤细胞系异种移植物。用浓度渐增的相关药物处理所述小鼠，与在对侧胁腹的对照异种移植物比较肿瘤生长和细胞存活率。
应用雌性纯合的(nu+/nu+)、20-30g无胸腺Swiss裸鼠。将指数生长期的肿瘤细胞如MCF-7或MDA231(2×107/0.2ml/注射部位)皮下注射到胁腹。每只小鼠接受两次植入物植入，一侧胁腹上为对照肿瘤，另一侧为前体药物活化酶表达肿瘤。在某些情况下，需要进行另外的处理，例如如果使用MCF-7细胞，在植入肿瘤细胞前1天将17-β雌二醇丸预植入小鼠(Chen等1996在所引用的书中)。当所述肿瘤约50-100mm2大小时，通常在植入后5-6周，开始药物处理。以合适剂量经腹膜内或肿瘤内注射给药，通常为间隔24小时，给药两次。
对于某些动物，在合适时间，通常为药物处理后4-48小时，处死所述动物，分析肿瘤的表达和前体药物的作用。用标准方法分离肿瘤，根据肿瘤细胞类型包括切碎、冻融、超声处理和用胶原酶(500μg/ml)处理。如上所述分析酶活性和细胞存活率。维持一些动物并用外游标尺测量肿瘤大小。实施例19分析表达增强的前体药物活化酶的载体的肿瘤内传递的作用如上所述制备人肿瘤异种移植物。一旦所述肿瘤约50mm时，用22号针注射载体制剂。每一肿瘤至少注射5次，以使所述载体分布在整个肿瘤中。注射载体后48小时用前体药物处理所述动物，如上所述分析肿瘤。实施例20表达前体药物活化酶的巨噬细胞用标准方法从外周血分离初级人巨噬细胞。分析其P450和P450还原酶基因的表达。令人吃惊的是，它们表达P450还原酶而无P450表达。
构建含有CMV启动子(Ad.CMV)或低氧效应HRE启动子(ad.ObHRE)的腺病毒载体。将人细胞色素P4502B6基因插入这些载体中。在工程巨噬细胞中可检测到P450表达。用环磷酰胺处理所述巨噬细胞，与同样工程处理的其它细胞如肿瘤细胞不一样是，它们不被杀伤。然而，当将P450工程细胞加入至肿瘤细胞或三维肿瘤球体时，在存在环磷酰胺的情况下可杀伤它们。如果用标记蛋白(在此情况下为GFP)工程所述巨噬细胞时，则肿瘤细胞全部存活。推测因为组成型表达，所以Ad.CMV-P450的作用最为显著。然而，Ad.HRE-P450也引起明显的杀伤，说明可将肿瘤选择性施加于所述系统。实施例21 用工程表达人P450的巨噬细胞杀伤人肿瘤球体该试验结果示于图9。上面三个图显示用工程巨噬细胞处理但是未用环磷酰胺处理的肿瘤球体。所有的肿瘤边缘均是不连续的，而且外观为实体。下面三个图显示加入环磷酰胺的情况。采用Ad.CMV-P450巨噬细胞时，肿瘤球体完全被破坏，不能进行用于后续分析的处理。用Ad.HRE-P450的肿瘤球体更小、更弥散，处理时非常易碎。用Ad.CMV-GFP的肿瘤球体正常。特别给人留下深刻印像的是，肿瘤靶被Ad.CMV-P450完全破坏。
权利要求
1.一种前体药物活化剂，它包括a)一个定位结构域；和b)用于在靶细胞中活化前体药物的前体药物活化剂结构域；并且其中所述定位结构域不是肿瘤选择性的抗体。
2.权利要求1的前体药物活化剂，其中所述定位结构域包括细胞内或跨细胞定位结构域。
3.权利要求1的前体药物活化剂，其中所述定位结构域包括生化结合结构域。
4.权利要求1的前体药物活化剂，其中所述定位结构域包括化学结合结构域。
5.权利要求1的前体药物活化剂，其中所述定位结构域包括线粒体输入结构域。
6.任一前述权利要求的前体药物活化剂，其中所述前体药物活化结构域为是前体药物活化酶。
7.权利要求6的前体药物活化剂，其中所述前体药物活化酶是细胞色素P450或细胞色素P450还原酶。
8.权利要求7的前体药物活化剂，其中所述细胞色素P450是细胞色素P450 2B6。
9.任一前述权利要求的前体药物活化剂，它为融合蛋白形式。
10.权利要求1-8中任意一项的前体药物活化剂，它为编码所述定位结构域和前体药物活化结构域的核酸序列的形式。
11.一种前体药物活化剂，它包括至少一种编码细胞色素P450的可表达核酸序列，其中所述核酸序列或每种核酸序列操作性连接至一种或多种组成型表达控制调节元件或一种或多种诱导型表达控制调节元件。
12.一种前体药物活化剂，它包括含有至少一种编码前体药物活化剂结构域的可表达核酸序列的改进型造血干细胞(MHSC)，其中所述核酸序列或每种核酸序列操作性连接至一种或多种组成型表达控制调节元件或一种或多种诱导型表达控制调节元件。
13.权利要求12的前体药物活化剂，其中所述MHSC是巨噬细胞。
14.权利要求12或13的前体药物活化剂，其中所述核酸序列编码前体药物活化酶。
15.权利要求14的前体药物活化剂，其中所述前体药物活化酶是细胞色素P450或细胞色素P450还原酶。
16.权利要求15的前体药物活化剂，其中所述细胞色素P450是细胞色素P450 2B6。
17.权利要求11-16中的任意一项的前体药物活化剂，其中所述组成型表达控制元件是巨细胞病毒启动子。
18.一种核酸载体，它包含权利要求10-17中的任意一项中所定义的核酸序列。
19.一种病毒载体，它包含权利要求10-17中的任意一项中所定义的核酸序列。
20.权利要求19的病毒载体，其中所述病毒载体是反转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、痘病毒载体或痘伴随病毒载体。
21.权利要求20的病毒载体，其中所述病毒载体是慢病毒载体。
22.用于医药的权利要求1-17中的任意一项的前体药物活化剂、用于医疗的权利要求18的核酸载体或权利要求19-21中的任意一项的病毒载体。
23.药用组合物，它包括任选与药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体混合的权利要求1-17中任意一项的前体药物活化剂、权利要求18的核酸载体或权利要求19-21的病毒载体。
24.权利要求1-17中任意一项的前体药物活化剂、权利要求18的核酸载体或权利要求19-21的任意一项的病毒载体在生产治疗以下疾病的药物中的用途，所述疾病是肿瘤、炎症、动脉硬化血管和营养不良性肌纤维末端。
25.用权利要求1-17中任意一项的前体药物活化剂、 18的核酸载体或权利要求19-21的病毒载体转导的细胞。
26.用于权利要求1-11中任意一项的活化剂传递系统，其中所述传递系统包括一种或多种反转录病毒非病毒表达载体、腺病毒或质粒。
27.活化前体药物的方法，包括使靶细胞与前体药物在靶细胞可以摄取前体药物的条件下接触，使得所述前体药物在权利要求1-17中任意一项的前体药物活化剂定位时被活化。
28.产生病毒株的方法，该方法包括将权利要求10-16中所定义的核酸序列引入病毒基因组。
29.权利要求28的方法，该方法包括通过病毒基因组和 18所定义的载体之间同源重组将所述核酸序列引入病毒基因组。
30.产生权利要求12-16中任意一项的MHSC的方法，该方法包括将权利要求19-21中的任意一项的病毒载体引入造血干细胞。
全文摘要
一种前体药物活化剂,它包括:a)一个定位结构域和b)一个用于在靶细胞中活化前体药物的前体药物活化结构域。
文档编号C12N15/09GK1357048SQ99805649
公开日2002年7月3日 申请日期1999年3月5日 优先权日1998年3月6日
发明者I·J·斯特拉特福德, A·V·帕特森, S·M·金斯曼, O·坎, L·格里菲斯, K·米特罗法诺斯 申请人:牛津生物医学(英国)有限公司