专利名称：快速联检试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种快速联检试剂盒。
技术背景在转基因植物的研制开发或在对转基因产品进行筛选或安全性评价时，往往需要 对转入的外源性基因进行定性或半定量测定。有时还需要同时对几种外源性基因进行检 测。例如需要同时进行G2-EPSPS(5-烯醇丙酮莾草酸-3-磷酸合酶)蛋白编码基因(aroA) 和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)两种基因的检测。现有的检测装置，如酶免、放免等方法的装置，受仪器(酶标仪、放免闪烁仪、离心 机等)、场地等因素的限制，而且检测时间长，检测成本较高，很难推广应用。中国专利200520114588. X提供了一种联检EPSPS和BT蛋白的试剂盒，将送检物 品的提取液用分别滴加在试剂盒的两个加样孔中即可得到结果，虽然比起上述装置操作简 便、快速。但试剂盒的包装中还需要加样器或滴管等加样器械
实用新型内容
本实用新型的目的是建立一种操作更加简便、快速，不使用加样器即可进行快捷 检测转基因成分的联检试剂盒。本实用新型的技术方案是这样的—种快速联检试剂盒，包括底板、上盖，底板内表面有测试带，上盖有观测窗，底板 盖入上盖后组成试剂盒，其特征是当底板盖入上盖后，测试带的一端裸露出试剂盒一侧。当需要同时检测两种或多种转基因成分时，在底板内可置入多条不同的测试带， 且上盖设置相应数量的观测窗。底板的厚度不限，底板的上表面可以设置两条或多条可嵌入测试带凹槽，每个凹 槽可放置一条测试带。所述底板或上盖可具有卡槽，以保证底板与上盖扣紧。所述观测窗优选是长方形。试剂盒的形状是扁平的长方形盒。使用时，直接将裸露出试剂盒一端的测试带浸入待测样品液体，通过试剂盒上盖 的观测窗可直接观察到检测结果，每个观测窗可分别检查一种基因。本实用新型所述试剂盒的主要优点在于更方便快捷，无需加样器械，检测结果直观不借助任何仪器，用肉眼可观察到结果；应用广泛可检测玉米、棉花、水稻、小麦、烟草、大豆等各类农作物的叶片、种子及
加工产品。由于本实用新型提供的联检试剂盒检测快速，特别适用于转基因产品的研制开发 和转基因产品的快速筛选，可用于实验室、田间、边防、海关植物检验、检验检疫局、食品安 全检测及种子经营销售等部门对可疑样本现场、快速筛查。[0018]
以下结合附图和实施例，进一步举例说明本实用新型的技术内容。
图1和图2是本实用新型一种联检试剂盒的结构示意图，其中图1是底板的俯视 图，底板有两条测试带；图2是试剂盒上盖的俯视图，上盖有两个观测窗；图中，1是测试带，2是观测窗，T是测试区，C是质控区。
具体实施方式
实施例1 一种联检试BT-CrylAh的试剂盒本试剂盒底板内表面置入两条不同的测试带(1)，上盖设置两个观测窗(2)。每个 观测窗分为测试区(T)和质控区(C)两部分，可在上盖上用字母C、T标示出；所述底板内的两条测试带，一条用于检测G2-EPSPS，另一条用于检测BT蛋白。所 述测试带是一种具有检测系统主体膜反应体系功能的检测材料，由高分子纤维膜、塑料等 多层材料制成。两种蛋白的测试带均可分为质控区和检测区，质控区可包被羊抗鼠IgG或 兔抗鼠IgG多克隆抗体；G2-EPSPS蛋白测试带的样品检测区包被特异功能性G2-EPSPS，BT 蛋白测试带的样品检测区包被BT-Cry lAh的单克隆抗体或多克隆抗体。当外源基因转入植物，并在植物中表达，将产生目的蛋白(G2-EPSPS和 BT-CrylAh)，因此通过检测样品中是否含有上述两种蛋白来确定该基因是否存在。如果外 源基因转入植物，发生基因沉默，无目的蛋白产生，将不能达到预期目的(抗除草剂或杀 虫)。检测时，只需将试剂盒梳状装置浸入送检物品的提取液中，5秒内取出试剂盒平 放，5-10分钟后，肉眼就可以通过观测窗直接观察到准确的检测结果。试剂盒的详细制备方法如下(一 )制备测试带l.BT-CrylAh单抗腹水的制备小鼠腹腔注射液体石蜡0. 5mL。1周后，将BT-CrylAh单抗杂交瘤细胞注射于以上 预先处理过的BALB/C小鼠腹腔，每只小鼠注射杂交瘤细胞1 3X 106。10天后收获腹水， 以上过程皆在无菌条件下完成。2. BT-CrylAh单克隆抗体的纯化1)以DEAE离子交换层析及S印hacryl S 300分子筛对单抗进行纯化；SDS-PAGE 平板电泳检测纯化单抗的纯度；ELISA法测定单抗活性；2)纯化过程取小鼠单抗腹水一3，000 X g离心15分钟一上清液加50 %硫酸铵沉 淀，过夜一3，000 X g离心20分钟一沉淀溶于0. 01M磷酸盐缓冲液(pH 7. 2) — S-300凝胶 柱一DEAE Blue层析柱一0-800mM NaCl梯度洗脱一超滤离心，浓缩单抗；3)单抗纯度测定常规SDS-PAGE电泳，上述方法所纯化的单抗的纯度皆在95%以 上；4)蛋白浓度测定紫外分光光度计测定279nm处的0. D.值，按以下公式计算蛋白 含量0D279/1.4 = mg/mL (纯化单抗)。将单抗浓度调节为约lmg/mL ；[0036]5)单抗活性测定选用BT-CrylAh抗原包被ELISA板(lyg/孔)，及羊抗鼠 IgG-HRP复合物，测定各单抗效价(大于1 5000)。3.羊抗D0At高效价免疫抗血清的制备和纯化1)纯化好的上述单抗+完全佐剂一免疫山羊一加强免疫二次，每次间隔一月一第 二次加强后10天左右取血一离心取血清一硫酸铵沉淀一DEAE离子交换层析纯化；2)效价测定ELISA夹心法，抗体效价稀释度应大于1 256;3)蛋白浓度测定紫外分光法测定0D279，计算蛋白浓度。4.胶体金及金标抗体制备1)胶体金的制备以柠檬酸盐还原法制备40-60nm的胶体金。将0. 01 % HauCl4 加热至沸，加入一定量的柠檬酸三钠(Na3C6H507 *2H20)，继续加热煮沸5分钟，待胶体金 溶液颜色由兰一紫一红，稳定后，冷却即可。胶体金溶液应清亮透明，如需长期保存，可加入 0. 02% NaN3。2)将胶体金液500mL用0. 1M NaOH调pH8. 4，磁力搅拌下缓慢加入单抗2mL，搅拌 20分钟。5，500Xg离心30Min，除去上清液中未结合的蛋白质。离心后吸取胶体金标记抗 体沉淀，沉淀溶于10mL保存液中，用0. 45 y m微孔滤膜过滤。取样进行检定，其余置4°C保存。5.膜反应体系Ml的制备1)将BT-CrylAh抗体及纯化的羊抗鼠IgG以0. 1M磷酸盐缓冲液稀释，终浓度为约 0. 2-2mg/mL。2)纯化的羊抗鼠IgG溶于0. 1M磷酸盐缓冲液中，浓度为2. Omg/mL ；3)硝酸纤维素膜大小10cmX 27cm，每张膜可喷长25cm的检测及控制带各4条；4)将以上两种溶液分别加入Biodot XYZ3000喷涂机的二个喷头储存瓶中；5)设置喷速为2 u l/cm,NC膜的移行速度为50mm/s。以单抗BT_CrylAhAD2 (2mg/ mL)在NC膜上包被反应检测线，以1. 0mg/mL兔抗鼠IgG包被反应对照线，对照线与检测线 的距离为4-4. 5mm ；6)完成包被后，置37°C干燥箱24小时，用BB封闭液封闭处理半小时，用WB洗液 抽洗一次；7) 37 °C干燥箱干燥备用；8)切制备好的硝酸纤维素膜1. 8cmX27cm/条，放入铝薄袋中密封干燥保存。置
室温保存备用。6.膜反应体系M2a、M2b及M3的制备将吸水纤维膜分别浸泡于M2a、M2b、M3溶液中，浸透后，取出晾干，装入塑料袋中，
室温保存。l)M2a制备将制好的玻璃纤维切27cmX 1. 2cm/条；2)M2b制备将制好的玻璃纤维切27cmX 1. 8cm/条；3)M3制备将制好的玻璃纤维切27cmX 1. 2cm/条。7.膜反应体系M4的制备1)取胶体金-单抗复合物加稀释液，混勻配成工作浓度；
0060]2)将溶液加入喷涂机Biodot的Air jet喷头储存瓶中；[0061]3)设定压力为15PSI，玻璃纤维膜的移动速度为50mm/s ；4)喷制规格为0. 5-1. 5cmX 25cm/条，每条喷2遍；5)于37°C烘干12小时，放入铝薄袋中，加入干燥剂，热合封口，室温保存。8.反应体组装1)在M6塑料基板上贴双面胶带M7 二条；2)在M7中间贴反应膜Ml (18mm)，离M6上缘约22mm ；3)在M7上贴M5 (22mm)，与M6上缘对齐并与Ml上缘交；4)在M7上贴M2a (12mm)，与Ml下缘相接；5)在 M2 上贴 M4 (10mm)，压住 Ml 下缘 0. 5mm ；6)在 M7 上贴 M3 (12mm),上缘压住 M4 约 2/3 ；7)在M7上贴M2b (18mm)，上缘压住M4约2/3，下缘与M7的下缘对齐；8)在M4和M7上贴透明保护胶带M8，上缘完全压住M4，并压住Ml约1. 5mm ；9)在M5上贴彩色标记胶带M9，与Ml上缘交1mm，另一端翻过M6上缘，贴于M6被10)将组装成型的反应体用全自动切条机切成3. 5mm规格。( 二)装配试剂盒将制备好的检测G2-EPSPS和检测BT_CrylAh蛋白的两种测试带分别嵌入底板的 两个凹槽中，然后将上盖与底板扣紧，使测试带从试剂盒一端裸露出盒外。即成试剂盒。(三)试剂盒使用过程1.检测样本处理及准备植物种子、叶子、籽苗等样本在检测前需经研磨，并以蒸馏水抽提和稀释。为获得 最佳检测效果，各不同样品应根据下表中的比例稀释，在完成研磨和稀释后，将样本混勻， 静置，取上清液作为检测样品。 2.检测及结果将试剂盒梳状装置浸入送检植物样品的提取液中，5秒内取出试剂盒平放，吸水材 料使待检样品缓慢移动，膜反应体系被启动。5-10分钟后，肉眼就可以通过观测窗直接观察 到准确的检测结果。无论待测基因是否存在于植物样品中，一条紫红色条带都会出现在质 控区内(C)。质控区内(C)所显现的紫红色条带是判定是否有足够的植物样品液，层析过程 是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。3.结果判定对于每个观测窗来说，用以下方式判断检测结果[0085]1、阴性(-)反应状况观测窗质控区(C)出现一条紫红色条带。检测结果待检样品中不含待检基因或其含量在其阈值以下。2、阳性(+)反应状况观测窗质控区(C)出现一条紫红色条带，在测试区(T)内同时出现紫红 色条带。检测结果待检基因含量在阈值以上。3、无效反应状况质控区(C)未出现紫红色条带，检测结果表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏。每一个观测窗检测一种待检基因是否存在。以下以检测BT-CrylAh为例说明1)如样本中不含特定BT-CrylAh蛋白，或其浓度低于检测灵敏度，胶体金抗体在 层析过程中不会被固定在膜上检测带内的单抗免疫，因而测试区内(T)不会出现一条紫红 色检测带，显示阴性(_)结果，即仅在质控区(C)内出现一条紫红色条带。2)如果待植物样品中BT-CrylAh蛋白浓度高于其检测阈值时，抗原免疫金与检测 带上的另一单抗结合，在测试区内(T)将还出现另一紫红色检测带，显示阳性(+)结果，即 在质控区(C)和检测区内各出现一条紫红色条带。注意测试区(T)内的紫红色条带可显 现出颜色深浅的现象。但是，在规定的观察时间内，不论该色带颜色深浅，都应判定为阳性 结果。3)如质控区(C)未出现紫红色条带，则检测结果无效，表明不正确的操作过程或 试剂盒已变质损坏。
权利要求快速联检试剂盒，包括底板、上盖，底板内表面有测试带，上盖有观测窗，底板盖入上盖后组成试剂盒，其特征是当底板盖入上盖后，测试带的一端裸露出试剂盒一侧。
2.根据权利要求1所述的快速联检试剂盒，所述测试带数量是两条或两条以上；所述 观测窗数量是两个或两个以上。
3.根据权利要求1或2所述的快速联检试剂盒，其特征在于所述底板的上表面设置有 两条或两条以上凹槽，每个凹槽可嵌入一条测试带。
4.根据权利要求1或2所述的快速联检试剂盒，其特征在于所述底板或上盖具有卡槽。
5.根据权利要求1或2所述的快速联检试剂盒，其特征在于所述观测窗是长方形。
专利摘要本实用新型涉及一种快速联检试剂盒，包括底板、上盖，底板内表面有测试带，上盖有观测窗，底板盖入上盖后组成试剂盒，其特征是当底板盖入上盖后，测试带的一端裸露出试剂盒一侧。本试剂盒操作简便，不需要加样器械，检测样品时，直接将试剂盒一端浸入送检样品的提取液中，5秒内取出平放，5-10分钟后就可以通过肉眼观测窗直接观察到检测结果。
文档编号G01N33/577GK201600374SQ20102011657
公开日2010年10月6日 申请日期2010年2月11日 优先权日2010年2月11日
发明者刘奇, 张维, 李亮, 林敏 , 郑建, 陆伟 申请人:中国农业科学院生物技术研究所