一种同时检测食源性疾病病原菌的试剂盒的制作方法
【专利说明】
[0001]
技术领域
[0002] 本发明属于生物技术领域，涉及一种同时检测食源性疾病病原菌的试剂盒，具体 涉及一种同时检测沙门氏菌、志贺氏菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、副 溶血性弧菌检测试剂盒。
【背景技术】
[0003] 随着近几年越来越多的食品安全事故的暴光，食品安全问题已经成为一个中国广 大老百姓最为关注的热点问题。食源性疾病是食品安全的主要问题，世界卫生组织将食源 性疾病定义为："凡是通过摄食进入人体的，使人体患感染性或中毒性的疾病"。这里包括了 由食品微生物污染和化学性物质引起的食源性疾病。而微生物引起的食源性疾病是食品安 全的主要问题。呕吐腹泻型食物中毒事件是突发食物中毒事件中最为常见的情况。细菌性 呕吐腹泻型食物中毒事件主要由沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、小 肠结肠炎耶尔森菌、副溶血性弧菌等细菌感染引起。世界卫生组织2002年3月公布，全球每 年因食源性微生物污染引起的腹泻病例达到数十亿，死亡的0-15岁儿童约170万。在发达 国家至少有1/3的人患食源性疾病，在食源性疾病上花费达数十亿美元。近年来，国内外食 源性疾病事件也频频发生，如英国的疯牛病，日本的出血性大肠埃希氏菌0157 :H7和雪印 牛奶的葡萄球菌肠毒素中毒暴发，法国的李斯特氏菌中毒，1998年上海的甲肝大流行，1999 年苏皖等地引起的0157 :H7大规模暴发流行等等。WHO估计各国食源性疾病的漏报率在90% 以上，也就是说，每年公布细菌性食源性疾病事件对于其实际发生率来说只是冰山一角。
[0004] 因此，对食源性疾病的预防与控制已引起了世界各国关注。食源性疾病病原的检 测技术是食源性疾病的预防与控制关健的技术环节。目前我们国家虽然制定了相关的食物 中毒病原菌检验方法，但由于检测方法均采用的是经典的、耗时较长的检测方法，并且还存 在国内试剂供应不配套等问题，因此很难适应公共卫生事件应急处理快速反应的需要。随 着时代的进步，对检测方法的快速性、先进性、灵敏度和特异性等性能指标提出了更高的要 求。尤其是在遇到一些新的病原菌及病毒性食源性疾病的突发事件时，快速、灵敏、特异的 检测方法就显得更为重要。
[0005] 分子生物学检测技术的发展，尤其是荧光定量PCR检测技术的推广，为微生物食 物中毒快速检测提供了良好的技术平台。目前市场上使用最为广泛的是探针法荧光定量 PCR检测技术，它具有灵敏度高、特异性好、检测快速等优点。目前市场上也有相应的荧光定 量PCR检测试剂盒的推广，但是大都局限于1~3种细菌的同时检测，很难满足突发食物中 毒事件一管多检快速找出致病原因的检测需求。因此，有必要开发一种快速、简便、高通量 的多重荧光定量PCR食源致病菌检测方法。
【发明内容】
[0006] 发明目的：针对现有技术中的检测周期长、工序繁琐、灵敏度低、检测通量低等缺 点，本发明提供一种能快速准确地一次实验同时检测沙门氏菌、志贺氏菌、大肠埃希氏菌、 副溶血性弧菌、霍乱弧菌和小肠结肠炎耶尔森菌的检测试剂盒。
[0007] 技术方案：本发明提供的一种同时检测食源性疾病病原菌的试剂盒，所述食源性 疾病病原菌包括沙门氏菌、志贺氏菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、副溶 血性弧菌，所述试剂盒包含PCR反应液，所述PCR反应液包括分别独立的第一反应液、第二 反应液及稳定剂；其中，所述第一反应液包含分别以SsaR基因（沙门氏菌）、IpaH基因（志 贺氏菌）、ydij基因（大肠埃希氏菌）、ToxR基因（副溶血性弧菌）、hlyA基因（霍乱弧菌） 和gytB基因（小肠结肠炎耶尔森菌）为靶基因、并用于荧光定量PCR的SsaR、IpaH、ydij 、ToxR、hlyA和gytB基因的引物探针。
[0008] 作为优选，所述SsaR基因（沙门氏菌）的引物探针为： SsaR基因的引物： 1F:5，一GAACCTGGCCTGAAGACATAAA-3,（SEQ ID N0: 1)， 1R: 5' 一AGGTCAATAGCCAGAAAGGGA-3'（SEQ ID NO: 2)， SsaR基因的探针： 1A:5-(FAM)CCGGCTAACTGACTCACCGTAAATGCCGG(BHQ1)_3' （SEQ ID NO: 3); 1H:5-(HEX)CCGGCTAACTGACTCACCGTAAATGCCGG(BHQ1)_3' （SEQ ID NO: 4); 所述IpaH基因（志贺氏菌）的引物探针为： IpaH基因的引物： 2F: 5' 一TGAAGGAAATGCGTTTCTATG- 3'（SEQ ID N0: 5)， 2R: 5' 一AGGGAGAACCAGTCCGTAAA-3'（SEQ ID NO: 6)， IpaH基因的探针： 2A: 5 ' -(FAM)CACGGCCGAAGCTATGGTCAGAAGCCGTG(BHQ1)-3 '（SEQ ID NO: 7); 2X: 5 ' -(R0X)CACGGCCGAAGCTATGGTCAGAAGCCGTG(BHQ2)-3 '（SEQ ID NO: 8); 所述ydij基因（大肠埃希氏菌）的引物探针为： ydij基因的引物： 3F:5' 一ATTTGGCGAAAATGGCAGTAAC-3'（SEQ ID N0: 9)， 3R:5' 一CAGCTATTACGATGCGCAAGTG-3'（SEQ ID NO: 10)， ydij基因的探针： 3A:5'-(FAM) GGAAACCTAATTTTTCGACCAGACGGA (BHQl)-3， （SEQ ID NO: 11); 3Y5:5'-(CY5) GGAAACCTAAnTTTCGACCAGACGGA (BHQ2)-3，（SEQ ID NO: 12); 所述ToxR基因（副溶血性弧菌）的引物探针为： ToxR基因的引物： 4F:5' 一GAAGTTGTACGATTAGGAAGC-3'（SEQ ID N0: 13)， 4R:5' 一TGCTCACGCCAAACAAAC-3'（SEQ ID N0:14)， ToxR基因的探针： 4H:5'-(HEX) CCGCCCGTATACTCCTGATGTTGGCGG (BHQl)-3， （SEQ ID N0:15); 4X:5'-(R0X) CCGCCCGTATACTCCTGATGTTGGCGG (BHQ2)-3， （SEQ ID N0:16); 所述hlyA基因（霍乱弧菌）的引物探针为： hlyA基因的引物： 5F:5'一GCTTTATTGTTCGATGCGTTAAAC- 3'（SEQ ID N0:17)， 5R:5'一GATGCCAAAATTGTGCGTATCA- 3'（SEQ ID N0:18)，hlyA基因的探针： 5H:5'-(HEX) TCTTGGGCAATCGCATCGGITGA (BHQl)-3，（SEQ ID NO: 19); 5Y5:5'-(CY5) TCTTGGGCAATCGCATCGGITGA (BHQ2)-3，（SEQ ID N0:20); 所述gytB基因（小肠结肠炎耶尔森菌）的引物探针为：gytB基因的引物： 6F:5'一AAGAAGGCCTTCGGGTTGTAA-3'（SEQ ID N0:21)， 6R:5'一TTCTGCGAGTAACGTCAATCACA-3' （SEQ ID N0:22)，gytB基因的探针： 6X:5'-(R0X) ATTAACCTTTATGCCTTCCTCCTCGCTG (BHQ2)-3，（SEQ ID NO: 23); 6Y5:5'-(CY5) ATTAACCTTTATGCCTTCCTCCTCGCTG (BHQ2)-3，（SEQ IDN0:24)。
[0009] 作为进一步优选，所述第一反应液还包括不含镁离子的10Xbuffer、MgCl2、dNTPs 和灭菌超纯水，所述第一反应液各组分体积份数为： SsaR基因的引物： 25-50 yM的1F 0? 1-0. 2 份； 25-50 yM的1R 0? 1-0. 2 份； SsaR基因的探针： 25-50 y M的1A 0? 05-0. 15 份； 25-50 y M的1H 0? 05-0. 15 份； IpaH基因的引物： 25-50 yM的2F 0? 1-0. 2 份 25-50 yM的2R 0? 1-0. 2 份； IpaH基因的探针： 25-50 y M的2A 0? 05-0. 15 份； 25-50 y M的2X 0? 05-0. 15 份； ydij基因的引物： 25-50 yM的3F 0? 1-0. 2 份 25-50 yM的3R 0? 1-0. 2 份； ydij基因的探针： 25-50 y M的3A 0? 05-0. 15份； 25-50 y M的3Y5 0? 05-0. 15份； ToxR基因的引物： 25-50 yM的4F 0? 1-0. 2 份 25-50 yM的4R 0? 1-0. 2 份； ToxR基因的探针： 25-50 y M的4H 0? 05-0. 15份； 25-50 y M的4X 0? 05-0. 15份； hlyA基因的引物： 25-50 yM 的 5F 0? 1-0. 2 份 25-50 yM 的 5R 0? 1-0. 2 份； hlyA基因的探针： 25-50 y M 的 5H 0? 05-0. 15 份； 25-50 y M 的 5Y5 0? 05-0. 15 份； gytB基因的引物： 25-50 yM 的 6F 0? 1-0. 2 份； 25-50 yM 的 6R 0? 1-0. 2 份； gytB基因的探针： 25-50 y M 的 6X 0? 05-0. 15 份； 25-50 y M 的 6Y5 0? 05-0. 15 份； 不含镁离子的10 Xbuffer 2-4份； 25mM 的 MgCl2 2-4 份； dNTPs 2-4 份； 灭菌超纯水 4. 35-11. 25份。
[0010] 作为另一种优选，所述第二反应液包括DNA聚合酶、显色液和灭菌超纯水。
[0011] 作为进一步优选，所述DNA聚合酶为Taq酶，其浓度为5-10U/yl ;所述显色液为 溴酚蓝；所述第二反应液各组分体积份数为： 所述Taq酶 0? 15-0. 3体积份数； 溴酚蓝 0. 01-0. 02体积份数； 灭菌超纯水 1.68-1. 84体积份数。
[0012] 作为另一种优选，所述稳定剂为石蜡；第一反应液与第二反应液被稳定剂分隔开， 第一反应液位于稳定剂下方，第二反应液在稳定剂上方。
[0013] 作为另一种优选，所述试剂盒还包含DNA提取液、阴性对照液和阳性对照液； 所述 DNA 提取液为 0. 01-0. 02M 的 pH 7. 98-8. 02 的 Tris-EDTA 缓冲液，所述 Tris-EDTA 缓冲液含体积百分比为〇. 〇l%-〇. 02%的NP-40 ; 所述阴性对照液为不含沙门氏菌、志贺氏菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、小肠结肠炎耶 尔森菌、副溶血性弧菌基因组DNA的0. 01-0. 02M pH 7. 98-8. 02的Tris-EDTA缓冲液； 所述阳性对照液为含有沙门氏菌、志贺氏菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、小肠结肠炎耶 尔森菌、副溶血性弧菌基因组DNA的0. 01-0. 02M pH 7. 98-8. 02的Tris-EDTA缓冲液。 [0014] 本发明还提供了一种同时检测食源性疾病病原菌的方法，所述食源性疾病病原菌 包括沙门氏菌、志贺氏菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、副溶血性弧菌， 利用上述试剂盒进行荧光定量PCR检测。
[0015] 优选地，所述荧光定量PCR检测反应条件为： 50-55〇C ：2-5min ； 94-95〇C ：2-3min ； 94-95°C :5-10S，55-6(TC :40-80S，35-45 个循环。
[0016] 优选地，沙门氏菌用FAM和HEX两种荧光探针标记，志贺氏菌