专利名称：使用超声诱导的报道分子构建体转染的体内表达分析的制作方法
使用超声诱导的报道分子构建体转染的体内表达分析 发明领域
学和化学领域中，更特别地在诊断学领域中。本发明特别涉及体内表达 分析。
背景技术：
基因调节的研究是生物科学的急速增长的学科。很长时间以来已了
解基因(编码和非编码)转录成RNAs在大多数情况下受紧在编码区5， (或"上游")的非编码调节区控制。DNA的这些非编码序列包含决定其 中基因在生物的寿命过程中表达的条件(何时、何地和在何种外部刺激 下)的序列模式。这些非编码序列由转录因子(其依赖于其功能通常称 为增强子或阻遏物)结合，所述转录因子随后募集后生调节物和其它蛋 白，它们形成较大复合物且对靶转录物的表达施加控制。理解基因调节 的机制是理解疾病进展以及来自对最复杂的生物过程最基础的一切的 基础。
经过数年，已设计了许多方法以研究在调节和表达水平上的基因表 达。在个体水平上，基因表达通常使用称为逆转录酶聚合酶链反应
(RT-PCR)的技术非常可靠地进行测量。为了平行测定数千种基因的 表达分析，已采用诸如微阵列、基因表达系列分析(SAGE)和大量平 行标记测序(MPSS)的技术。为了推断基因表达的模式，已开发了许 多方法以统计分冲斤。
缺点是所有这些方法要求包含目的RNAs的组织或细胞的物理分离 和破坏。这使得基因表达的研究变得昂贵和劳力密集。研究随时间的基 因表达是特别复杂的，因为需要获得许多样品且使样品中的所有细胞的 基因表达同步。最重要的是当样品用各种试剂进行处理时，不能避免使 细胞"休克"，这使表达模式不正常。因此将希望手中具有体内表达分析 系统。然而，以无侧面介导的表达发生的方式将表达系统带进器官或甚 至组织内也是问题，这必须应对以直接和有效方式转染所述载体的问 题。因此，还需要关于与此种表达分析系统组合的实际和有效的载体送 递方法。通过常规注射针方法的载体注射的主要问题是载体材料必须大 量注入耙位点内，这是由于将载体材料扩散到细胞的核内的尝试的无效 率和酶系统立即移动以破坏注入的载体核酸分子的问题。例如，使用注
射针的治疗注射技术已相对緩慢地进展。
例如，阳离子脂质体已广泛用于体内基因转移到内皮细胞内
(Brigham， K.B.等人(1989 ) Am. J. Med. Sci. 298, 278-281; Hofland, H.E丄等人(1997) , Pharm. Res. 14， 742-749; Liu, F.等人(1997), Gene Therapy 4, 517-523; Mahato, R. I.等人(1998) , Hum. Gene. Ther. 9, 2083-2099; Rolland, A. P. ( 1998 ) , Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 15,1 43-198)。由于缺乏靶细胞特异性和低体内基 因转移效率，目前基于阳离子脂质体的系统用于靶向肿瘤内皮的用途是 有限的(Lesoon-Wood, L.A.爭乂( 1995 ), Hum. Gene. Ther. 6, 395-405; Anwer等人(Human gene Therapy, 提交的))。
已提出通过共价缀合单克隆抗体或其它靶向部分(例如，特异性肽 和脂质)修饰脂质体表面，以改善肺瘤特异性基因送递(BouIikas， T.
(1996 ) ， Int. J. Oncol. 9， 941-954; Kong, H丄.和Crystal, R.G. ( 1998 ), J. Natl. Cancer Inst. 90,273-286; Pietersz, G.A.和McKenzie， I.F.C.( 1992 ), Immunol. Rev. 129, 57-80; Thorpe, P.E.和Derbyshire, EJ. ( 1997), J. Cont. Release 48, 277-288; Kircheis, R.等人(1997) , Gene Therapy 4， 409-418 )。
机械法例如电穿孔和喷射注射已描述为增强靶组织中的基因转移 的有用外部方法(Gallo, S.A.等人(1997) ， Biophys. J. 72, 2805-2811 )。
超声介导的送递具有作为用于将治疗化合物增强且靶向施用到细 胞和组织内以及经过细胞和组织施用的有效新方法的潜力。超声增强的 对细胞的送递已通过将细胞外液、药物和DNA摄取到细胞内在体外得 到证实(Lm, J.爭乂( 1998 ) ， Pharm. Res. 15, 918-924; Mitragotri，等 人(1996) , Pharm. Res. 13, 411-420; Wyber, J.A.等人(1997) , Pharm. Res. 14, 750-756; Tata, D.B.，爭乂 ( 1997) ， Biochem. Biophys. Res. Commun. 234， 64-67)。
发明概述
6数据证实用于表达分析的组合物的超声送递使得能够在不存在外源效 应子物质的情况下以及在提供外源效应子物质后在体内分析基因表达， 所述组合物包含孩￡泡以及哺乳动物表达载体系统，所述外源效应子物质 例如致热原、药物化合物、药物前导化合物、变应原、自身免疫原、毒 素、多克隆抗体、单克隆抗体、抗原、脂质、碳水化合物、肽、蛋白、
蛋白-复合物、氨基酸、脂肪酸、核苷酸、DNA、 RNA、 PNA、 siRNA 和摆i小RNA。
本发明涉及用于特异性查询"X"的表达分析的组合物，其包含(a) 包含封装遗传有效负载或与遗传有效负载締合的微泡的载体，(b)包 含下述的遗传有效负载(i)处于将确保在体内的组成型表达的启动子 控制下的荧光报道基因，(ii)处于非组成型表达的启动子控制下的第 二荧光报道基因，(v)第一荧光报道基因的启动子和(vi)在"X"的体 内状态下条件激活的第二荧光报道基因的启动子，(c)与微泡载体相 互作用的超声装置，以便释放有效负载、和/或增强其经由细胞的4聂取、 和/或增强其在细胞中的表达，和(d)对第一和第二报道基因的表达水 平定量，并且由结果推断关于查询"X"的相关回答的读出装置或方法。
因为所述询问对动物或患者实施最低限度水平的创伤，所以 一旦遗 传有效负载从靶组织或细胞中消失(一般为数天)，就可以重复表达分 析。如果超声装置可以局部触发微泡载体，那么查询"X"可以几乎立即 在先前未询问的相似组织或细胞中重复。任一方式，暂时可重复性是本 发明的独特益处。
因为遗传有效负载的表达可以用超声装置在大多数动物抹和物种 的大多数软组织中激活，所以可以执行表达分析而不局限于特別地遗传 工程化的动物。对于大多数动物的基本上通用的可应用性是本发明的另 一个独特益处。
如本文所使用的，术语"微泡"指平均尺寸小于10 pm ( 1-3 pm是最 典型的)的乳化的稳定化泡。特别的气体， 一般是高分子量的惰性气体 例如0^10和SF6封装在这些泡中，以使体内稳定性增至数分钟到数小 时级别。泡壳由脂质、多糖、白蛋白或其它聚合物制成。特定制造步骤 和增强，阻止了泡的聚集(簇集)和融合(合并)。此外，通过使聚乙 二醇(PEG)或其它生物学"隐蔽"分子附着于壳，使泡成为非免疫原性
7的。几种诊断产物目前用于心脏、放射学和肿瘤学背景中的超声成像。 使分子配体与这些泡附着用于分子成像，目前在研究阶段中。封装、附 着或締合治疗分子，包括常规药物和遗传物质也作为新方法进行研究， 以送递局部干预同时使全身副作用降到最低。
如本文所使用的，术语"表达载体系统"指由遗传物质(即，核酸) 构成的构建体。它包括这样排列的遗传元件，即，使得插入的编码序列 可以在真核细胞中转录。同样，尽管质粒可以包括来自病毒核酸的序列， <旦此种病毒序列优选不引起质粒^参入病毒颗粒内，并且质粒因此是非病
毒载体。优选地，此种载体是闭合环状DNA分子。如本文所使用的， 表达载体指包含设计用于直接转化粑细胞的遗传物质的构建体。它优选 包含邻接的DNA或RNA片段，所述片段与其它必需元件定位且顺次定 向，使得核酸可以在转染的细胞中转录并且必要时翻译。
如本文所使用的，术语"转染促进剂"指与上文描述的载体形成复合 物的试剂。这种分子复合物以共价或非共价方式与载体分子締合。转染 促进剂应能够以稳定状态转运核酸分子并且将结合的核酸分子释放到 细胞内。此外，转染促进剂可以阻止核酸分子经由胞内体裂解的溶酶体
至核膜且进入核内，并且提供保护作用。
在一个实施方案中，转染促进剂是非缩合聚合物、油和表面活性剂。 已发现非缩合聚合物特別适合于注入所需表达位点内例如在瘤内施用 中。当表达载体需要延长定位时，这些可能适合于使用。在某些情况下， 具有例如根据本发明的表达载体的持续释放可能是有用的。因此，下述 化合物中的某些可能在本发明的上下文中是有用的聚乙烯吡咯烷酮； 聚乙烯醇；丙二醇；聚乙二醇；聚乙酸乙烯酯；泊洛沙姆(Pluromcs) (环氧丙烷和环氧乙烷的嵌段共聚物，两种亚单位的相对量在不同泊洛 沙姆中可能不同)；泊洛沙胺(poloxammes ) ( Tetromcs );乙烯乙酸 乙烯酯；纤维素，包括羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟 丙基曱基纤维素的盐；透明质酸盐；海藻酸盐；杂多糖(果胶)；磷脂 酰胆碱(卵磷脂)；miglyols;聚乳酸；聚羟基丁酸。
在另一个实施方案中，阳离子缩合剂例如阳离子脂质、肽或脂肽， 或例如右旋糖普、壳聚糖、树枝状聚合物、聚乙烯亚胺(PEI)或聚赖 氨酸，可以与本发明的载体締合，并且可以促进转染和与超声靶-微泡破坏结合。
化合物(PINC),并且其它的是持续释放化合物，同时某些可以以任一方式在分别合适的条件下使用。
PINC增强核酸分子，即本发明的载体对哺乳动物细胞的体内送递，
并且优选地，核酸分子，即载体包括编码序列，如将在下文对于待在所述细胞中表达的基因产物的启动子更详细地概述的。
根据本发明的表达载体还可以与由 一种或多种阳离子脂质形成的
脂质体复合。优选地，阳离子脂质是DOTMA,并且中性辅脂质是胆固醇(chol) 。 DOTMA是1,2-二-0-十八烯基-3-三甲铵丙烷，这在于1990年1月30日授权的Eppstem等人，美国专利4,897,355中描述且讨论，所述专利引入本文作为参考。然而，其它脂质和脂质组合也可以在其它实施方案中4吏用。各种此种脂质在Gao和Huang, 1995, 7T^ra/7z;y2: 710-722中描述，所述参考文献在此引入作为参考。
因为阳离子脂质和DNA的电荷比也是重要因素，所以在优选实施方案中，DNA和阳离子脂质以使得负和正电荷比是约1: 3的量存在。因此，优选地，组合物的电荷比是约l: 1至1: 10,更优选约1: 2至1: 5。
术语"阳离子脂质，，指在生理学pH下具有净正电荷，并且优选在此种pH下不携带负电荷的脂质。此种脂质的 一 个例子是D O TMA 。
如本文所使用的，术语"声致穿孔(sonoporation)装置，，涉及能够通过超声工具引起核酸分子，即本发明的载体摄入生物的细胞内的仪器。细胞膜因此可以失稳定并且导致在细胞膜中形成通道或孔。声致穿孔装置类型不视为本发明的限制方面。声致穿孔装置的主要重要性事实上是该装置将配制的核酸分子，即本发明的载体送递到生物的细胞内的能力。
如本文所使用的，术语"生物，，指本领域普通技术人员的通常使用。生物可以包括微生物例如酵母或细菌、植物、鸟类、爬行动物、鱼类或哺乳动物。生物可以是伴侣动物或驯养动物。优选地，生物是哺乳动物。优选的哺乳动物包括小鼠、大鼠、黑猩猩、犬和在临床研究中使用的其它哺乳动物。
本发明的表达载体在人类中的使用将依赖于它的诊断或治疗应用是否是可能的。术语"荧光报道基因，，指能够表达这样的蛋白的基因，所述蛋白用必需波长激发时，能够发荧光或产生光。
为了本发明的目的，荧光报道基因可以是产生这样的蛋白的任何基因，所述蛋白用合适的波长激发时，导致发出可以检测出的光信号。在
一个优选实施方案中，来自本发明的荧光蛋白的发射谱为445-660 nm、550-660 nm,并且最优选550-660謹。
此外，在一个优选实施方案中，本发明的荧光蛋白具有高于0.10、优选高于0.20、更优选高于0.40、最优选高于0.50且最优选高于0.60的量子产额。由于更佳的体内结果，量子产额以及550-660 nm的发射谱已在本发明中显示具有极大优点。
术语"哺乳动物复制起点"、"细菌复制起点"、"启动子，，以及"遍在"表达的，在本文中指本领域普通技术人员的通常使用。
附图简述
附图显示本发明的原理(图1 )以及它的一个优选实施方案(图2)。实施方案详述
本发明人已令人惊讶地发现通过使用用于表达分析的组合物，可以执行体内表达分析，所述组合物包含(a)微泡，(b)包含下述成分的哺乳动物表达载体系统(i)处于将确保在体内的组成型表达的启动子控制下的第一焚光报道基因，(ii)处于非组成型表达的启动子控制下的第二荧光报道基因，(in)哺乳动物复制起点，(iv)细菌复制起点，(v)第一荧光报道基因的启动子，和(vi)可激活且无遍在表达的第二荧光报道基因的启动子。在一个优选实施方案中，哺乳动物载体系统包含一种或多种另外的焚光报道基因，其处于非组成型表达的启动子控制下。
在一个优选实施方案中，所述第二或另外的荧光报道基因的启动子来源于本发明的表达载体系统穿梭到其内的生物。
进一步地，优选一种或多种另外的荧光报道基因处于非组成型表达的启动子控制下。
例如，启动子可以来源于激素基因、细胞因子基因、胰岛素基因、白介素基因、促生长素基因、促红细胞生成素基因、干扰素基因，特别是促红细胞生成素-a、干扰素-y、干扰素-a以及来自粒细胞巨噬细胞刺 激因子(GM-CSF)的促红细胞生成素-a。千扰素、纤溶酶基因激活物、 葡糖脑苷脂酶基因、降钓素基因、生长因子基因、参与甲/乙/丙/丁/戊型 肝炎的基因以及参与例如人疾病的任何其它基因。例如，启动子可以来 源于参与癌症发展的基因。此种基因可以是例如细胞周期控制基因、肿 瘤抑制基因、参与凋亡的基因等。
本发明人已发现通过在第二或另外的启动子在载体系统上的表达 位点处将此表达载体系统带进组织内，首次能够解决例如在基因表达方 面的体内药物开发问题。
在一个优选实施方案中，第一荧光报道基因选自编码绿色荧光蛋 白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、去 稳定的绿色荧光蛋白的基因。第二或另外的荧光报道基因选自编码绿色 荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋 白和去稳定的绿色荧光蛋白的基因。
在一个优选实施方案中，第一荧光报道基因的启动子选自巨细胞病 毒启动子(CMV) 、 CMV-正、编码转录启动子LTR的HIV-1长末端重 复序列(LTR) 、 SV40IE、 HSVtk、卩-肌动蛋白、人珠蛋白ct、人珠蛋 白卩和人珠蛋白y启动子。
在一个优选实施方案中，微泡介质包含选自游离气泡、稳定化的气 泡、胶体悬浮液、乳状液和水溶液的介质。
在一个优选实施方案中，微泡介质是包含十二氟代戊烷的胶体悬浮液。
在一个特别优选的实施方案中，微泡介质是包含超声处理的白蛋白 的水溶液。
如上所述，本发明的绿色荧光蛋白可以是绿色荧光蛋白、蓝色荧光 蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色和红色荧光蛋白中的任何。 其它荧光蛋白也是可能的。然而，某些荧光蛋白是优选的。
在选择绿色荧光蛋白的情况下，它优选选自EGFG、 AcGFP、 TurboGFP、 Emerald 、 Azani Green和ZsGreen。
在选一奪蓝色荧光蛋白的情况下，它优选选自EBFP、 Sapphire和 T-Sapphire。
选择青色荧光蛋白，可以从ECFP 、 mCFP 、 Cerulean 、 CyPet、 amCyan 1 、Midori画Ishi Cyan和mTFPl (Teal)中选择蛋白。
还可以选择黄色荧光蛋白，在这种情况下，可以从EYFP、 Topaz、Venus、 mCitrine、 Ypet、 PhiYFP、 ZsYellol和mBanana中选择蛋白。
当选择橙色或红色荧光蛋白时，优选地，蛋白选自Orange 、 mOrange、dTomato、 dTomato-Tandem、 DsRed、 DsREd2、 DsRed-Expresss ( Tl )、DSRed-Monomer、 mTangerine、 mStrawberry、 AsRed2、 mRFPl、 Jred、mCherry、 HcRedl、 mRaspbeny、 HcRed-Tandem、 mPlum禾口 AQ143。
荧光蛋白的选择显示于表1中。炎^f
最大激最大发
蛋白摩尔消光系量子产体内结相对亮度
发射
(简称)数额构(EGFP % )
(nm)(nm )
GFP ( wt)395/47550921,0000.77单体*48
绿色荧光蛋白
EGFP48450756,0000.60单体*100
AcGFP48050550,0000.55单体*82
TurboGFP48250270,0000.53单体*110
Emerald48750957,5000.68单体*116
Azmni Green49250555，00()0.74单体121
ZsGresn49350543,0000.91四聚体117
蓝色荧光蛋白
EBFP38344529,0000.31单体*27
Sapphire39951129,0000.64单体*55
T-Sapphire39951144,0000.60单体*79
青色荧光蛋白
ECFP43947632，5000.40单体*39
mCFP43347532,5000.40单体39
Cerulean43347543,0000.62单体*79
12CyPet 435
AmCyanl 458
Midoriishi Cyan 472
黄色荧光蛋白
EYFP 514
Topaz 514
Venus 515
mCitrine 516
YPet 517
PhiYFP 525
Zs Yellow 1 529
mBanana 540
橙色和红色荧光蛋白
Kusabira Orange 548
mOrange 548
dTomato 554
dTomato-Tandem 554
DsRed 558
DsRed2 563
DsRed-Express ( Tl ) 555
DsRed-Monomer 556
mTangerine 568
mStrawberry 574
AsRed2 576
mRFPl 584
JRed 584
mCherry 587
HcRedl 588
477 35,000 489 44,000 495 27,300
0.51 单体* 53 0.24 四聚体31 O.卯 二聚体73
527
527
528
529
530 537 539 553
559 562 581
581
583
582
584 586
585 596 592 607 610 610 618
83,400
94,500
92，200
77,000
104,000
124,000
20,200
6,000
51,600
71,000
69,000
138,000
75,000
43,800
38,000
35,000
38,000
90,000
56，200
50,000
44，0()0
72,000
20,000
0.61 0.60 0.57 0.76 0.77 0.39 0.42 0.7
0-60 0.69 0.69 0.69 0.79 0.55 0.51 0.10 0.30 0.29 0.05 0.25 0.20 0.22 0.015
单体* 单体*
单体*
单体
单体*
单体*
四聚体
单体
单体
单体
二聚体
单体
四聚体
四聚体
四聚体
单体
单体
单体
四聚体
单体
二聚体
单体
二聚体
151 169 156 174 238 144
25 13
92
146
142
283
176
72
58
10
34
78
8
37
26 47 1
13mRaspberry59862586,0000.15单体38
HcRed-Tandem590637160,0000.04单体19
mPlum柳649,41,0000.10单体12
AQ143595655卯,OOO0.04四聚体11
在一个优选实施方案中，本发明的组合物包含编码两种或更多荧光
蛋白的两种或更多基因，并且这些蛋白发出相差至少20nm、 30nm、 40 nm、 50nm、 60 nm、 70 nm或优选80 nm或更多的发射谦。理想地，当 使用两种或更多荧光蛋白时，以使得发射谱不重叠的方式执行蛋白的选 择。因此，在一个优选实施方案中，当使用例如3种荧光蛋白时，3种 蛋白各自的发射谱分开至少20 nm、优选30nm或更多。明显地，当使 用4种或更多荧光蛋白时，由于具有有限量的发射谱的可用蛋白的数目， 仅能够具有可能20nm、 30 nm或40 nm的分离。然而，当使用仅两种 荧光蛋白时，可以使蛋白分开例如80nm的发射谱。
同时，编码两种或更多荧光蛋白的两种或更多基因编码以下荧光蛋 白是重要的，所迷蛋白显示出60%、 80%、 100%、 120%、 160%、 180 %或优选更多的相对亮度，所述相对亮度是以增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)的百分比表示的。因此，本发明人已发现尽管两种或更多荧光 蛋白的发射谱分离是重要的，但选择的荧光蛋白显示出使得能够在体内 使用的相对亮度同样是重要的。
在本发明的一个方面，本发明涉及组合物，其中组合物另外包含选 自转染促进剂的物质。
在一个优选实施方案中，本发明的组合物具有已封装哺乳动物表达 载体系统的微泡。在任何情况下，在其应用于生物前必须已封装哺乳动 物表达载体系统。
本发明还涉及用于体内表达分析的方法，其包括以下步骤(a) 提供本发明的组合物，(b)将(a)的组合物应用于生物、目的组织或 器官，(c)步骤(b)的组合物在目的组织或器官位点处用声致穿孔装 置的超声靶微泡破坏，(d)通过应用光源激发由两种或更多报道基因 编码的两种或更多蛋白中的至少一种，其中光源发出具有与两种或更多
14荧光蛋白的激发范围或优选最大激发相应的波长的光，(e)第一荧光
报道基因的表达的检测，(f )第二或另外的荧光报道基因的表达的检测， 和任选地(g)重复步骤(d)至(f)。
在根据本发明用于体内表达分析的方法的一个优选实施方案中，该
方法另外包括以下步骤(a)在步骤(d)至(f)的第一次重复前将潜 在的效应子物质应用于生物，其中所述效应子物质被认为可能诱导第二 或另外的报道基因的转录。在本发明的这个实施方案中，首次可能在应 用潜在的效应子物质后在体内分析生物的表达反应。显而易见的是，此 种物质可以例如是药物化合物或药物前导化合物。因此，在本发明的这 个应用中，可以测试例如给定药物候选物的有毒副作用。将例如具有表 达载体系统，其具有目的免疫学基因的启动子，所述基因已知产生有毒 副作用，例如某些白介素或细胞因子，其当表达时，导致严重的免疫学 副作用。随后，将应用作为效应子物质的药物候选物，并且在体内测试 第二或另外的报道基因是否被诱导且因而导致光发射，所述报道基因处 于白介素或细胞因子启动子控制下。因此，本发明首次允许在待分析药 物前导化合物的有毒副作用的情况下的体内表达分析。
然而，在一个优选实施方案中，可以选择众多不同的效应子物质。 因此，这些可以选自例如致热原、药物化合物、药物前导化合物、过每文 原、自身免疫原、毒素、多克隆抗体、单克隆抗体、抗原、脂质、碳水 化合物、肽、蛋白、蛋白复合物、氨基酸、脂肪酸、核苷酸、DNA、 RNA、 PNA、 siRNA和孩i小RNA。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及本发明的组合物用于诊断 和/或治疗的用途。本发明还涉及包含根据本发明的组合物的试剂盒。
在一个实施方案中，本发明涉及用于体内表达分析的方法，其包括 步骤提供根据本发明的组合物，将(a)的组合物应用于生物、目的 组织或器官，步骤(b)的组合物在目的组织或器官位点处用声致穿孔 装置的超声耙微泡破坏，通过应用光源激发由两种或更多报道基因编码 的两种或更多蛋白中的至少一种，其中光源发出具有与两种或更多荧光 蛋白的激发范围或优选最大激发相应的波长的光，第 一荧光报道基因的 表达的检测，第二或另外的荧光报道基因的表达的检测，其中第二荧光 报道基因的启动子是磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因的启动子。实施例
II型糖尿病胰岛素抗性
II型糖尿病胰岛素抗性引起血液中的葡萄糖水平变得异常高。这因 为胰岛素信号传递途径受损而发生；功能性胰岛素信号传递正常地将导
致血糖水平的稳定。在n型糖尿病中，起因于进食的增加的胰岛素水平 无法触发胰岛素信号传递途径。胰岛素生产其自身减少也是可能的。在 任一情况下，尽管近期消化的食物的葡萄糖很丰富的事实，这种失败允 许肝和脂肪组织的细胞持续将脂质和糖原转储存换成葡萄糖。这是异常 高的血糖水平是如何达到的。因此，感兴趣的将是鉴定在肝和脂肪组织 中减少糖原和脂质转换成葡萄糖的化合物。
许多途径在细胞代谢调节中起作用。与胰岛素信号传递直接连接的
占优势途径是PI3K/Akt途径。这个途径直接调节称为FOXO的转录因 子家族的活性。当胰岛素水平在健康个体中很低时，PI3K途径被灭活。 这种灭活允许转录因子FOXO家族定位至核，并且调节参与代谢和其它 过程的各种耙基因。这些耙基因中的许多促进碳水化合物和脂质分解成 葡萄糖。这些粑基因之一，即磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)主要通 过FOXO家族成员FOXOl上调。尽管可以选^^其它基因，^f旦经由通过 FOXO1调节与胰岛素信号传递级联的这种关联和这种基因直接参与代 谢，使得PEPCK成为功能性胰岛素途径活性特别有用的"报道分子"。 当胰岛素信号传递活性高时，PEPCK表达被阻遏，当胰岛素信号活性低 时，PEPCK表达被激活。
报道分子构建
任何合适的哺乳动物表达载体可以用作"骨架"用于报道分子构建。 最低限度，这种载体必须与可选细菌标记一起复制。合适骨架的例子将 是商购可得的。例如可从Promega获得的phRG-B或pCAT⑧3-Basic。
使用标准基因工程技术，修饰所选择的骨架以包含4种必需元素。 A)用作对照的荧光报道分子。这是将组成型表达且充当成功转染的可 见标记的报道分子。B)将处于在研究中的启动子或调节区控制下的荧 光报道分子。C)将驱动组成型表达的荧光报道分子的表达的启动子。 克隆在组成型表达的启动子的上游。D)在研究中的、克隆在荧光报道 分子上游的启动子或调节区，其选作实验输出。理想地，对照荧光报道分子应是荧光报道分子的稳定、长寿变体， 其具有显著不同于用于研究的报道分子的激发和发射光谱。 一个例子是
商购可得的.来自 Clontech的 DsRed Monomer (可在载体 pDsRed-Monomer中获得)。"研究"报道分子的选择可以依赖于除光镨 性质外的许多因素。因为本文的主要应用是基因表达的测量，所以去稳 定的荧光蛋白是优选的。这将显著增加更新速度，这将允许更敏感检测 影响表达的调节转变。然而，更新速度不能太高，以至于可检测水平的 荧光无法累积——可检测通过成像仪器的灵敏度和通过超声达到的转 染效率限定。 一种合适的蛋白是在美国专利6,306,600中描述并且在载 体pZsGreenl-DR中从Clontech商购可得的去稳定的GFP。用于组成型 表达的报道分子的启动子的选择也是重要的，并且将控制通过对照报道 分子达到的表达水平。理想地，这种启动子应在研究中的生物的组织中 遍在表达，并且一般以^氐和稳定的水平表达。表达在本文中应充分调整 以提供成功转染的细胞的可靠检测。对于强表达，可以使用遍在表达的 CMV启动子。对于更适度的表达，可能是具有非常稳定、适度和遍在 表达的启动子p-肌动蛋白或某些其它基因。在这个具体实施方案中，"研 究"启动子或目的调节区是PEPCK的启动子。
随后/人细菌宿主中纯化质粒，与超声"泡"偶耳关，位点注入耙组织内 并且通过应用合适的超声频率转染。
超声转染
超声增强的基因转染涉及4种组分(1)微泡制备，(2)使微泡 与上述DNA构建体组合的设备，(3 )将DNA拔i泡组合注入动物内的 设备(其可以仅仅是注射器)，(4)激活转染的超声装置。
同时成像特别是超声成像已显示提供转染区的精确放置且指导用 于转染的超声参数设置。关键技术挑战是达到靶区中的高转染率且使副 作用降到最低，所述副作用例如杀死或损伤细胞和非特异性转染。因为 转染率和细胞杀死随着超声暴露而增加，所以小心的设置强度对于成功
是关键的。某些技术例如泡破坏的动态成像可能提供关于超声强度的精 确控制的反馈。
在器官内的特定类型细胞的选择性转染可能是希望的。在某些情况 下，如果针对特定细胞类型的配体是可获得的，那么可以达到这点。在一个优选实施方案中， 一定量的配体(一般是抗体)可以与微泡的表面 缀合。当给予充分的时间时，微泡与所需细胞类型选择性结合，增强对 于相关细胞群体的转染率。
转染的基因的相互作用
在转染和允许合适的控制时间，例如dsRed表达和荧光发生后，可 以执行成像以评估转染效率和定位。如果这是令人满意的，那么可以执 行化合物、基因治疗技术或任何其它治疗的评估。在这种具体情况下， 多只小鼠(例如，疾病才莫型和对照小鼠)已以上述方式用PEPCK净艮道 分子构建体进行超声转染。每只小鼠接受不同化合物或化合物和治疗的 组合。对于这些小鼠中的每一只，通过焚光成像监控通过去稳定形式的 GFP产生的荧光强度。在这个研究中，目的化合物或治疗导致GFP荧光 在肝、脂肪组织或两者中的猝灭。焚光随时间的减少与PEPCK启动子 活性相关，表明已鉴定了在体内在目的组织中可能减弱脂质和糖原不受 控制地代谢为葡萄糖的化合物、治疗或因素组合。化合物事实上可能不 一定影响PI3K/Akt途径或FOXO功能性。它们可能影响特异性影响 PEPCK启动子调节的平行途径或其它细胞组分。更一^fe地，鉴定的因素 可能影响也将产生对PEPCK报道分子活性的影响的转录或翻译过程。
荧光成像
GFP在化学和光化学上都是非常稳定和有弹性的荧光团。由于内源 自体荧光，使用荧光蛋白用于读出基因表达不是直接的。为了解决自体 荧光的问题，重要的是不具有其可能来源。存在可能引起自体荧光的各 种物质，例如黄素、NADH、脂褐质、胶原、木质素和其它。 一般地， 我们使用滤波器以挑选出其中GFP可以激发，并且用大于如上所述分子 的自体荧光的效率传送它的荧光的光谱区域。
增强的蓝色、青色、绿色、黄色和DsRed蛋白的激发和发射光谱是 广泛不同的。通过用蓝光(Imax = 470 nm )照射分子容易地诱导来自 GFP (Imax = 508-515 nm)的亮绿色荧光发射。
本领域已知的标准技术之 一 例如光漂白或光转换用于去除自体荧光。
在成像和测定最佳萸光团的整个过程中，我们考虑了决定支持系统的使用，其考虑超声和成像装置以及报道分子构建体，以便在整个研究 设置过程中提供更容易的指导和监控。
图1显示了本发明的原理。
图2为了测定针对1型糖尿病的实验治疗"T"是否对"A"和"B"型动 物都有效，"查询"启动子是胰岛素依赖性启动子。
权利要求
1.用于表达分析的组合物，其包含，a.微泡，b.哺乳动物表达载体系统，其包含，i.处于将确保在体内的组成型表达的启动子控制下的第一荧光报道基因，ii处于非组成型表达的启动子控制下的第二荧光报道基因，iii.哺乳动物复制起点，iv.细菌复制起点，v.所述第一荧光报道基因的启动子，和vi.可激活且遍在表达的所述第二荧光报道基因的启动子。
2. 根据权利要求1的组合物，其中所述哺乳动物载体系统包含一种 或多种另外的荧光报道基因，其处于非组成型表达的启动子控制下。
3. 根据权利要求1或2的组合物，其中i. 所述第一荧光报道基因选自编码绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、 青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、去稳定的绿色荧光蛋白 的基因，ii. 所述第二或另外的荧光报道基因选自编码绿色荧光蛋白、蓝色 荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、去稳定的绿 色荧光蛋白的基因，iii. 所述第 一荧光报道基因的启动子选自巨细胞病毒启动子 (CMV) 、 CMV-IE、编码转录启动子LTR的HIV-1长末端重复序列 (LTR) 、 SV40正、HSVtk、 P-肌动蛋白、人珠蛋白a、人珠蛋白p和人i朱蛋白Y启动子，和iv. 所述微泡介质包含选自游离气泡、稳定化的气泡、胶体悬浮液、 乳状液和水溶液的介质。
4. 根据权利要求3的组合物，其中所述微泡介质是包含十二氟代戊 烷的胶体悬浮液。
5. 根据权利要求3的组合物，其中所述微泡介质是包含超声处理的 白蛋白的水溶液。
6. 根据权利要求3-5的组合物，其中a.所述绿色焚光蛋白选自EGFG、 AcGFP、 TurboGFP、 Emerald、Azani Green禾口 ZsGreen,b. 所述蓝色荧光蛋白选自EBFP、 Sapphire和T-Sapphire,c. 所述青色焚光蛋白选自ECFP、mCFP、Cerulean、CyPet、AmCyanl、 Midon-Ishi Cyan和mTFPl (Teal),d. 所述黄色荧光蛋白选自EYFP、 Topaz、 Venus、 mCitrine、 Ypet、 PhiYFP、 ZsYellowl和mBanana,e. 所述才登色和红色荧光蛋白选自Kusabira Orange 、 mOrange 、 dTomato、 dTomato國Tandem、 DsRed、 DsRed2、 DsRed-Express (Tl )、 DSRed-Monomer、 mTangerine、 mStrawberry、 AsRed2、 mRFPl、 Jred、 mCheny、 HcRedl、 mRaspbeny、 HcRed-Tandem、 mPlum禾口 AQ143。
7. 根据权利要求1-6的组合物，其中编码所述两种或更多荧光蛋白 的所述两种或更多基因编码显示相差至少20 nm、 30 nm、 40 nm、 50 nm、 60 nm、 70nm或优选80nm或更多的发射谱的荧光蛋白。
8. 根据权利要求1-7的组合物，其中编码所述两种或更多荧光蛋白 的所述两种或更多基因编码显示出60%、 80%、 100%、 120%、 160%、 180%或优选更多的相对亮度的荧光蛋白，所述相对亮度是以增强型绿 色荧光蛋白(EGFP)的百分比表示的。
9. 根据权利要求1-8的组合物，其中所述组合物另外包含选自转染 促进剂的物质。
10. 根据权利要求1-9的组合物，其中所述哺乳动物表达载体系统 由所述微泡封装。
11. 用于体内表达分析的方法，其包括步骤a. 提供根据权利要求1-10的组合物，b. 将根据(a)的组合物应用于生物、目的组织或器官，c. 步骤(b)的组合物在目的组织或器官位点处用声致穿孔装置的 超声耙孩i泡破坏，d. 通过应用光源激发由所述两种或更多报道基因编码的所述两种 或更多蛋白中的至少一种，其中所述光源发出具有与所述两种或更多荧 光蛋白的激发范围或优选最大激发相应的波长的光，e. 所述第一荧光报道基因的表达的检测，f. 所述第二或另外的荧光报道基因的表达的检测，和任选地g. 重复步骤(d)至(f)。
12. 根据权利要求11的用于体内表达分析的方法，其另外包括在步 骤(d)至(f)的第一次重复前将潜在的效应子物质应用于所述生物的步骤。
13. 根据权利要求12的用于体内表达分析的方法，其中 所述效应子物质选自致热原、药物化合物、药物前导化合物、变应原、自身免疫原、毒 素、多克隆抗体、单克隆抗体、抗原、脂质、碳水化合物、肽、蛋白、 蛋白复合物、氨基酸、脂肪酸、核苷酸、DNA、 RNA、 PNA、 siRNA和 微小RNA。
14. 根据权利要求1-10的组合物用于诊断和/或治疗的用途。
15. 试剂盒，其包含根据权利要求1-10的组合物。
16. 用于体内表达分析的方法，其包括步骤a. 提供根据权利要求1-10的组合物，b. 将根据(a)的组合物应用于生物、目的组织或器官，c. 步骤(b)的组合物在目的组织或器官位点处用声致穿孔装置的 超声革巴微泡破坏，d. 通过应用光源激发由所述两种或更多报道基因编码的所述两种 或更多蛋白中的至少一种，其中所述光源发出具有与所述两种或更多荧 光蛋白的激发范围或优选最大激发相应的波长的光，e. 所述第一荧光报道基因的表达的检测，f. 所述第二或另外的焚光报道基因的表达的检测，其中所述第二荧 光报道基因的启动子是磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因的启动子。
全文摘要
本发明的特征在于用于体内表达分析的组合物和方法。本文呈现的数据证实用于表达分析的组合物的超声送递和/或表达使得能够在体内分析基因表达，而既不需要测试受试者(动物或患者)的先前准备(特别是遗传修饰)，也不对受试者造成长期或全身效应，所述组合物包含微泡载体以及遗传有效负载，所述遗传有效负载包含“始终打开的”启动子、“参照”报道基因、“查询”启动子和“回答”报道基因。此种发明可以用于例如查询个体受试者对外源效应子物质的后生或表型应答，所述外源效应子物质例如致热原、药物化合物、药物前导化合物、变应原、自身免疫原、毒素、多克隆抗体、单克隆抗体、抗原、脂质、碳水化合物、肽、蛋白、蛋白-复合物、氨基酸、脂肪酸、核苷酸、DNA、RNA、PNA、siRNA和微小RNA。
文档编号C12Q1/68GK101688252SQ200880024258
公开日2010年3月31日 申请日期2008年6月26日 优先权日2007年7月11日
发明者C·T·陈, E·E·桑托, N·迪米特罗瓦 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司