专利名称：用于诊断、预防和/或护理特征为β-淀粉和/或淀粉样物质在人和/或动物器官和组织中异 ...的制作方法
用于诊断、预防和/或护理特征为β -淀粉和/或淀粉样物 质在人和/或动物器官和组织中异常沉积的人和/或动物 病理的产物及它们的应用、和用于确定这种病理风险的筛选方法
阿尔茨海默氏病是老人痴呆的最普通的形式。其为退化性疾病，临床特征为认知 功能的不断下降，神经病理学特征为β-淀粉质(Αβ)和τ蛋白的不溶性聚集体在大脑皮 层和皮质下灰质中的积累。Αβ以细胞外淀粉质的形式沉积在神经纤维网(老年斑)中和脑 血管(嗜刚果红血管病)中，而τ形式的蛋白形成异常神经元内间丝(神经元纤维变性) (Love S. Neuropathologicalinvestigation of dementia -.a guide for neurologists. J NeurolNeurosurg Psychiatry 76, Suppl 5 :v8_14,2005)(图 1)。
在95%的情况下，阿尔茨海默氏病是偶发性的，而在约5%的情况下其具有家族 特征并且和下列3种基因的突变有关染色体14上的早老素1 (PSEN 1)、染色体1上的早 老素2(PSEN 2)、和染色体21上的β-淀粉质前体(ΑΡΡ)。在这些情况下，所述疾病通常比 偶发性形式更早发作，并且以高渗透性常染色体显性类型的机理来传播。
AD的发病原理仍未完全理解，但是在最近十几年，“淀粉质瀑布”假说(Wilquet et al. Amyloid-beta precursor proteinprocessing in neurodegeneration.Curr Opin Neurobiol 14 :582-8,2004 ；Lee et al.Perspectives on the amyloid-beta cascadehypothesis. J Alzheimers Dis 6 :137-45，2004)日益被证实，其在家族(FAD)和 偶发性形式中都将核心作用归因于Αβ。
A β通过称为“淀粉质源途径”的分解代谢途径衍生自其β -APP前体(图幻。这 种途径通过两种蛋白酶(β-分泌酶和Y-分泌酶)来提供用于蛋白的分子上游和下游 的裂解。β -分泌酶(BACE)的切断产生长的可溶性N-末端片段(sAPP β )和99个氨基酸 的C-末端肽(C99)。其进一步被Y-分泌酶切成对应于A β和小的C-末端肽(Al⑶)的两 个片段(Selkoe DJ. Deciphering thegenesis and fate of amyloid β -protein yields novel therapies forAlzheimer disease. J Clin Invest 110 :1375-81,2002)。事实 上，Y-分泌酶具有两个主要的裂解位点，其导致形成“短”和“长”形式的Αβ (Αβ1-40和 Αβ 1-42)，在正常条件下它们的比例为10 1。类似地，BACE可在肽的不同点发挥作用，从 而在N-末端区域产生截短形式(例如A β 11-40、Αβ 11-42和A β 3_42)，这通常导致AD增 力口(Liu et al. Characterization of Aβ ll_40/42peptidedeposition in Alzheimer' s disease and young Down' s syndromebrains implication of Alzheimer' s disease. Acta Neuropathol 112 :163-74,2006)。由于蛋白被另一种蛋白酶(α -分泌酶)在Αβ残 基16-17切断，因此β APP可进行称为“非淀粉质源”的可选择的分解代谢途径。因此，后 面酶的作用排除淀粉质的形成。
淀粉质瀑布假说由多个证据支持
· AD 的基因 APP 决定家族形式突变(Rademakers et al.，Genetics of Early-Onset Alzheimer Dementia. Scientific WorldJournal 16:497-519,2003)；
基因APP的额外拷贝的存在(这在唐氏综合症中证实)足以确定AD的临床病理学描述；
· AD的大多数遗传决定形式与Αβ的产生增加、Αβ42/Αβ40比例增大有关 (Kahle et al. Attack on 淀粉质· EMBO Rep 4 :747-51,2003)；
·Αβ、特别是“长”的42-残基形式表现出强的聚集为低聚物以形成淀粉质原 纤维(其表示老年斑的主要要素)的趋势(Armstrong RA. Plaques and tangles and thepathogenesis ofAlzheimer' s disease. Folia Neuropathol44 :1-11,2006)；
·Αβ、特别是42氨基酸形式是神经毒性的(Butterfield et al. Amyloid beta-peptide(1~42)contributes the oxidative stressand neurodegeneration found in Alzheimer disease brain. Brain Pathol 14 :426-32,2004)；
转基因鼠(与AD关联的APP基因的载体)在中枢神经系统中积累 β-淀粉质，并且表现出行为-认知范围的缺陷，这取决于年龄而加重(Kurt et al. Neurodegenerativechanges associated with beta-amyloid deposition in thebrains of mice carrying mutant amyloid precursor proteinand mutant preseniIin-ltransgenes Exp Neurol 171 :59-71,2001)；
针对表达人APP的转基因鼠的Αβ的变异降低了淀粉质斑的形成，并且改 善了 其神经学缺陷(Lemere et al. Amyloid-beta immunization in Alzheimer’ s diseasetransgenic mouse models and wildtype mice. NeurochemRes 28:1017—27, 2003)。
关于遗传决定形式，约80%的家族AD情况与PSEN 1和PSEN 2突变关联(Rocchi et al. Causative and susceptibility genesfor Alzheimer' s disease -.a review. Brain Res Bull 61 :1-24,2003) 0两种早老素都涉及Αβ (其为Y-分泌酶的大分子 络合物的部分)的产生，并且它们的突变情况涉及Αβ (上述所有Αβ 1-42)产生的增 加，这具有形成神经毒性聚集体的高的趋势。约5%的FAD由位于APP基因上的突变引 起(Rocchi et al. Causative andsusceptibility genes for Alzheimer' s disease a review. Brain ResBull 61 :1-24，2003)(图2)。这些突变中的一些通过利于在二级 β-片层结构富集Αβ构象来发挥它们的病原作用，结果是溶解度和针对聚集的趋势降 低。另一方面，其他突变干扰APP的加工，原因在于它们位于分泌酶发挥作用的分子位点 处(例如“瑞典型突变”KM670/671NL)。仍有其他者利用完全未知的机理来引起长的和 不溶形式的Αβ (Αβ1-42和Αβ1-43)的生产积累。在与APP或早老素突变关联的AD情 况中，Αβ 1-42增加直到其占分泌的Αβ肽的15-40%为止，而在正常条件下其只占其的 5-10% (Rocchi et al. Causative and susceptibility genes forAlzheimer's disease a review. Brain Res Bull 61 1-24,2003 ；Lleoet al.Clinical, Pathological, and Biochemical Spectrum ofAlzheimer Disease Associated with PS—lMutations. Am J GeriatrPsychiatry 12 :146-56. 2004)。
本发明的技术任务是提供用于诊断、和/或预防、和/或护理特征为β -淀粉物质 和/或淀粉样物质在人和/或动物组织和/或器官中异常沉积的人和/或动物病理的产物 及它们的应用、和用于确定这种病理风险的筛选方法。
根据本发明的技术任务以及其他目的通过下列记录的独立权利要求中所揭示的 内容而获得。
本发明的其他特征由从属权利要求限定。
本发明的另外特征和优点从附
图1-19支持的下列描述中更加清晰可见。
本发明涉及人APP基因的新型点状突变的近期发现。所述突变的特征在于在人 APP基因￠876 的编码序列的密码子673处胞嘧啶被胸腺嘧啶置换，对应于根据GenBank 数据库的命名法的人APP770 (NM000484. 2)异构体的核苷酸2212 (转换c. 2212 > T)，这可 在网站上http: //w驟.ncbi. nlm. nih. gov.得到。为了本专利，通过淀粉样物质，旨在A β 的蛋白聚集体不再具有淀粉质本身的染色和/或超微结构特性。这种突变(其在蛋白序列 中引起ΑΡΡ770的673(Ala673Val)位处丙氨酸被缬氨酸置换，这对应于A β的氨基酸残基 2)在患者的纯合性中进行鉴定，所述患者患有具有早老性发病的严重形式的痴呆症。患者 头脊柱液的分析表明总τ蛋白和磷酸化τ明显减少，这在阿尔茨海默氏病中观察到。另 一方面，Aβ 1-40和Αβ 1-42的血浆水平相对于对照受试者增加，并且也相对于在杂合性方 面具有相同突变的患者增加。另外，相对于对照纤维原细胞，得自患者的皮肤活组织检查的 纤维原细胞在它们的培养基中释放较高量的Aβ 1-40和Αβ 1-42。总之，该数据(其详细记 录在下面示出的几个实施例中)表明在纯合性状态下，突变Ala673Val和可描述为阿尔茨 海默氏病的痴呆症相关联，并且与APP基因的其他突变类似，通过增加A β生产来影响APP 的加工。
不同家族成员的基因学研究证实存在纯合性的Ala673Val突变的另一家族携带 者。较之患者的这种相对年轻者经历神经心理评价，这检测到不同认知功能折中的初始信 号。而且，基因学分析允许鉴定相同的杂合突变中的多个携带受试者，吃惊的是即使它们中 的一些年龄增长(寿命九十)，神经学的进展方面仍没有发展(图4)。对从基因APP开始转 录的RNA进行的基因表达研究证实在这些受试者中，等位基因(即野生型和突变的)都被 转录。因此，杂合子中不存在疾病不可能是因为基因阻遏机理(“病理性”等位基因的转录 的抑制)。因此可假设与截至目前APP基因中所描述(全部常染色体显性并且完全渗透) 的相反，Ala673Val突变具有常染色体隐性类型的表达。因而断定一些明显突发形式的AD 可能在基因学上以常染色体隐性传播的形式产生。
为了研究该现象的分子基础，我们合成两种A β 1 -40肽，一种野生型(DAEF RHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV)，另一种在2位含有取代丙氨酸的缬氨酸 (DVEFRHDSGYEVHHQKL VFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV)。所述两种肽进行化学-物理和形态学 分析以评价它们的二级结构、聚集动力学、以及聚集体的形态和性质。这些研究表明突变的 肽倾向于形成比野生型更大的淀粉质原纤维。非常吃惊的是，由等摩尔量的所述两种肽构 成的混合物就其本身而言不仅聚集少于突变的肽，而且还少于野生型肽。对于淀粉样化的 这种“抑制”作用和临床观察是一致的，在所述临床观察中所述疾病专门地在Ala673Val突 变的纯合子受试者中显现，而在细胞水平(野生型和突变的)共表达两种肽的杂合子没有 生病。在该数据的基础上，甚至可认为杂合子个体由于突变的Αβ肽在存在其对应的野生 型的条件下具有较小的纤维原性倾向而可以避免阿尔茨海默氏病。
为了证实下列假设容纳突变的Αβ的N-末端区域在聚集方面具有重要作用以 及Ala673Val突变具有抑制作用，对应于A β的第一六种氨基酸合成两种肽，一种具有野生 型序列(DAEFRH)，另一种在2位含有取代丙氨酸的缬氨酸(DVEFRH)。然后所述两种六肽和 Αβ 1-40野生型共温育，并且在随后的时间内进行检查。研究证实两种六肽抑制Αβ 1-40的自发原纤维形成倾向，并且突变的六肽的作用大于对应的野生型。
该数据在AD和更多通常特征在于蛋白以不溶和毒性聚集体的形式聚集在中枢神 经系统或其他组织中的疾病的治疗策略的范围内开启了新的可能。
我们发明的第一应用包括根据本领域技术人员已知的方法制备含有人APP的 cDNA的载体(具有Ala673Val)和使用所述载体，以转染可用于发病机理研究和治疗的细胞 系。
第二应用包括根据本领域技术人员已知的方法使用根据前述申请的构建体作为 载体来制备转基因非人哺乳动物(其能够表达具有Ala673Val突变的人APP)、作为APP的 单一形式(纯合子动物)、或者和野生型人APP或含有另一种突变(双转基因)的组合。这 种动物可用作研究人和/或动物病理(其特征在于β-淀粉和/或淀粉样物质在器官和组 织中的异常形成和沉积)的发病机理、诊断、预防和护理的模型。在目前实施方案中，优选 的动物是鼠、特别是用于内源性APP的敲除的鼠株C57BL6，并且优选病理为AD。
考虑到突变的肽潜在可能干扰A β的聚集和原纤维形成，我们发明的另一种可能 应用表示为在体内基因治疗ONA直接转移到患者的细胞或组织中)或体外基因治疗(DNA 首先转移到从有机体分离的细胞中，实验室培养并因此进行修饰，然后其可重新引入患者 中)中产生含有病理的APP (具有Ala673Val突变)的构建体，所述病理的特征在于β-淀 粉物质在组织和器官中的异常沉积。构建体向靶细胞中的转移可以借助于病毒型载体来实 现，例如(a)逆转录病毒，其具有使它们的DNA整合到扩增细胞染色体中的能力；(b)而慢 病毒，其也允许将基因物质转移到没有扩增的细胞中；(c)腺相关病毒，其不将它们的DNA 整合到细胞染色体中，而是可以仅用于小尺寸的基因；(d)腺病毒，其可以转运大尺寸的基 因，但是仍然确保它们的有限时间期限的表达；或(e)单纯疱疹病毒，其仅传染数种类型的 细胞，特别是神经元细胞。可选择地，可以使用非病毒载体(如脂质体)。受到具有Αβ的 异常积累的病理影响而引入有机体的具有Ala673Val突变的APP可以提供突变的β-蛋白 源，其能够抑制淀粉物质在组织中的积累。
另一种可能的应用表示为根据本领域技术人员已知的方法(RNA干扰法，RNAi)， 使用负感知mRNA (含有本发明的突变)以抑制信使在用于Ala673Val突变的纯合子受试者 中的翻译。翻译的抑制具有这样的目的，所述目的引起突变的肽的生产的中断，这具有针对 聚集的强的趋势。基于应用于我们的发明的RNAi技术的试验还可以用于疾病(其特征在 于淀粉和/或淀粉样物质在组织和器官中的异常形成和沉积)的发病机理的研究。
我们发明的另一种应用提供具有Ala673Val突变的人APP和含有这种突变的天然 或合成肽在人和/或动物病理(其特征在于淀粉和/或淀粉样物质在组织和器官中的 异常形成和沉积)的诊断、预防和护理中的应用。
我们优选的实施方案提供低分子量肽(如六肽DVEFRH)的应用，其合适地配制用 于口腔和/或胃肠外施用，包括鞘内施用。优选的病理为AD。所述治疗提供施用单一肽或 关联的数种肽，以用作单独治疗或联合其他药物治疗。
我们发明的进一步应用提供通过本领域技术人员已知的技术制备针对根据前述 应用的蛋白和/或肽的抗体，以用于人和/或动物病理(其特征在于β -淀粉和/或淀粉 样物质在组织和器官中的异常形成和沉积)的诊断、预防和/或护理。
我们优选的实施方案提供单克隆抗体，其能够识别人APP和由其衍生的并含有这种突变的肽中的Ala673Val突变。这种抗体可用于诊断目的以识别具有Ala673Val突变的 APP，或合适地配制以治疗特征在于缺少这种突变的APP的淀粉样变性病。优选的淀粉样变 性病是AD。
上述申请以实施例的形式记录，并且不以任何方式限制本发明的进展。 实施例
实施例1 :APP基因新变异的鉴定和这种突变的携带患者的临床显型的描述
通过下列方式进行突变的鉴定从患者淋巴细胞中提取基因组DNA，经过聚合酶 链式反应(PC 、使用引物 5，-GTTTTGGGTAGCCTTTG-3 和 5，-GGCAAGACAAAACAGTAGTGG-3， 对基因APP的外显子16和17进行扩增，然后根据已经描述的技术(Wakutani et al. Novel amyloid precursor protein gene missense mutation(D678N)in probably familial Alzheimer' s. JNeurol Neurosurg Psychiatry75 :1039-42,2004) ^ X^t ψ ±| 产物进行测序(图5)。由于突变消除了限制性内切酶HpYCH4V在外显子16内部的特 定酶切位点，因此Ala673Val的存在还通过下列方面示出外显子16通过PCR(引物 5，-GGCAAGACAAAACAGTAGTGG-3，和 5，-TACTTTAATTATGATGTAATA-3，)扩增，PCR 产物被 HpYCH4V消化，以及片段在2. 5%琼脂糖凝胶上的分离。在野生型等位基因中，HpYCH4消化 产生91和78个碱基对(bp)的两种片段，而突变的等位基因产生169个bp的单一片段(图 6)。
Ala673Val突变在没有家族痴呆症的纯合性患者中进行鉴定，其受到进化的心 理-有机综合症(evolutive psycho-organicsyndrome)的影响，该综合症在36岁发病， 并且具有逐渐严重的记忆不足、计划困难和行为紊乱(图4，III 18)。针对严重的多部分 (multi-sector)认知衰退，临床描述发展为不自主运动和肌阵挛类型、帕金森症以及痉挛 性四肢轻瘫有关。
家族基因学研究允许鉴定第二纯合子受试者的Ala673Val突变(图4，III 20)和 不同杂合子受试者(图4，II 10、III 1、1112、III 8、III 12、IV 1)。纯合子(即患者的 妹妹，年轻5岁)目前具有和疾病发作一致的认知劣化的初始信号；另一方面，没有杂合子 受试者表现出神经病学病理，即使在年龄增加的情况下也是如此。这种观察表明Ala673Val 突变是常染色体隐性的，从而使得在以纯合性的形式存在时，目前为止上述中只有一种和 表达病理显型的AD有关联。
应该强调，APP基因的相同密码子容纳Ala673Thr多态性。这种多态性在杂合 性受试者中遇到，而没有AD的临床信号或神经病理学改变的暗示(Peacock et al. Novel polymorphismin the A4region of the amyloid precursor protein gene in a patientwithout Alzheimer' s disease. Neurology 43:1254-56,1993)。
对患者进行的实验室和装置研究表明
广泛的脑萎缩，普遍涉及脑髓的前部区域、RM处；
和由未受到痴呆症影响的受试者所表示的对照组相比(Αβ 1-40 = 109士 12pg/ ml, ρ = 0. 003 ；Aβ 1-42 = 20士6pg/ml，p = 0. 004)，肽 Αβ 1-40 和 Αβ 1-42 在血浆中明显 增多(分别为似6士93pg/ml和46士7pg/ml)(图7)；
相对于阴性对照(Αβ 1-40 = 34. 4士3. 8pg/ml ；A β 1-42 = 4. 4士0. 6pg/ml)，Αβ在通过皮肤活组织检查从患者中取出的纤维原细胞的培养基中增加(Αβ1-40 = 87. 3 士9. 5pg/ml ；A β 1-42 = 8. 8 士0. 2pg/ml)(图 8)；
·Αβ 1-42士43pg/ml 对 392士 115pg/ml (对照组，ρ = 0.0004)降低(图 9)，以及 在脑脊液中，τ蛋白(420pg/ml ；正常范围90_150pg/ml)和磷_ τ (63. 3pg/ml ；对照中的平 均浓度19. lpg/ml)增加(图10)，所述改变完全类似于阿尔茨海默氏病中观察到的那些。
实施例2 含有Ala673Val突变的A β肽的化学-物理特性的分析
为了确定Ala673Val突变的效果并证实其在AD发病机理中的作用，我们合成了两 种 A β -40 肽，一种具有野生型(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV)序列，另一 种在2位的丙氨酸>缬氨酸(DVEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV)。所述肽通过 固相合成法经过利用合成器433A(AppliedBiOSyStemS)来制备。然后根据Ball et al. (Int JPept Prot Res40 :370-9,1992)由 Bonetto et al. (J Biol Chem 277 :31327-34,2002) 所介绍的修饰方法，使用亲脂性探针(4-十二烷基氨基羰基芴-9-基甲基琥珀酰亚氨基碳 酸酯)将和树脂结合的肽在N-末端衍生化。在从树脂分离后，所述肽通过HPLC法、经过 使用反相柱C4 (Waters)来纯化，获得纯度> 95 %。肽鉴定通过MALDI-T0F光谱法来确定 (Reflex III Brucker Model)。
对于下面记录的物理-化学研究(除非另有说明)，将肽野生型A β 1-40、突变的 A β 1-40和含有等摩尔的两种肽的混合物的样品溶解于IOmM NaOH中，随后在50mM Tris HCl (pH7. 0)中稀释，直到最终浓度为0. 25和0. 125mM。然后将上述样品在37°C下温育1、 4、8、对小时以及3、5、10、15和20天。每次都分析等份的样品以确定二级结构、聚集、以及 聚集体的超微结构和光学-染色性能。
二级结构
由Αβ的二级结构突变导致的变化根据由Clippingdale etal. (J Pept Sci 5 227-49,2001)所描述的技术、借助于圆二色光谱法来进行研究。将肽稀释在150mM磷酸盐 缓冲液(PH 7.4)中至最终浓度为ΙΟΟμΜ，使用Jasco-810分光偏振仪在37°C的恒温下进 行测定。通过使用Imm的测试管和20nm/min的扫描速度来获得光谱。在获得缓冲溶液的 光谱后，如果需要，通过使用加权移动平均法除去噪音。
分析证实，突变的肽强烈地倾向于在β-片层呈现出大量的二级构象。在所有检 查的次数中，不仅相对于野生型肽，而且相对于由突变肽和野生型肽构成的等摩尔混合物， 其β-片层含量都较高(图11)。
这表明Aβ折叠的Ala673Val突变条件引起二级β -片层结构的显著增加。
聚集
野生型A β 1-40、突变的A β 1-40和它们等摩尔混合物的聚集通过下列方式来评 价确定可以用离心过滤法沉淀的肽的量。在不同的温育时间，30μ 1的等份样品在4°C下 以15，000g/15分钟来离心过滤。将小球溶解于25 μ 1的纯甲酸中，然后将溶液注射到设置 有 PRLP-SΙΟΟΑ柱(4.6x150mm)(Labservice Analytica,Polymer Laboratories)的 HPLC 中。通过下列方式进行洗脱使用洗脱液A (由在水中的0. 1% TFA构成)和洗脱液B (由 在乙腈中的0. 08% TFA构成)作为流动相，流速为0. 7ml/min，在20分钟内施加15-60%线 性梯度的洗脱液B。通过测定洗脱液在214nm处的吸收度来改善对应于肽的峰。
可以被沉淀的肽的量被计算为初始溶液中存在的肽的总量的百分数。
这些试验证实与野生型肽相比，突变的肽聚集更多更快，并且吃惊的是，由两种肽 形成的混合物沉淀少于突变的肽和野生型肽(图12)。
聚集体的超微结构和和染色性能
聚集体的超微结构特性和光学-染色性能分别在用刚果红着色后借助于电子显 微镜和偏振光显微镜来研究。
对于超微结构研究，将5 μ 1的野生型A β 1-40、突变的A β 1-40和它们等摩尔混合 物的混悬液在1小时-20天的温育时间吃取出，沉积在包覆i^ormvar-Carbon的镍网上5分 钟，用铀酰的过饱和溶液阴性着色，然后在电子显微镜(EM109Zeiss)下观察。在温育的第 二十天，将等份样品以15，000g/15分钟离心过滤。将这样获得的小球固定于在磷酸盐缓冲 液(pH 7.4)中的2. 5%的戊二醛，并且后固定在四氧化锇中，在丙酮中脱水，并包含在 环氧树脂(Spurr，Electron Microscopy Sciences)中。在铜网上收集超小部分(500 A), 用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色，然后在电子显微镜下观察。
为了证实是否以及以何种测量方式聚集体由淀粉质构成，在不同温育时间，在聚 赖氨酸化(polylysinated)载玻片(Bio-Optical)上收集5 μ 1各样品的溶液，用刚果红染 色，然后用偏振光显微镜(Nikon Eclipse E-800)检测。
超微结构分析表明在第一个2天的温育中，野生型A β 1-40肽形成无定形聚集体、 低聚物和很少的细丝状结构。在48小时后，短原纤维材料出现，没有分支并且不规定(前 原纤维)，仅在72小时温育后，观察到长的分支原纤维，直径约8nm并且插入有无定形和前 原纤维材料。随后，原纤维密度增加，并且无定形和前原纤维材料的量成比例增加。仅在15 天温育后，大部分材料由致密原纤维网络构成。
另一方面，突变的肽Aβ 1-40的聚集动力学非常快。事实上，从温育M小时开始， 存在缺少各种衍生物的长的、规则原纤维(图13)，在5天后，样品由致密原纤维网络构成而 没有前原纤维和无定形材料。
吃惊的是，不仅相对于突变的肽、而且相对于野生型肽，两种肽的等摩尔混合物都 形成较少原纤维，在20天温育后，大多数聚集体由无定形材料构成(图14)。
用刚果红染色的制剂的偏振光观察表明突变的肽A β 1-40比野生型A β 1-40更具 淀粉样化性，两种肽的混合物具有低的形成淀粉质的倾向。事实上，在突变的A β 1-40样品 中在M小时温育后存在双折射材料的少量聚集体(图13)，在野生型A β 1-40样品中在72 小时后以及在两种肽的混合物在5天后才出现这种情况。在稍后时间，在突变的Αβ 1-40 和野生型Αβ 1-40样品中观察到双折射材料显著增加，而在两种肽的混合物中观察到非常 少量的增加，即使在20天温育后也是如此(图14)。
该数据证实聚集研究的结果，并且证明(i)突变的肽Αβ 1-40比野生型Αβ 1-40 更具淀粉样化性，和(ii)两种肽的混合物具有低的形成淀粉质原纤维的倾向。
实施例3.通过合成肽(含有Ala673Val突变的A β的N-末端区域的同源物)抑 制淀粉样化
由于突变的A β 1-40和野生型A β 1-40肽的混合物的物理化学研究表明 八1动73￥31突变对于々0聚集可具有抑制作用，因此我们通过使用对应于Αβ的第一六个 氨基酸的两种合成肽来验证该假设，一种具有野生型序列(DAEFRH)，另一种在2位含有取 代丙氨酸的缬氨酸(DVEFRH)。将两种六肽和野生型Αβ 1-40以等摩尔浓度或过量(六肽Αβ1_40 = 5 1)浓度共温育。如实施例2所述制备混合物以用于超微结构和组织 化学研究。该研究表明两种六肽(突变的和野生型的)都抑制A β 1-40的原纤维形成，这 说明Αβ的N-末端区域的突变位点在聚集中发挥重要作用(图15)。然而，突变的六肽产 生较对应的野生型更高的活性，这强调了 Ala673Val突变的重要性(由于对原纤维形成的 抑制作用)。
实施例4 用野生型人APP或在A β的2位含有Ala > Val突变的那种进行细胞 系的转染
通过基因工程方法(Tesco et al. APP substitutions V715Fand L720P alter PS !conformation and differentially affect Aβ andAICD generation. JNeurochem 95 :446-56,2005 ；Sudhir et al. Release of Amino-Amino terminal Fragments from AmyloidPrecursor Protein Reporter and Mutated Derivatives in CulturedCell . J Biol Chem 267 :25602-08,1992)，产生两种载体，所述载体分别含有野生型人APP751的 cDNA和在A β的2位具有Ala > Val突变的人ΑΡΡ751的cDNA。使用这些载体转染两种细 胞系(C0S7和CH0)，其中使用ELISA法在培养基中进行A β计量。
通过定点突变法(Quik Change XL Site-DirectedMutagenesis Kit, Mratagene)、使用寡核苷酸
5 ’ -GATCTCTGAAGTGAAGATGGATGTAGAATTCC-3 '和 5 ‘ -GTCATGTCGGAATTCTACATCCATC TTCACTT 3，将在A β的2位的Ala > Val突变插入人ΑΡΡ751的cDNA。然后，野生型和突 变形式的APP通过PCT、经过使用下列引物来扩增
5’ -CCCGGATATCGCCACCATGCTGCCCGGTTTGGCAC-3，和 5’ -ACCGAAGCTTTGTGGCGGGG GTCTAGTTC-3’(第一个含有限制性内切酶EcoRV识别的位点，第二个具有用于酶HindIII 的位点)，在载体pcDNA 3. 1的限制性位点EcoRV和HindIII处克隆。这样制得的构建体 通过 iTop Ten One Shot(Invitrogen)细胞的转化进行扩增，通过 kit Endofree Plasmid Maxi Kit^liagen)进行纯化，并通过电穿孔用于转染C0S7和CHO细胞。转染效率通过 Western blot法、使用定向于蛋白N-末端区域(残基61-88)的抗体22C11 (Chemicon International Inc.)、经过细胞裂解液中的APP的量来评价。APP表达水平用于比较通过 使用两种构建体转染细胞而产生的A β的水平。在表达野生型和突变的人APP的C0S7和 CHO 的培养基上，然后用 ELISA(Immuno-BiologicalLaboratories Gunma)计量肽Αβ 1-40, A β 1-42和在N-末端的截短形式。
研究证实
相对于用野生型APP转染的细胞9士8. 6pg/ml和4士0. 8pg/ml)，在用突变 的APP转染的C0S7细胞的培养基中Aβ 1-40和Αβ 1_42显著增加(分别为116. 8士90. 5pg/ ml 和 20 士 12. 3pg/ml)(图 16)；
相对于用野生型APP转染的细胞8士 11. 8pg/ml和4. 2士0. 8pg/ml)，在用突 变的APP转染的CHO的培养基中Aβ 1-40和Αβ 1-42显著增加(分别为84. 6士9pg/ml和 9. 6 士 3. 4pg/ml)(图 17)；
相对于用野生型APP转染的细胞(1. 1 士0. 3pg/ml)，在用突变的APP转 染的C0S7细胞的培养基中，Αβ、特别是Αβ 3-42的N-末端处的截短形式明显增加 (2. 5 士0. 3pg/ml)。13
该数据表明在A β的2位的Ala > Val突变改变了 APP的加工，从而支持淀粉样 化途径，同时A β 1-40、A β 1-42和N末端的截短形式的产量增加。
实施例5 转基因鼠(在A β的2位具有Ala > Val突变的携带者)的产生
我们制备了这样的构建体，其携带在A β的2位具有Ala > Val突变的人ΑΡΡ，以 用于产生转基因鼠，对所述转基因鼠进行行为学、神经生理学、神经影像学、神经病理学、生 物化学和分子学测试，以限定和该基因缺陷有关的疾病的显型特性，并进行发病机理和治 疗研究。
将野生型ΑΡΡ751的cDNA克隆到载体pTSC21中，其含有启动子鼠Thy 1. 2(限制 性位点HindIII和EcoRV)(图18)。然后使该构建体进行定点突变，并且通过报道用于细胞 转染的相同方案(参见实施例4)插入在A β的2位的Ala > Val突变(Mratagene)，其用 于产生始于株C57B1/6的转基因鼠。
获得转基因阳性的6个奠基者(3雄和3雌)，它们生下了在中枢神经系统过表达 在Αβ的2位具有Ala > Val突变的人APP的三个品系。两个最优品系交杂用于内源性 APP的C5781/6敲除鼠的品系(已经可得到的品系)，以获得在缺乏鼠APP的情况下表达突 变的人APP的动物(huAPPmut/m0APPQAl，图19)。最后，这些将交杂用于野生型人APP的转基 因鼠，以获得杂合子动物(huAPP_/huAPPwt)。
在纯合性和杂合性的情况下表达具有A β的2位突变的人APP的鼠用于阿尔茨海 默氏病的发病机理研究、诊断、预防和护理，更通常用于特征在于淀粉和/或淀粉样物质在 器官和组织中异常沉积的人和/或动物疾病。
术语
AD=阿尔茨海默氏病
AI⑶=C-末端片段，其衍生自通过Y -分泌酶酶切APP
APP = β -淀粉质蛋白前体
APP070 =用于内源性APP的敲除动物
APP673a = APP 野生型
APP673v =在密码子673处具有Ala > Val突变的APP
A β = β -淀粉质，衍生自APP代谢的肽
BACE = β -分泌酶
bp =碱基对
COS细胞=用SV40病毒的缺陷突变株转染的成年雄性非洲绿猴的肾脏细胞
Cellule CHO =衍生自中华仓鼠卵巢细胞的细胞
DHPLC =变性高效液相色谱法
DNA =脱氧核糖核酸
FAD =家族形式的阿尔茨海默氏病
HPLC=高效液相色谱法
huAPP =正常人 APP
huAPPmut =表达人APP的转基因鼠，其中A β的2位Ala > Val突变
huAPPwt =表达野生型人APP的转基因鼠
MAPT =编码τ蛋白的基因
moAPP =鼠 APP
moAPP+/+ =具有正常APP表达的鼠
moAPP070 =用于内源性APP的敲除鼠
mRNA=信使 RNA
Mut =突变的
Pqw =巨细胞病毒的启动子
PCR=聚合酶链式反应
PSENl =早老素 1
PSEN2=早老素 2
RM=核磁共振
RNA =核糖核酸
RNAi = RNA 干扰
sAPP β =衍生自通过β -分泌酶酶切APP的可溶性片段
SSCP =单链构型多态性分析法
Wt =野生型
权利要求
1.一种基于以纯合子或杂合子形式、在编码人APP基因￠8767 的序列的密码子673 处胞嘧啶被胸腺嘧啶置换的研究，对人生物材料进行筛选以确定病理的方法，所述病理的 特征在于由Αβ的任何异形体形成的淀粉和/或淀粉样物质的异常沉积，所述研究对 应于ΑΡΡ770异形体(ΝΜ_000484. 2)的核苷酸2212 (c. 2212C > T转变)，所述突变导致在 APP770的残基673处或在对应于A β的2位的APP的其他异形体的类似残基处丙氨酸被缬 氨酸置换。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，基于信使RNA(mRNA)被这样的基因转录的研究，所 述基因编码根据点1具有所述突变的人APP的各种异形体，或在APP770的密码子673处具 有其他突变。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，基于含有所述Ala673Val突变的蛋白APP和/或 其异形体的研究，所述突变对应于A β的2位或在ΑΡΡ770的密码子673处具有其他突变。
4.根据权利要求1和2所述的筛选方法，其特征在于，其包含从任何生物材料分离所述 基因组DNA和/或RNA和对它们进行测序。
5.根据前述权利要求中的一项或多项所述的筛选方法，其特征在于，其包括通过所述 DNA的非同位素分析来研究所述突变。
6.根据前述权利要求中的一项或多项所述的筛选方法，其中所述突变的研究通过使用 限制性内切酶和/或DHPLC (去活高效液相色谱法)和/或SSCP (单链构型多态性分析法) 和/或原位杂交法来进行。
7.根据前述权利要求中的一项或多项所述的筛选方法，其特征在于，所述DNA得自从 患者血液中分离的白细胞。
8.根据权利要求1-7所述的筛选方法，其特征在于一种所述病理是典型形式或以非典 型显型表达的AD。
9.构建体，其特征在于，其在任何非内源性启动子控制下携带人APP或它们片段的不 同异形体，所述人APP或它们片段在ΑΡΡ770或它们片段的密码子673处具有Ala673Val突 变或其他突变。
10.根据前述权利要求所述的构建体，其特征在于其在启动子Thyl.1或Thyl. 2控制 下携带人APP或其片段，所述人APP或其片段在APP770或它们片段的密码子673处具有 Ala673Val突变或其他突变。
11.根据权利要求9所述的构建体，其特征在于其在巨细胞病毒(P。mv)的启动子控制 下携带人APP或其片段，所述人APP或其片段在APP770或它们片段的密码子673处具有 Ala673Val突变或其他突变。
12.任意细胞系，其特征在于，其以稳定或瞬间方式用根据权利要求9-11所述的构建 体转染。
13.转基因非人哺乳动物，其特征在于，其以杂合子或纯合子形式携带所述DNA序列或 其片段，所述DNA序列或其片段编码人APP或它们片段的不同异形体，所述人APP或它们片 段在APP770或它们片段的密码子673处具有Ala673Val突变或其他突变。
14.提供敲除用于内源性APP的转基因非人哺乳动物，其特征在于，其携带所述DNA序 列或其片段，所述DNA序列或其片段编码人APP或它们片段的不同异形体，所述人APP或它 们片段以纯合子形式(基因型APP673v/APP673v)、或半合子形式(基因型APPQ/APP673v)、或杂合子(基因型APP673A/APP673v)在APP770或它们片段的密码子673处具有Ala673Val (APP673v) 突变或其他突变。
15.根据权利要求13和14所述的转基因非人哺乳动物，其特征在于，其以纯合子、半合 子或杂合子形式携带所述DNA序列或其片段，所述DNA序列或其片段编码人APP或它们片 段的不同异形体，其中所述Ala673Val突变(或在APP770或它们片段的密码子673处的其 他突变)和其他突变相关联。
16.根据权利要求13-15所述的转基因非人哺乳动物，其特征在于，其以纯合子、半合 子或杂合子形式携带所述DNA序列或其片段，所述DNA序列或其片段编码人APP或它们片 段的不同异形体，其中所述Ala673Val突变、(或在APP770或它们片段的密码子673处的 其他突变)和在编码早老素1 (PSEm)的基因中的突变相关联。
17.根据权利要求13-15所述的转基因非人哺乳动物，其特征在于，其以纯合子、半合 子或杂合子形式携带所述DNA序列或其片段，所述DNA序列或其片段编码人APP或它们片 段的不同异形体，其中所述Ala673Val突变、(或在APP770或它们片段的密码子673处的 其他突变)和在编码早老素2(PSEN2)的基因中的突变相关联。
18.根据权利要求13-15所述的转基因非人哺乳动物，其特征在于，其以纯合子、半合 子或杂合子形式携带所述DNA序列或其片段，所述DNA序列或其片段编码人APP或它们片 段的不同异形体，其中所述Ala673Val突变、(或在APP770或它们片段的密码子673处的 其他突变)和在编码τ蛋白(MAPT)的基因中的突变相关联。
19.根据权利要求13-15所述的转基因非人哺乳动物，其特征在于，其以纯合子、半合 子或杂合子形式携带所述DNA序列或其片段，所述DNA序列或其片段编码人APP或它们片 段的不同异形体，其中所述Ala673Val突变、(或在APP770或它们片段的密码子673处的 其他突变)和基因PSEm和/或PSEN2和/或MAPT中的突变组合相关联。
20.根据权利要求13所述的转基因非人哺乳动物，其特征在于，其是敲除物，其中所述 内源性APP在内源性启动子控制下通过非同源重组经过人APP或其片段而置换，所述人APP 或其片段在APP770或它们片段的密码子673处具有Ala673Val突变或其他突变。
21.根据权利要求13-20所述的转基因哺乳动物，其特征在于，其为啮齿动物。
22.根据权利要求13-20所述的转基因哺乳动物，其特征在于，其是任何株的鼠。
23.转基因动物，其特征在于，其是任何动物有机体，所述动物有机体表达人APP或其 片段，所述人APP或其片段在APP770或它们片段的密码子673处具有Ala673Val突变或 其他突变，所述基因型的特征在权利要求13-20中有所描述(例如线虫、黑腹果蝇、斑马鱼寸J ο
24.转基因有机体，其特征在于，其是任何真核或原核微生物，所述微生物表达人APP 或其片段，所述人APP或其片段在APP770或它们片段的密码子673处具有Ala673Val突变 或其他突变，所述基因型的特征在权利要求13-20中有所描述(例如细菌，如大肠杆菌、酵 母菌、霉菌等)。
25.信使RNA(mRNA)或其片段，其含有核苷酸序列，所述核苷酸序列对应于(“正感 知”mRNA)或互补于(“负感知”mRNA)DNA，所述DNA编码人APP，所述人APP在APP770的密 码子673处具有Ala673Val突变或其他突变。
26.根据前述权利要求的RNA或其片段的应用，它们用于已知为RNA干扰(RNAi)的技术范围和所有其可能的应用。
27.根据权利要求25和沈的RNA或其片段在人和/或动物病理的诊断、预防和治疗中 的应用，所述病理表示由Αβ的任何异形体形成的β-淀粉和/或淀粉样物质在人和/或 动物器官和组织中的异常沉积。
28.根据前述权利要求所述的物质的应用，其中一种所述病理表示为具有典型或非典 型显型的AD的偶然或遗传形式。
29.人APP的异形体，其特征在于，其在ΑΡΡ770的密码子673处具有Ala673Val突变或 其他突变。
30.人APP的片段，包括所有Aβ的异形体，所述A β包括在N-末端处截短和/或在 C-末端处延伸的那些，其特征在于，其在ΑΡΡ770的密码子673处具有Ala673Val突变或其 他突变。
31.如前述权利要求所述的人APP的片段，其表示为Aβ 1-40、A β 1_42、在A β 1-40和 Aβ 1-42的N-末端处截短形式、以及在Aβ 1-40和Αβ 1-42的C-末端处延伸形式、或它们 的部分序列。
32.合成肽，其特征在于，它们类似于根据权利要求30和31所述的人APP的片段。
33.根据权利要求30-32所述的肽，其特征在于，它们含有至少一种右旋形式的氨基酸残基。
34.根据权利要求30-33所述的肽，其特征在于，它们含有一种或多种氨基酸残基，所 述氨基酸残基通过使用任何类型的化学基团结合来修饰。
35.根据权利要求30-34所述的模拟化学结构、非蛋白或只有部分蛋白用于药物制剂， 所述药物制剂被设计用于人和/或动物病理的诊断和/或预防和/或护理，所述病理的特 征在于β-淀粉物质和/或淀粉样物质在人和/或动物组织和器官中的异常沉积。
36.根据权利要求30-35所述的物质，其特征在于，它们偶合分子，所述分子起到载体 的作用，所述载体能够携带这些物质至特定位点，在所述位点中所述物质具有用于人和/ 或动物病理的诊断和/或预防和/或护理的功能，所述病理的特征在于β -淀粉物质和/ 或淀粉样物质在人和/或动物组织和器官中异常沉积。
37.根据权利要求30-36所述的物质在药物制剂中的应用，所述药物制剂被设计用于 人和/或动物病理的诊断和/或预防和/或护理，所述病理的特征在于β -淀粉物质和/ 或淀粉样物质在人和/或动物组织和器官中异常沉积。
38.根据前述权利要求所述的物质的应用，其中一种所述病理表示为具有典型或非典 型显型的AD的偶然或遗传形式。
39.根据权利要求30-36所述的物质的应用，其特征在于，它们为载体，所述载体能够 携带任何类型的化合物至特定位点，在所述位点中所述物质具有用于人和/或动物病理的 诊断和/或预防和/或护理的功能，所述病理的特征在于β -淀粉物质和/或淀粉样物质 在人和/或动物组织和器官中异常沉积。
40.根据权利要求25和30-36所述的物质在研究人和/或动物疾病的发病机理中的应 用，所述疾病的特征在于β-淀粉物质和/或淀粉样物质在人和/或动物组织和器官中异 常沉积。
41.根据前述权利要求所述的物质的应用，其特征在于，一种所述病理表示为具有典型或非典型显型的AD的偶然或遗传形式。
42.根据权利要求四-34所述的蛋白和/或肽的多克隆抗体。
43.单克隆抗体或它们的片段(单链抗体，纳米体)，其针对根据权利要求四-34所述 的蛋白和/或肽。
44.根据权利要求42和43所述的抗体在药物制剂中的应用，所述药物制剂瞄准人和/ 或动物病理的诊断和/或预防和/或护理，所述病理的特征在于β -淀粉物质和/或淀粉 样物质在人和/或动物组织和器官中异常沉积。
45.抗体针对根据前述权利要求所述的蛋白和/或肽的应用，其中一种所述病理表示 为具有典型或非典型显型的AD的偶然或遗传形式。
46.根据权利要求9-11所述的构建体在人和/或动物病理的体细胞基因治疗中的应 用，所述病理的特征在于β-淀粉物质和/或淀粉样物质在人和/或动物组织和器官中异 常沉积。
47.根据权利要求9-11所述的构建体的应用，其中根据权利要求46所述的体细胞治疗 通过使用天然或合成的脂质或聚合物作为携带载体而获得。
48.根据权利要求9-11所述的构建体的应用，其中根据权利要求46所述的体细胞基因 治疗通过使用生物剂作为载体而获得。
49.前述权利要求所述的构建体的应用，其中根据权利要求46所述的体细胞基因治疗 通过使用病毒剂作为载体(腺病毒、腺相关病毒、SV40、逆转录病毒等)而获得。
50.根据权利要求9-11所述的构建体在人自身细胞的转染中的应用，所述应用用在所 述病理的细胞治疗，所述人自身细胞受到根据权利要求37和38所述的病理的影响。
51.根据权利要求9-11所述的构建体在异源或异种细胞的转染中的应用，所述应用用 在根据权利要求37和38所述的病理的细胞治疗。
52.根据权利要求12所述的细胞和根据权利要求13-Μ所述的基因改造的有机体作为 模型用于根据权利要求37和38所述的病理的发病机理以及诊断、预防和护理研究中的应 用。
53.根据权利要求12所述的细胞和根据权利要求1314所述的基因改造的有机体用于 根据权利要求四-31所述的蛋白和/或肽的制备中的应用。
全文摘要
本发明涉及基于在纯合性或杂合性的情况下对β-蛋白的2位的点状突变Ala＞Val(对应于含有770个氨基酸的β-蛋白的Ala673Val突变前体)的研究，对从人和/或动物有机体分离的生物材料进行筛选以确定表现为β-淀粉和/或淀粉样物质在人和/或动物器官和组织中异常沉积的人和/或动物病理的风险的方法。本专利提供下列可行性(1)产生表达Ala673Val突变的单细胞或多细胞转基因有机体；(2)合成或制备具有这种突变的肽和/或它们的衍生物、和/或含有相同突变的核酸；(3)使用这些产物研究特征为β-淀粉和/或淀粉物质的异常沉积的病理的发病机理以及这些疾病的预防、诊断和护理。
文档编号C12N15/11GK102037136SQ200880121317
公开日2011年4月27日 申请日期2008年10月10日 优先权日2007年10月12日
发明者A·马蒂尼, F·塔格利维尼, G·迪费德, M·莫斌 申请人:卡罗贝斯塔神经学会I.R.C.C.S.基金会