用于癌症治疗的包含多个表达盒的构建体的制作方法

专利名称：用于癌症治疗的包含多个表达盒的构建体的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌症治疗领域，特别是尤其可用于治疗表达H19和/或IGF-II的肿瘤 的新颖核酸构建体。
背景技术：
瘤形成是癌症中发生的过程，藉以损害调节细胞生长和分化的正常调控机制，造 成进行性生长。调控机制的这一损害允许肿瘤扩大并占据身体要害部分中的空间。如果肿 瘤侵入周围组织并运输到远处(转移)，其很可能导致个体死亡。癌症治疗的期望目标是优先消除癌细胞而对正常细胞没有有害的影响。为了尝试 达到这一目标已经使用了若干种方法，包括手术、放射疗法和化疗。局部治疗如放射疗法和手术提供经由手术技术或高剂量放射疗法减少可及的身 体部位中的肿瘤质量的手段。然而需要更有效、副作用更小的局部疗法。而且，这些治疗不 适用于破坏最终见于大多数癌症患者的广泛扩散的或循环性的肿瘤细胞。为了对抗肿瘤细 胞的扩散，使用系统疗法。一种这样的系统治疗是化疗。化疗是对扩散的恶性肿瘤的主要治疗。然而，化疗 剂治疗包括许多常见实体瘤的许多癌症类型的效力有限。这种局限部分是因为许多肿瘤细 胞固有的或获得的药物抗性。使用化疗剂的另一缺陷是其严重的副作用。这些副作用包括 骨髓抑制、恶心、呕吐、脱发和口部溃疡。显然需要用来使化疗剂可杀伤恶性肿瘤细胞同时 避免系统毒性的新方法来增强效力。诊断和治疗中的H19H19基因是人类中已知印记的几种基因之一(Hurst等人，1996，NatureGenetics 12 =234237)。在胚胎发生最早期，H19从两种染色体等位基因表达(DeGroot等人，1994， Trophoblast 8:285302)。随后很快，发生父系等位基因的沉默，只有母系遗传的等位基因 被转录。H19在胚胎发生期间大量表达，并首先被鉴定为在肝脏中与α-胎蛋白一 起被反式作用基因座raf协同调节的基因(Pachnis等人，1984，"Locusunlinked to α -fetoprotein under the control of the murine raf and Rif genes (处于鼠 raf 和Rif基因控制下的与α-胎蛋白非连锁的基因座)”，Proc Natl AcadSci. 81 =55235527) 0 此外，H19已被几个研究组使用目标为分离组织分化期间表达的基因的筛选而独立地克 隆。例如，H19的小鼠同系物在早在C3H10T1/2细胞分化期间有活性的基因的筛选中鉴定 (Davis ^Α 1987, "Expression of a single transfected cDNA converts hbroblasts to myoblasts (表达单转染的cDNA将成纤维细胞转化为成肌细胞)”，Cell 51 =9871000)。 类似地，显示鼠H19在干细胞分化期间和移植时表达(Poirier等人，1991，“The murine H19 gene is activated during embryonic stem eelldifferentiation in vitro and at the time of implantation in the developing embryo (鼠H19基因在胚月台干细胞体夕卜分化 期间和在发育中的胚胎中植入时活化)”，Development 113:1105 1114)。在从人类胎盘 分化细胞滋养层时也发现人类H19基因的转录(Rachmilewitz等人，1992，Molec. Reprod.Dev. 32 196202)。尽管H19RNA的转录发生在胎儿生命和胎盘发育期间的许多不同胚胎组织中，H19 的表达在出生后下调，而已经报道例如在成年鼠肌肉和肝脏中低水平的H19转录(Brimkow 禾口 Tilghman，1991，"Ectopic expression ofthe H19 gene in mice causes prenatal lethality (H19基因在小鼠中的异位表达导致出生前致死)”，Genes Dev. 5 =10921101)。H19转录在出生后可在癌细胞中再次活化，如在来源于出生前表达H19的组织 的肿瘤中证实的(Ariel 等人，1997，“The product of the imprintedH19 gene is an oncofetal RNA(印记的H19基因的产物是癌胚RNA) ",MoIPatho 1. 50 3444)。另外，出生后 H19RNA在一些肿瘤中表达，特别是来源于已知不表达H19的神经组织的星形细胞瘤和成神 经节细胞瘤(Ariel等人，同上)。考虑到H19RNA在许多类型的肿瘤和癌症中表达，Ariel 等人推测H19RNA是一种癌胚RNA，并提议研究H19作为人类瘤形成的一种肿瘤标志物。H19在84%的人类膀胱癌中显著表达，表达随着肿瘤失去分化而降低。不论肿瘤 级别，H19表达水平与早期肿瘤复发显著地相关(Ayesh, B.等人，Mol Ther, 2003. 7 (4) P. 535-41)。比较差别仅是存在或不存在H19RNA的两种同类细胞群中的基因表达模式已经鉴 定了 H19RNA的多样的下游效应子。其中有此前报道为在肿瘤发生过程的某些方面起关键 作用的基因的组。H19 RNA的存在可能通过上调在这些途径中起作用的基因而增强细胞的 侵入、迁移和血管原性能力，因此至少可有助于转移级联的初始步骤。另外的研究强调H19 通过作为对肝细胞生长因子/分散因子(HGF/SF)响应的基因，在促进癌症进展和肿瘤转移 中的可能作用。H19基因在癌细胞中的特异性表达提示了其在用于诊断癌症的临床应用中的用 途。例如，美国专利第5，955，273号教导使用H19基因作为肿瘤特异性标志物。PCT公布 第TO 2004/024957号公开了使用H19用于在怀疑患有癌症的患者中检测剩余癌细胞或起 源于实体瘤的微转移灶的存在。IGF-II胰岛素样生长因子-II(IGF-II)在大多数膀胱癌如移行细胞癌(TCC ;Ariel， I.等人，The imprinted H19 gene is a marker of early recurrence in humanbladder carcinoma(印记的H19基因是人类膀胱癌早期复发的标志物).MolPathol，2000. 53(6) P. 320-3)中表达。生物活性通过结合于细胞表面受体IGF-I受体(IGF-IR)、IGF-II受体 (IGF-2R)和胰岛素受体(IR)而被介导。IGF受体存在于胎儿和成年动物的几乎所有的组织 中。IGF-2R以高亲和性结合IGF-II，而IGF-IR和IR具备对IGF-II高的、但比对其各自配体 低的亲和性。IGF-II是强有力的胚胎和肿瘤生长因子，经由IGFlR通过Ras/促分裂原活化 的蛋白激酶、磷脂酰肌醇3-激酶/Akt/F0X0、和S6K/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mT0R)信号转导途径传递信号来改变细胞增殖、细胞存活、基因表达 和细胞生长。IGF-II是另一种印记的基因，其表达取决于亲本来源。然而与H19不同，IGF-II在 小鼠和人类二者中是母系印记的，因此从父系遗传的等位基因表达(Rainier等人，1993， "Relaxation of imprinted genes in human cancer ( Α^Ι^δΕΦ EPiSSS Wfev^tk ) Nature 362:747749)。人类IGF-II基因表现复杂的转录方式。有四种IGF-II启动子，它们以组织特异性和发育特异性方式活化。其中只有三种IGF-II启动子(即P2、P3和P4) 被印记并在胎儿发育期间和癌症组织中被活化。IGF-II基因的P3启动子已牵涉在肝硬 化和肝细胞癌进展中(Seo 等人，1998，“Different protein-binding patternsin the P3 promoter region of the human insulin-like growth factor II gene in thehuman liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma tissues (入夷岛 ^ Ι3〒 II ■ 因的Ρ3启动子区在人类肝硬化和肝细胞癌组织中的不同蛋白结合方式)”，J Korean Med Sci. 13 171178)。第四种IGF-II启动子(即Pl)不被印记，并在成体肝脏和脉络丛中活化(参见 Holthuizen 等人，1993, "Transcriptional regulation of the majorpromoters of the human IGF-II gene (人类IGF-II基因的主要启动子的转录调节)”，Mol Reprod Dev. 35 391 393)。IGF-II印记丧失已牵涉在维尔姆斯瘤中(Ogawa等人，1993，“Relaxation of insulin-like growth factor II gene imprinting implicated inffilm' s tumour(月夷 岛素样生长因子II基因印记松弛牵涉在维尔姆斯瘤中)”，Nature 362:749 751)。这 一观察结果导致许多研究者推测，印记基因的印记丧失和双等位基因表达可能牵涉在生 长障碍和癌症发展中(Rainier 等人，1993，Nature 362 :747749 ;Glassman 等人，1996， “Relaxation of imprintingin carcinogenesis (癌发生中印记的松弛)，，，Cancer Genet Cytogenet. 89 6973)。IGF-II信号转导系统的表观遗传修饰和突变发生在癌症如人类结肠直肠瘤中 (Hassan AB, Macaulay VM. The insulin-iike growth factor system as atherapeutic target in colorectal cancer (胰岛素样生长因子系统在结肠直肠癌中作为治疗靶).Arm Oncol 2002 ；13 :349_56)。IGF-II的供应经常上调，基因表达的系列分析已显示IGF-II在 大量癌症细胞系和肿瘤如人类膀胱癌和结肠直肠癌中是常过表达的基因(Zhang L，Zhou W, Velculescu VE 等人 Gene expression profiles in normal and cancer cells (正常 细胞和癌细胞中的基因表达谱).Science 1997 ；276 1268-72)。WO 99/18195和美国专利第7，041，654号教导异源序列、特别是编码细胞毒性产 物(如白喉毒素)的基因在肿瘤细胞中在癌症特异性启动子(如，H19启动子和增强子、 IGF-II P3启动子、IGF-II P4启动子或IGF-I启动子)控制下的特异性表达。WO 04/031359教导调控血管发生控制基因在牵涉于新血管形成中的细胞中的表 达的方法，所述方法包括向细胞施用有效量的H19调节剂。WO 2007/034487公开一种核酸构建体，该核酸构建体包含(i)编码TNF α的第一 核酸序列；(ii)编码白喉毒素的第二核酸序列；和(iii)包含癌症特异性启动子(如H19、 IGF-I、IGF-II P3或IGF-II P4启动子)的至少一个另外的核酸序列；TNF α和白喉毒素编 码序列处于所述癌症特异性启动子的表达控制下。还提供了构建体系统和方法及其用途。WO 2007/007317公开了能够下调癌细胞中Η19 mRNA水平的分离的寡核苷酸、包 含联合另外的抗癌治疗能够下调H19 mRNA的药剂的制品、以及通过施用这些来治疗癌症的 方法。WO 2007/007317公开了抗癌药物可与所要求保护的寡核苷酸共施用。WO 2008/087641公开了利用H19-沉默核酸剂如抑制性RNA治疗类风湿性关节炎 的组合物和方法。
WO 2008/087642公开了利用H19-沉默核酸剂如抑制性RNA治疗癌症和与H19基 因表达升高相关的其它疾患的组合物和方法。WO 2008/099396公开了利用H19-沉默核酸剂如抑制性RNA治疗再狭窄的组合物
和方法。以上参考文献都没有公开或暗示包含多个白喉毒素表达开放阅读框的单个构建 体，其中白喉毒素从多个启动子表达。使用仅单个启动子(如H19启动子或IGF-II P3或P4启动子)来从抗癌治疗构 建体表达细胞毒性基因或细胞抑制(cytostatic)基因存在几个未解决的问题。举个例子， 并非指定类型的癌症的每种肿瘤(如膀胱癌、表皮膀胱癌等)对经由H19启动子或IGF-II P3或P4启动子表达都是阳性的。因此，这种治疗在一定比例的患者中必然失败，即使不造 成肿瘤诱变。确定对这种构建体的响应将包括对单独肿瘤基因分型的昂贵和困难的步骤。已知肿瘤表现显著的基因组不稳定性和不均一性。因此，例如，即使带有H19-表 达肿瘤的个体也可能含有一定比例的已经由突变下调或消除H19表达的癌细胞。因此，在 这种患者中从单个启动子表达细胞毒性或细胞抑制基因可能导致暂时和部分的肿瘤衰退， 当含有这些突变的细胞存活并快速增殖时肿瘤衰退将快速逆转。对于开发可用于癌症治疗的另外的安全和有效的治疗方法仍有未满足的医学需 求。在这一部分或本申请的任何其它部分并入或描述文字的参考文献不构成所述参 考文献视为本发明现有技术的承认。发明_既述本发明涉及癌症治疗领域，特别是尤其可用于治疗表达H19和/或胰岛素样生长 因子II(IGF-II)的肿瘤的新颖核酸构建体和表达载体。本发明还提供利用本发明的核酸 构建体的组合物、方法和药盒。具体地，本发明的新颖载体包含含有使得能够从选自H19、IGF-II P3、和IGF-II P4衍生序列的多个癌症特异性启动子表达细胞毒性剂如白喉毒素的多个表达盒的核酸构 建体。根据本发明第一方面，提供了一种核酸构建体，该核酸构建体包含(a)编码细胞毒性基因产物或细胞抑制基因产物的第一开放阅读框，所述第一开 放阅读框可操作地连接于第一转录调节序列；和(b)编码细胞毒性基因产物或细胞抑制基因产物的第二开放阅读框，所述第二开 放阅读框可操作地连接于第二转录调节序列；其中所述第一转录调节序列和所述第二转录调节序列不同，并选自以下组成的 组:i)H19特异性转录调节序列和ii)选自IGF-II P3和IGF-II P4的IGF-II转录调节序 列。例如，所述转录调节序列可以是i)第一转录调节序列是H19特异性转录调节序列，第二转录调节序列是IGF-II P4转录调节序列；ii)第一转录调节序列是H19特异性转录调节序列，第二转录调节序列是IGF-II P3转录调节序列；和
iii)第一转录调节序列是IGF-II P4转录调节序列，第二转录调节序列是IGF-II P3转录调节序列。任选地，所述构建体还可包含编码细胞毒性基因产物或细胞抑制基因产物的第三 开放阅读框，所述第三开放阅读框可操作地连接于选自H19特异性转录调节序列、IGF-II P3转录调节序列和IGF-II P4转录调节序列的第三转录调节序列。另一方面，本发明提供一种核酸构建体，该核酸构建体包含a)编码白喉毒素的 第一开放阅读框，所述第一开放阅读框可操作地连接于H19特异性转录调节序列；和b)编 码白喉毒素的第二开放阅读框，所述第二开放阅读框可操作地连接于选自IGF-II P4序列 和IGF-II P3序列的第一 IGF-II转录调节序列。在一个实施方案中，所述核酸构建体还包含编码白喉毒素的第三开放阅读框，所 述第三开放阅读框可操作地连接于选自IGF-II P4序列和IGF-IIP3序列的第二 IGF-II转 录调节序列，其中所述第一 IGF-II转录调节序列与所述第二 IGF-II转录调节序列不同。例 如，第二开放阅读框可以可操作地连接于IGF-II P4转录调节序列且第三开放阅读框可以 可操作地连接于IGF-II P3转录调节序列，或可选地第二开放阅读框可以可操作地连接于 IGF-II P3转录调节序列且第三开放阅读框可以可操作地连接于IGF-II P4转录调节序列。另一方面，本发明提供一种核酸构建体，该核酸构建体包含a)编码白喉毒素的 第一开放阅读框，所述第一开放阅读框可操作地连接于IGF-IIP3转录调节序列；和b)编码 白喉毒素的第二开放阅读框，所述第二开放阅读框可操作地连接于IGF-II P4转录调节序 列。在另一实施方案中，所述核酸构建体还包含编码白喉毒素的第三开放阅读框，所 述第三开放阅读框可操作地连接于H19特异性转录调节序列。在本发明的构建体中，白喉毒素可以是例如白喉毒素A链(白喉毒素A，DTA)，如 具有包含如SEQ ID NO :7所列的序列的氨基酸序列的毒素，如以下详述的。根据不同的实施方案，转录调节序列可以是选择性地(或在其它实施方案中优先 地)诱导或增强在癌细胞中的表达的调节序列(如启动子或增强子)，如本文详述的。在另一实施方案中，术语“IGF-II转录调节序列”是指以特异性(或差别)方式调 节转录并被发现在染色体如人类染色体上与IGF-II基因相关联的序列。根据特定实施方 案，“IGF-II P3转录调节序列”和“IGF-II P4转录调节序列”是指P3或P4(分别地)启 动子。在另一实施方案中，该术语是指衍生自P3或P4(分别地)启动子的转录调节序列。 在另一实施方案中，该术语是指本文公开的P3-或P4 (分别地)特异性转录调节序列之一。 每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。例如但不限于，IGF-II P4转录调节序列可以是包含SEQ ID NO :9所列的核酸序列 的启动子，如以下详述的。IGF-II P3启动子的非限制性实例包括包含如选自SEQ ID NO 8、SEQ ID N0:12和SEQ ID NO :17的序列所列的核酸序列的启动子，如以下详述的。在另一实施方案中，“H19-特异性转录调节序列”是指以特异性(或差别)方式调 节转录并被发现在染色体如人类染色体上与H19基因相关联的序列。在另一实施方案中， 该术语是指H19特异性启动子。在另一实施方案中，该术语是指衍生自H19启动子的转录 调节序列。在另一实施方案中，该术语是指本文公开的H19特异性转录调节序列之一。每 种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。例如但不限于，H19特异性转录调节序列可以是包含SEQ ID NO :1-2中任一个所列的核酸序列的启动子，如以下详述的。本发明首次公开，这样的构建体提供特异性靶向表达H19和/或从P3和/或P4 启动子表达IGF-II的恶性肿瘤的特别有效和安全的治疗。有利地，现在公开了本发明的构 建体在更大数量的细胞和/或更高比例的患者中引发响应，从而提供与迄今已知的治疗相 比改进的癌症治疗。在另一实施方案中，所述核酸构建体是质粒。在另一实施方案中，本发明提供包含 本发明的核酸构建体的真核表达载体。在另一实施方案中，本发明提供一种用于在需要其的人类受治疗者中治疗肿瘤的 方法，该方法包括向所述人类受治疗者施用本发明的核酸构建体(如治疗有效量的核酸构 建体)，从而治疗需要其的人类受治疗者的肿瘤。在另一实施方案中，本发明提供一种用于在需要其的人类受治疗者中抑制肿瘤进 展的方法，该方法包括向所述人类受治疗者施用本发明的核酸构建体(如治疗有效量的核 酸构建体)，从而抑制需要其的人类受治疗者的肿瘤进展。在另一实施方案中，本发明提供一种用于在需要其的人类受治疗者中抑制肿瘤转 移的方法，该方法包括向所述人类受治疗者施用本发明的核酸构建体(如治疗有效量的核 酸构建体)，从而抑制需要其的人类受治疗者的肿瘤进展。在另一实施方案中，本发明提供在需要其的人类受治疗者中减少或减轻与肿瘤性 病症相关的症状的方法，该方法包括向所述人类受治疗者施用本发明的核酸构建体(如治 疗有效量的核酸构建体)，从而在需要其的人类受治疗者中减少或减轻与肿瘤性病症相关 的症状。在本发明方法中，在一个实施方案中，所述受治疗者患有特征为在肿瘤的至少一 部分细胞中表达H19RNA的肿瘤，如其中所述肿瘤的细胞能够表达由H19启动子指导的转录 物、由IGF-II P4启动子指导的转录物和/或由IGF-II P3启动子指导的转录物。本发明的构建体还可以以药盒或药品包装形式，所述药盒或药品包装包含用于在 需要其的受治疗者中的表达H19和/或从P3和/或P4启动子表达IGF-II的新生物的一 个或多个疗程。因此，在另一方面提供了一种药盒，该药盒包含i)本发明的核酸构建体； 和ii)向需要其的受治疗者(如患有癌症的受治疗者)施用所述核酸构建体的说明书。本发明的组合物、方法和药盒可用于治疗与表达H19和/或从P3和/或P4启动 子表达IGF-II相关的多种恶性肿瘤。在另一实施方案中，该肿瘤是实体瘤。在另一实施方 案中，该肿瘤是癌。在各种具体实施方案中，该肿瘤包括但不限于膀胱癌、肝新生物(如肝 细胞癌)、肺腺癌(小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、食道癌、卵巢癌、横纹肌肉瘤、宫颈癌、头 颈鳞状细胞癌、结肠直肠瘤、子宫瘤和睾九生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、成胶质细胞瘤和 腺皮质瘤(adenocortical tumor)。根据描述的优选实施方案的进一步特征，所述肿瘤选自膀胱癌、肝细胞癌和结肠 癌组成的组。在另一实施方案中，所述肿瘤选自膀胱癌、肝细胞癌、卵巢癌和胰腺癌组成的 组。在另一实施方案中，所述肿瘤选自膀胱癌、肝细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺 癌、宫颈癌、结肠癌和肺癌组成的组。在另一特定实施方案中，受治疗者患有表皮膀胱癌。每 种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。示例性转移瘤包括如结肠直肠癌转移到肝脏和转移性乳腺癌。在特定实施方案中，本发明的组合用于阻止或抑制肝脏转移灶的形成。本发明的其它目标、特征和优点将从以下描述和附图变得明显。附图简述

图1.描绘双启动子H19-DTA-P4-DTA表达载体的构建的示例说明。每种DTA的编 码序列分别处在IGF-II-P4和H19启动子序列的转录控制下。Kana(R)-卡那霉素抗性基 因。图2.带有H19、P4和H19+P4调节序列的DTA-表达构建体在T24P细胞中的相 对体外活性。对人类T24P细胞共转染2 μ g LucSV40和所示浓度的H19-DTA、P4-DTA或 H19-DTA-P4-DTA。A.与仅转染LucSV40的细胞相比在不同剂量的萤光素酶活性。B. (A)中 描述的实验的另外重复。C. 0.005 μ g数据的条形图。Y轴(图A-C):萤光素酶活性(％对 照)。X轴(图A-B) 质粒/孔。该图以及所有附图中的误差条表示平均值的1个标准 误差。图3. DTA-表达构建体在UMUC3细胞中的相对活性。如对图2描述的进行实验；轴 与图2相同。A.与仅转染LucSV40的细胞相比在不同剂量的萤光素酶活性。B. (A)中描述 的实验的另外重复。C. 0.005 μ g数据的条形图。图4. DTA-表达构建体在Hep3B细胞中的相对活性。如对图2描述的进行实验；轴 与图2相同。A.与仅转染LucSV40的细胞相比在不同剂量的萤光素酶活性。B.0.005yg 数据的条形图。图5. DTA-表达构建体在ES-2细胞中的相对活性。如对图2描述的进行实验；轴 与图2相同。A.与仅转染LucSV40的细胞相比在不同剂量的萤光素酶活性。B. 0.005 μ g 数据的条形图。图6. DTA-表达构建体在PC-I细胞中的相对活性。如对图2描述的进行实验；轴 与图2相同。A.与仅转染LucSV40的细胞相比在不同剂量的萤光素酶活性。B. 0.005 μ g 数据的条形图。图7. DTA-表达构建体在CRL-1469细胞中的相对活性。如对图2描述的进行实验； 轴与图2相同。A.与仅转染LucSV40的细胞相比在不同剂量的萤光素酶活性。B. 0. 005 μ g 数据的条形图。图8.带有P3、P4和P3+P4调节序列的DTA-表达构建体在T24P细胞中的相 对体外活性。对人类T24P细胞共转染2yg LucSV40和所示浓度的P3-DTA、P4-DTA或 P4-DTA-P3-DTA。A.与仅转染LucSV40的细胞相比在不同剂量的萤光素酶活性。B. 0. 005 μ g 数据的条形图。Y轴(图A-B)萤光素酶活性(％对照)。X轴(图A) μ g质粒/孔。轴 与图2相同。图9. DTA-表达构建体在HT-1376细胞中的相对活性。如对图8描述的进行实验； 轴与图8相同。A.与仅转染LucSV40的细胞相比在不同剂量的萤光素酶活性。B. 0.005 μ g 数据的条形图。图10. DTA-表达构建体在Hep3B细胞中的相对活性。如对图8描述的进行实验； 轴与图8相同。A.与仅转染LucSV40的细胞相比在不同剂量的萤光素酶活性。B.0.005yg 数据的条形图。图11. DTA-表达构建体在ES-2细胞中的相对活性。如对图8描述的进行实验；轴与图8相同。A.与仅转染LucSV40的细胞相比在不同剂量的萤光素酶活性。B. 0.005 μ g 数据的条形图。图12. DTA-表达构建体在PC-I细胞中的相对活性。如对图8描述的进行实验；轴 与图8相同。A.与仅转染LucSV40的细胞相比在不同剂量的萤光素酶活性。B.0.005yg 数据的条形图。图13. DTA-表达构建体在CRL-1469细胞中的相对活性。如对图8描述的进 行实验；轴与图8相同。A.与仅转染LucSV40的细胞相比在不同剂量的萤光素酶活性。 B. 0. 005 μ g数据的条形图。图14.从带有H19、P3和H19+P3调节序列的构建体表达的DTA在T24P细胞 中的相对体外活性。对T24P细胞共转染2 μ g LucSV40和所示浓度的H19-DTA、P3-DTA 或H19-DTA-P3-DTA。A.与仅转染LucSV40的细胞相比在不同剂量的萤光素酶活性。 B. 0.005 μ g数据的条形图。Y轴(图A-B):萤光素酶活性(％对照)。X轴(图A) 质 粒/孔。轴与图2相同。 图15. H19-DTA-P4-DTA与P4-驱动的构建体联合H19-驱动的构建体在T24P 细胞中的相对体外活性的比较。对T24P细胞共转染2yg LucSV40和所示浓度的 H19-DTA-P4-DTA或等量的P4-DTA+等量的H19-DTA。A.与仅转染LucSV40的细胞相比在不 同剂量的萤光素酶活性。B. 0.005 μ g数据的条形图。Y轴(图A-B)萤光素酶活性(％对 照)。X轴(图A) 质粒/孔。图16. H19-DTA-P4-DTA与P4-驱动的构建体联合H19-驱动的构建体在Ifep3B细 胞中的相对体外活性的比较。如对图15描述的进行实验；轴与图15相同。A.与仅转染 LucSV40的细胞相比在不同剂量的萤光素酶活性。B. 0. 005 μ g数据的条形图。图17. H19-DTA-P4-DTA与P4-驱动的构建体联合H19-驱动的构建体在ES-2细 胞中的相对体外活性的比较。如对图15描述的进行实验；轴与图15相同。A.与仅转染 LucSV40的细胞相比在不同剂量的萤光素酶活性。B. 0. 005 μ g数据的条形图。图18. H19-DTA-P4-DTA与P4-驱动的构建体联合H19-驱动的构建体在PC-1细 胞中的相对体外活性的比较。如对图15描述的进行实验；轴与图15相同。A.与仅转染 LucSV40的细胞相比在不同剂量的萤光素酶活性。B. 0. 005 μ g数据的条形图。图19. H19-DTA-P4-DTA与P4-驱动的构建体联合H19-驱动的构建体在CRL-1469 细胞中的相对体外活性的比较。如对图15描述的进行实验；轴与图15相同。A.与仅转染 LucSV40的细胞相比在不同剂量的萤光素酶活性。B. 0. 005 μ g数据的条形图。图20. P4-DTA-P3-DTA与P3-驱动的构建体联合P4-驱动的构建体在HT-1376 细胞中的相对体外活性的比较。对HT-1376细胞共转染2 μ gLucSV40和所示浓度的 P4-DTA-P3-DTA或等量的P3-DTA+等量的P4-DTA。A.与仅转染LucSV40的细胞相比在不同 剂量的萤光素酶活性。B. 0.005 μ g数据的条形图。轴与图15相同。图21. P4-DTA-P3-DTA与P3-驱动的构建体联合P4-驱动的构建体在ES-2细胞中 的相对体外活性的比较。对ES-2细胞共转染2 μ g LucSV40和所示浓度的P4-DTA-P3-DTA 或等量的P3-DTA+等量的P4-DTA。A.与仅转染LucSV40的细胞相比在不同剂量的萤光素 酶活性。B. 0.005 μ g数据的条形图。轴与图15相同。图22. 0. 005 μ g P4-DTA-P3-DTA与各0. 005 μ g P3-驱动的构建体联合P4-驱动的构建体在H印-3B细胞中的相对体外活性的比较。如对图21描述的进行实验。轴与图15B 相同。图23. DTA-表达构建体在HT-1376细胞中的相对活性。如对图15描述的进行实 验；轴与图15相同。A.与仅转染LucSV40的细胞相比在不同剂量的萤光素酶活性。B. (A) 中描述的实验的另外重复。C. 0.005 μ g数据的条形图。图 24. 0. 005 μ g P4-DTA-P3-DTA 与各 0. 005 μ g P3-驱动的构建体联合 P4-驱动 的构建体在CRL-1469细胞中的相对体外活性的比较。A.与仅转染LucSV40的细胞相比在 不同剂量的萤光素酶活性。B. 0.005 μ g数据的条形图。如对图21描述的进行实验。轴与 图15相同。图25.注射25 μ g H19-DTA的体内抗肿瘤作用。Y-轴肿瘤体积增加倍数。X_轴 时间(天数)。图26.注射25 μ g P4-DTA的体内抗肿瘤作用。Y-轴肿瘤体积增加倍数。X_轴 时间(天数)。图27.注射25 μ g H19-DTA-P4-DTA的体内抗肿瘤作用。Y-轴肿瘤体积增加倍 数。X-轴时间(天数)。图28. H19-DTA-P4-DTA治疗小鼠的肿瘤的活体外(ex vivo)体积。图29. H19-DTA-P4-DTA治疗小鼠的肿瘤的活体外重量。图30.注射25 μ g H19-DTA和25 μ g P4-DTA的体内抗肿瘤作用。Y-轴肿瘤体 积增加倍数。χ-轴时间(天数)。图31. T24P膀胱癌模型数据概述。图32.在HT-1376模型中注射25 μ g H19-DTA和25 μ g P4-DTA的体内抗肿瘤作 用。Y-轴肿瘤体积增加倍数。X-轴时间(天数)。图33.在HT-1376模型中注射25μ g H19-DTA-P4-DTA的体内抗肿瘤作用。Y-轴 肿瘤体积增加倍数。X-轴时间(天数)。图34.注射25 μ g P3-DTA的体内抗肿瘤作用。Y-轴肿瘤体积增加倍数。X_轴 时间(天数)。图35.注射25 μ g P4-DTA的体内抗肿瘤作用。Y-轴肿瘤体积增加倍数。X_轴 时间(天数)。图36.注射25 μ g P4-DTA-P3-DTA的体内抗肿瘤作用。Y-轴肿瘤体积增加倍数。 X-轴时间(天数)。图37.注射25 μ g P3-DTA和25 μ g P4-DTA的体内抗肿瘤作用。Y-轴肿瘤体积 增加倍数。χ-轴时间(天数)。图38.注射25 μ g P3-DTA的体内抗肿瘤作用。Y-轴肿瘤体积增加倍数。X_轴 时间(天数)。图39.注射25 μ g H19-DTA-P3-DTA的体内抗肿瘤作用。Y-轴肿瘤体积增加倍 数。X-轴时间(天数)。图40. DTA-表达构建体在HT-1376细胞中的相对活性。如对图2描述的进行实验； 轴与图2相同。A.与仅转染LucSV40的细胞相比在不同剂量的萤光素酶活性。B. 0. 005 μ g 数据的条形图。
发明详述本发明涉及癌症治疗领域，特别是可用于治疗表达H19和/或表达胰岛素样生长 因子II (IGF-II)的肿瘤的新颖疗法。具体地，本发明的新颖载体包含含有使得能够从选自H19、IGF-II P3、和IGF-II P4的多种启动子表达细胞毒性剂的多个表达盒的核酸构建体。因此，在一些实施方案中，本发明提供一种核酸构建体，该核酸构建体包含(a)编码细胞毒性基因产物或细胞抑制基因产物的第一开放阅读框，所述第一开 放阅读框可操作地连接于第一癌症特异性转录调节序列；和(b)编码所述细胞毒性基因产物或细胞抑制基因产物(即，相同的基因产物或其 变体)的第二开放阅读框，所述第二开放阅读框可操作地连接于第二癌症特异性转录调节 序列；其中所述第一转录调节序列与所述第二转录调节序列不同，并选自i)H19特异性 转录调节序列(如H19启动子)和ii) IGF-II转录调节序列(如IGF-II P3或IGF-II P4 启动子)组成的组。换言之，构建体包含至少两种不同转录调节序列，其各自衍生自不同的调节序列 (H19、P4或P3)，并各自可操作地连接于编码所述细胞毒性基因产物或细胞抑制基因产物 的分别序列。例如，两种转录调节序列可以是i)第一转录调节序列是H19特异性转录调节序列，第二转录调节序列是IGF-II P4转录调节序列；ii)第一转录调节序列是H19特异性转录调节序列，第二转录调节序列是IGF-II P3转录调节序列；或iii)第一转录调节序列是IGF-II P4转录调节序列，第二转录调节序列是IGF-II P3转录调节序列。应理解的是，多个表达盒可操作地连接于不同的转录调节序列，使得能够独立调 节从编码细胞毒性剂的每个开放阅读框的转录。因此，构建体中开放阅读框的排列在本发 明不同实施方案之间可能变化，例如，构建体可能设计为使得第一表达盒在第二表达盒上 游或下游。在一个实施方案中，本发明提供一种单个核酸分子，该核酸分子包含编码细胞毒 性基因产物或细胞抑制基因产物的第一开放阅读框，所述第一开放阅读框可操作地连接于 H19特异性转录调节序列；和编码所述细胞毒性基因产物或细胞抑制基因产物的第二开放 阅读框，所述第二开放阅读框可操作地连接于IGF-II P3转录调节序列。在另一实施方案 中，所述核酸分子还包含编码所述细胞毒性基因产物或细胞抑制基因产物的第三开放阅读 框，所述第三开放阅读框可操作地连接于IGF-II P4转录调节序列。每种可能性代表本发 明的一种分别的实施方案。在另一实施方案中，本发明提供一种单个核酸分子，该核酸分子包含编码细胞毒 性基因产物或细胞抑制基因产物的第一开放阅读框，所述第一开放阅读框可操作地连接于 H19特异性转录调节序列；和编码所述细胞毒性基因产物或细胞抑制基因产物的第二开放 阅读框，所述第二开放阅读框可操作地连接于IGF-II P4转录调节序列。在另一实施方案 中，所述核酸分子还包含编码所述细胞毒性基因产物或细胞抑制基因产物的第三开放阅读框，所述第三开放阅读框可操作地连接于IGF-II P3转录调节序列。每种可能性代表本发 明的一种分别的实施方案。在另一实施方案中，本发明提供一种单个核酸分子，该核酸分子包含编码细胞毒 性基因产物或细胞抑制基因产物的第一开放阅读框，所述第一开放阅读框可操作地连接于 IGF-II P4转录调节序列；和所述编码细胞毒性基因产物或细胞抑制基因产物的第二开放 阅读框，所述第二开放阅读框可操作地连接于IGF-II P3转录调节序列。在另一实施方案 中，所述核酸分子还包含编码所述细胞毒性基因产物或细胞抑制基因产物的第三开放阅读 框，所述第三开放阅读框可操作地连接于H19特异性转录调节序列。每种可能性代表本发 明的一种分别的实施方案。在H19和P4启动子的分别表达控制下表达细胞毒性剂(DTA)的本发明示例性构 建体H19-DTA-P4-DTA描绘在图1并在本文进一步描述(实施例1)。在P4和P3启动子的 分别表达控制下表达DTA的本发明示例性构建体(P4-DTA-P3-DTA)以及在H19和P3启动 子的分别表达控制下表达DTA的本发明示例性构建体(H19-DTA-P3-DTA)也分别描述在“实 验细节部分”的实施例5和实施例6。这些构建体分别以SEQ ID NO :11、24和18所列的核 酸序列表示，如以下详述的。如本文证明的，与分别施用各构建体(在H19或P4启动子控制下表达DTA)相比， 施用包含各在不同肿瘤特异性启动子即H19启动子和IGF-IIP4启动子的转录控制下表达 DTA的两种不同序列的单个表达载体导致增强杀伤多种癌细胞(实施例1-4)。而且，与联 合施用单启动子构建体相比结果显示是大于加和的(实施例7)。包含两种不同基因的单个 表达载体的增强的能力也得到体内测试的证实(实施例10)。此外，与分别施用各构建体(在P3或P4启动子控制下表达DTA)相比，施用包含各 在不同肿瘤特异性启动子即IGF-II P3启动子和IGF-II P4启动子的转录控制下表达DTA 的两种不同序列的单个表达载体导致增强杀伤广泛多种癌细胞(实施例5)。而且，与联合 施用单启动子构建体相比结果显示是大于加和的(实施例8)。包含两种不同基因的单个表 达载体的增强的能力也得到体内测试的证实(实施例11)。此外，与分别施用各构建体(在P3或H19启动子控制下表达DTA)相比，施用包含 各在不同肿瘤特异性启动子即H19启动子和IGF-II P3启动子的转录控制下表达DTA的两 种不同序列的单个表达载体导致增强杀伤膀胱癌细胞(实施例6)。包含两种不同基因的单 个表达载体的增强的能力也得到体内测试的证实(实施例12)。根据本发明当前优选的实施方案，本发明方法和组合物的细胞毒性基因产物是白 喉毒素。在另一实施方案中，两种序列编码相同的白喉毒素。在另一实施方案中，每种序列 编码白喉毒素的不同变体。在另一实施方案中，白喉毒素是DTA。每种可能性代表本发明的 一种分别的实施方案。在另一实施方案中，构建体还包含编码TNFa的另外的开放阅读框，该另外的 开放阅读框可操作地连接于选自H19特异性转录调节序列、IGF-II P3转录调节序列或 IGF-II P4转录调节序列的另外的转录调节序列。在另一实施方案中，细胞毒性基因产物是胸苷激酶。在另一实施方案中，细胞毒性 基因产物是假单胞菌(Pseudomonas)毒素。在另一实施方案中，细胞毒性基因产物是蓖麻 毒素。在另一实施方案中，细胞毒性基因产物是霍乱毒素。在另一实施方案中，细胞毒性基因产物是成视网膜细胞瘤基因产物。在另一实施方案中，细胞毒性基因产物是P53。在另一 实施方案中，细胞毒性基因产物是成视网膜细胞瘤基因产物。在另一实施方案中，细胞毒性剂是杀肿瘤的，即对肿瘤细胞比对非肿瘤细胞的毒 性更大。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。在另一实施方案中，本发明方法和组合物的细胞抑制基因产物是p21。在另一实施 方案中，细胞抑制基因产物是P27。在另一实施方案中，细胞抑制基因产物是p53。在另一 实施方案中，细胞抑制基因产物是P53175P。在另一实施方案中，细胞抑制基因产物是p57。 在另一实施方案中，细胞抑制基因产物是Pl5。在另一实施方案中，细胞抑制基因产物是 Pl60在另一实施方案中，细胞抑制基因产物是pl8。在另一实施方案中，细胞抑制基因产物 是P19。在另一实施方案中，细胞抑制基因产物是p73。在另一实施方案中，细胞抑制基因 产物是GADD45。在另一实施方案中，细胞抑制基因产物是APCl。在另一实施方案中，细胞 抑制基因产物是P73RB1。在另一实施方案中，细胞抑制基因产物是WT1。在另一实施方案 中，细胞抑制基因产物是NFl。在另一实施方案中，细胞抑制基因产物是VH。在另一实施方 案中，细胞抑制基因产物是P53。在另一实施方案中，细胞毒性剂是抗肿瘤的，即对肿瘤细胞 比对非肿瘤细胞的毒性更大。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。编码细胞毒 性剂或细胞抑制剂的核酸序列可由本领域公知方法获得，如以下示例的方法。在另一实施方案中，本发明提供包含本发明的核酸构建体和药学上可接受的载运 体(carrier)、赋形剂或稀释剂的药物组合物。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方 案。在另一实施方案中，本发明提供包含本发明的核酸构建体的真核表达构建体和载 体。在另一实施方案中，本发明提供在需要其的人类受治疗者中治疗肿瘤的方法，该 方法包括向人类受治疗者施用本发明的核酸构建体，从而在需要其的人类受治疗者中治疗 肿瘤。在另一实施方案中，构建体包含从H19启动子和IGF-II P4启动子表达相同的细胞毒 性基因产物的两种分别的核酸序列。在另一实施方案中，两种分别的核酸序列从IGF-II P3 启动子和IGF-II P4启动子表达相同的细胞毒性基因产物。在另一实施方案中，两种分别的 核酸序列从H19启动子和IGF-II P3启动子表达相同的细胞毒性基因产物。在另一实施方 案中，细胞毒性基因产物是白喉毒素。在另一实施方案中，施用治疗有效量的核酸构建体。 在另一实施方案中，该肿瘤特征为表达H19RNA和/或从P3和/或P4启动子表达IGF-II。 每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。在另一实施方案中，本发明提供在需要其的人类受治疗者中抑制肿瘤进展的方 法，该方法包括向人类受治疗者施用本发明的核酸构建体，从而在需要其的人类受治疗者 中抑制肿瘤进展。在另一实施方案中，构建体包含从H19启动子和IGF-II P4启动子表达 相同的细胞毒性基因产物的两种分别的核酸序列。在另一实施方案中，两种分别的核酸序 列从IGF-II P3启动子和IGF-II P4启动子表达相同的细胞毒性基因产物。在另一实施方 案中，两种分别的核酸序列从H19启动子和IGF-II P3启动子表达相同的细胞毒性基因产 物。在另一实施方案中，细胞毒性基因产物是白喉毒素。在另一实施方案中，施用治疗有效 量的核酸构建体。在另一实施方案中，该肿瘤特征为表达H19RNA和/或从P3和/或P4启 动子表达IGF-II。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。
在另一实施方案中，本发明提供在需要其的人类受治疗者中抑制肿瘤转移的方 法，该方法包括向人类受治疗者施用本发明的核酸构建体，从而在需要其的人类受治疗者 中抑制肿瘤转移。在另一实施方案中，构建体包含从H19启动子和IGF-II P4启动子表达 相同的细胞毒性基因产物的两种分别的核酸序列。在另一实施方案中，两种分别的核酸序 列从IGF-II P3启动子和IGF-II P4启动子表达相同的细胞毒性基因产物。在另一实施方 案中，两种分别的核酸序列从H19启动子和IGF-II P3启动子表达相同的细胞毒性基因产 物。在另一实施方案中，细胞毒性基因产物是白喉毒素。在另一实施方案中，施用治疗有效 量的核酸构建体。在另一实施方案中，该肿瘤特征为表达H19RNA和/或从P3和/或P4启 动子表达IGF-II。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。在另一实施方案中，本发明提供在需要其的人类受治疗者中减轻或缓和与肿瘤性 病症相关的症状的方法，该方法包括向人类受治疗者施用本发明的核酸构建体，从而在需 要其的人类受治疗者中减轻或缓和与肿瘤性病症相关的症状。在另一实施方案中，构建体 包含从H19启动子和IGF-II P4启动子表达相同的细胞毒性基因产物的两种分别的核酸 序列。在另一实施方案中，两种分别的核酸序列从IGF-II P3启动子和IGF-II P4启动子 表达相同的细胞毒性基因产物。在另一实施方案中，两种分别的核酸序列从H19启动子和 IGF-II P3启动子表达相同的细胞毒性基因产物。在另一实施方案中，细胞毒性基因产物是 白喉毒素。在另一实施方案中，施用治疗有效量的核酸构建体。在另一实施方案中，该肿瘤 性病症特征为表达H19RNA和/或从P3和/或P4启动子表达IGF-II。每种可能性代表本 发明的一种分别的实施方案。在另一实施方案中，本发明提供本发明的核酸构建体用于制备在人类受治疗者中 治疗肿瘤的药物的应用。在另一实施方案中，构建体包含从H19启动子和IGF-II P4启动 子表达相同的细胞毒性基因产物的两种分别的核酸序列。在另一实施方案中，两种分别的 核酸序列从IGF-II P3启动子和IGF-II P4启动子表达相同的细胞毒性基因产物。在另一 实施方案中，两种分别的核酸序列从H19启动子和IGF-II P3启动子表达相同的细胞毒性 基因产物。在另一实施方案中，细胞毒性基因产物是白喉毒素。在另一实施方案中，施用治 疗有效量的核酸构建体。在另一实施方案中，该肿瘤特征为表达H19RNA和/或从P3和/ 或P4启动子表达IGF-II。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。在另一实施方案中，本发明提供本发明的核酸构建体用于制备在人类受治疗者中 抑制肿瘤进展的药物的应用。在另一实施方案中，构建体包含从H19启动子和IGF-II P4 启动子表达相同的细胞毒性基因产物的两种分别的核酸序列。在另一实施方案中，两种分 别的核酸序列从IGF-II P3启动子和IGF-II P4启动子表达相同的细胞毒性基因产物。在 另一实施方案中，两种分别的核酸序列从H19启动子和IGF-II P3启动子表达相同的细胞 毒性基因产物。在另一实施方案中，细胞毒性基因产物是白喉毒素。在另一实施方案中，施 用治疗有效量的核酸构建体。在另一实施方案中，该肿瘤特征为表达H19 RNA和/或从P3 和/或P4启动子表达IGF-II。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。在另一实施方案中，本发明提供本发明的核酸构建体用于制备在人类受治疗者中 抑制肿瘤转移的药物的应用。在另一实施方案中，构建体包含从H19启动子和IGF-II P4启 动子表达相同的细胞毒性基因产物的两种分别的核酸序列。在另一实施方案中，两种分别 的核酸序列从IGF-II P3启动子和IGF-II P4启动子表达相同的细胞毒性基因产物。在另一实施方案中，两种分别的核酸序列从H19启动子和IGF-II P3启动子表达相同的细胞毒 性基因产物。在另一实施方案中，细胞毒性基因产物是白喉毒素。在另一实施方案中，施用 治疗有效量的核酸构建体。在另一实施方案中，该肿瘤特征为表达H19RNA和/或从P3和 /或P4启动子表达IGF-II。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。在另一实施方案中，本发明提供本发明的核酸构建体用于制备在人类受治疗者中 减轻或缓和与肿瘤性病症相关的症状的药物的应用。在另一实施方案中，构建体包含从H19 启动子和IGF-II P4启动子表达相同的细胞毒性基因产物的两种分别的核酸序列。在另一 实施方案中，两种分别的核酸序列从IGF-II P3启动子和IGF-II P4启动子表达相同的细 胞毒性基因产物。在另一实施方案中，两种分别的核酸序列从H19启动子和IGF-II P3启 动子表达相同的细胞毒性基因产物。在另一实施方案中，施用治疗有效量的核酸构建体。 在另一实施方案中，该肿瘤性病症特征为表达H19RNA和/或从P3和/或P4启动子表达 IGF-IL·每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。在另一实施方案中，本发明提供用于在人类受治疗者中治疗肿瘤的组合物，该组 合物包含本发明的核酸构建体。在另一实施方案中，构建体包含从H19启动子和IGF-II P4 启动子表达相同的细胞毒性基因产物的两种分别的核酸序列。在另一实施方案中，两种分 别的核酸序列从IGF-II P3启动子和IGF-II P4启动子表达相同的细胞毒性基因产物。在 另一实施方案中，两种分别的核酸序列从H19启动子和IGF-II P3启动子表达相同细胞毒 性基因产物。在另一实施方案中，施用治疗有效量的核酸构建体。在另一实施方案中，该肿 瘤特征为表达H19RNA和/或从P3和/或P4启动子表达IGF-II。每种可能性代表本发明 的一种分别的实施方案。在另一实施方案中，本发明提供用于在人类受治疗者中抑制肿瘤进展的组合物， 该组合物包含本发明的核酸构建体。在另一实施方案中，构建体包含从H19启动子和 IGF-II P4启动子表达相同的细胞毒性基因产物的两种分别的核酸序列。在另一实施方案 中，两种分别的核酸序列从IGF-IIP3启动子和IGF-II P4启动子表达相同的细胞毒性基因 产物。在另一实施方案中，两种分别的核酸序列从H19启动子和IGF-II P3启动子表达相 同的细胞毒性基因产物。在另一实施方案中，细胞毒性基因产物是白喉毒素。在另一实施 方案中，施用治疗有效量的核酸构建体。在另一实施方案中，该肿瘤特征为表达H19 RNA和 /或从P3和/或P4启动子表达IGF-II。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。在另一实施方案中，本发明提供用于在人类受治疗者中抑制肿瘤转移的组合物， 该组合物包含本发明的核酸构建体。在另一实施方案中，构建体包含从H19启动子和 IGF-II P4启动子表达相同的细胞毒性基因产物的两种分别的核酸序列。在另一实施方案 中，两种分别的核酸序列从IGF-IIP3启动子和IGF-II P4启动子表达相同的细胞毒性基因 产物。在另一实施方案中，两种分别的核酸序列从H19启动子和IGF-II P3启动子表达相 同的细胞毒性基因产物。在另一实施方案中，细胞毒性基因产物是白喉毒素。在另一实施 方案中，施用治疗有效量的核酸构建体。在另一实施方案中，该肿瘤特征为表达H19 RNA和 /或从P3和/或P4启动子表达IGF-II。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。在另一实施方案中，本发明提供用于在人类受治疗者中减轻或缓和与肿瘤性病症 相关的症状的组合物，该组合物包含本发明的核酸构建体。在另一实施方案中，构建体包 含从H19启动子和IGF-II P4启动子表达相同的细胞毒性基因产物的两种分别的核酸序列。在另一实施方案中，两种分别的核酸序列从IGF-II P3启动子和IGF-II P4启动子表 达相同的细胞毒性基因产物。在另一实施方案中，两种分别的核酸序列从H19启动子和 IGF-IIP3启动子表达相同的细胞毒性基因产物。在另一实施方案中，施用治疗有效量的核 酸构建体。在另一实施方案中，该肿瘤性病症特征为表达H19RNA和/或从P3和/或P4启 动子表达IGF-II。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。在本发明的一些实施方案中，本发明的方法和组合物的肿瘤性病症是癌，如膀胱 癌、肝细胞癌、卵巢癌和胰腺癌。在另一实施方案中，本发明的方法和组合物的肿瘤性病症 是膀胱癌。在另一实施方案中，肿瘤性病症是肝细胞癌。在另一实施方案中，肿瘤性病症是 卵巢癌。在另一实施方案中，肿瘤性病症是胰腺癌。在另一实施方案中，肿瘤性病症是结肠 癌。在另一实施方案中，肿瘤性病症是另一类型的实体瘤。每种可能性代表本发明的一种 分别的实施方案。在另一实施方案中，本发明方法的H19特异性转录调节序列是H19启动子。在另一 实施方案中，H19启动子包含如本文公开的序列所列的核酸序列。在另一实施方案中，H19 启动子包含如本文公开的序列所列的核酸序列的片段。在另一实施方案中，H19启动子由 如本文公开的序列所列的核酸序列组成。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。在另一实施方案中，本发明方法的H19特异性转录调节序列包括H19增强子。在 另一实施方案中，H19增强子包含如本文公开的序列所列的核酸序列。在另一实施方案中， H19增强子包含如本文公开的序列所列的核酸序列的片段。在另一实施方案中，H19增强 子由如本文公开的序列所列的核酸序列组成。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方 案。在另一实施方案中，本发明方法的IGF-II P3转录调节序列是IGF-II P3启动子。 在另一实施方案中，IGF-II P3启动子包含如本文公开的序列所列的核酸序列。在另一实 施方案中，IGF-II P3启动子包含如本文公开的序列所列的核酸序列的片段。在另一实施 方案中，IGF-II P3启动子由如本文公开的序列所列的核酸序列组成。每种可能性代表本 发明的一种分别的实施方案。在另一实施方案中，本发明方法的IGF-II P3转录调节序列包括H19增强子。在 另一实施方案中，H19增强子包含如本文公开的序列所列的核酸序列。在另一实施方案中， H19增强子包含如本文公开的序列所列的核酸序列的片段。在另一实施方案中，H19增强 子由如本文公开的序列所列的核酸序列组成。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。在另一实施方案中，本发明方法的IGF-II P4转录调节序列是IGF-II P4启动子。 在另一实施方案中，IGF-II P4启动子包含如本文公开的序列所列的核酸序列。在另一实 施方案中，IGF-II P4启动子包含如本文公开的序列所列的核酸序列的片段。在另一实施 方案中，IGF-II P4启动子由如本文公开的序列所列的核酸序列组成。每种可能性代表本 发明的一种分别的实施方案。在另一实施方案中，本发明方法的IGF-II P4转录调节序列包括H19增强子。在 另一实施方案中，H19增强子包含如本文公开的序列所列的核酸序列。在另一实施方案中， H19增强子包含如本文公开的序列所列的核酸序列的片段。在另一实施方案中，H19增强 子由如本文公开的序列所列的核酸序列组成。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。核酸构建体本文所用的术语“核酸构建体”或“构建体”包括根据本发明的编码细胞毒性基因 产物或细胞抑制基因产物(如白喉毒素DT)的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接于启 动子和任选地其它转录调节序列。在本发明构建体中，DT-编码核酸序列可操作地连接于 至少一种H19特异性转录调节序列、P3转录调节序列和/或P4转录调节序列。在另一实施方案中，本发明方法和组合物的核酸构建体是真核表达载体。在另一 实施方案中，核酸构建体是质粒。在另一实施方案中，核酸构建体是能够介导在癌细胞中表 达的任何其它类型的表达载体。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。短语“可操作地连接”是指核酸序列连接于转录控制序列的方式使得当转染(即， 转化、转导、感染或转染)到宿主细胞中时分子能够被表达。转录控制序列是控制转录的起 始、延伸和终止的序列。特别重要的转录控制序列是控制转录起始的转录控制序列，诸如启 动子、增强子、操纵子和阻遏物Oppressor)序列。在另一实施方案中，本发明方法和组合物的核酸分子是DNA分子。在另一实施方 案中，所述分子是RNA分子。在另一实施方案中，所述分子是本领域已知的任何其它类型的 核酸分子。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。本文所用的术语“载体”是指施用于靶细胞的构建体，该构建体包含可操作地连接 于异源多核苷酸的调节序列。载体可以是病毒表达载体、质粒或稞DNA的构建体，并任选地 可包括构建、选择、稳定性、渗透等等所需的另外的序列。本文所用的术语“变体”是指可用于本发明的核苷酸序列(如，载体序列、转录调 节序列、克隆的目标多核苷酸等等)的药学上可接受的盐、同源物、类似物或片段。术语“变 体”包括化学修饰的天然和合成核苷酸分子。术语“变体”还包括分子的核苷酸序列中的保 守取代。此外，分子的核苷酸序列中的非保守取代也被本文所用的术语“变体”包括，只要 该序列大致保留其所需的功能。在其它实施方案中，本文所用的“变体”，如细胞毒性基因产物或细胞抑制基因产 物的“变体”是指本领域公认为相同的如细胞毒性或细胞抑制基因的另一版本产物的基因。 在公众数据库如美国国家生物技术信息中心的PubMed数据库中，基因序列和其产物常规 地被分类为特定基因的序列；因此鉴定如本发明的细胞毒性基因产物或细胞抑制基因产物 的变体易于在本领域普通技术人员的能力范围内。在另一实施方案中，本发明的“变体”，如细胞毒性基因产物或细胞抑制基因产物 的变体至少70%同源，或在其它实施方案中，共有至少75%、80%、82%、84%、86%、88%、 90%、92%、94%、96%、98%或99%序列同源性。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。本文所用的短语“白喉毒素”(DT或DTX)是指白喉毒素或其含有白喉毒素 的至少一个活性部分的片段，白喉毒素在受治疗者中促进细胞死亡或可能作用以促进 细胞死亡或以其它方式改善肿瘤性病症。DT包括两个多肽片段A和BtZdanovskaia， Μ. V ；Zdanovsky, A. G ；Yankovsky, N. K. "Diphtheria toxin NAD affinity and ADP ribosyltransferase activity arereduced at tryptophan 153 substitutions for alanine or phenylalanine (白喉毒素NAD亲合力和ADP核糖基转移酶活性在153位的色氨酸取代为丙氨酸或苯丙氨酸后减少).”Research in Microbiology, 2000,151, 557-562 ； Bennet,M. J. ；Choe,S. ；Eisenberg,D. “Refined structure of dimeric diphtheria toxin at2. 0 angstrom resolution(二聚白喉毒素在2. 0埃分辨率下的精细结构).”Protein Science, 1994, 3,1444-1463] 0片段A (DTA)由催化结构域(C)组成，而片段B由受体结构 域(R)和跨膜结构域(T)构成。R结构域包含结合细胞表面上的HB-EGF受体的受体部分 [Raab,Gerhard ；Klagsbrun,Michael"Heparin-binding EGF-Iike growth factor (结合月干 素的EGF样生长因子)"Biochimica et Biophysica Acta(BBA) /Reviews on Cancer 1997， 1333，F179-F199]。结合的毒素随后通过胞吞作用进入细胞质。随后，C-末端的α -折叠 疏水串(hydrophobic series)(称为T结构域)将自身埋入膜中，使得N-末端C结构域 被裂解并易位至细胞质中。裂解后，C结构域变成活性酶，催化从蛋白合成易位肽EF-2和 NAD+ /fe^ ADP- tIH -EF-2 (Hudson TH ^A, Quantal entry of diphtheria toxin to the cytosol (白喉毒素向细胞液的量子进入).J Biol Chem. 1985 Mar 10 ；260 (5) :2675_80)。 单个C结构域可在数小时内利用细胞的所有EF-2供应，使得蛋白合成停止，导致细胞死亡。 因为本发明设想该毒素的优先地细胞内的重组表达，所以可利用最小C结构域。根据本发 明这一方面的目前已知的优选实施方案，该毒素是白喉A链毒素(DTA)。在另一实施方案中，DTA由SEQ ID NO 6所列的核酸序列编码atggatcctgatgatgttgttgattcttctaaatcttttgtgatggaaaacttttcttcgtaccacggg actaaacctggttatgtagattccattcaaaaaggtatacaaaagccaaaatctggtacacaaggaaattatgacga tgattggaaagggttttatagtaccgacaataaatacgacgctgcgggatactctgtagataatgaaaacccgctct ctggaaaagctggaggcgtggtcaaagtgacgtatccaggactgacgaaggttctcgcactaaaagtggataatgcc gaaactattaagaaagagttaggtttaagtctcactgaaccgttgatggagcaagtcggaacggaagagtttatcaa aaggttcggtgatggtgcttcgcgtgtagtgctcagccttcccttcgctgaggggagttctagcgttgaatatatta ataactgggaacaggcgaaagcgttaagcgtagaacttgagattaattttgaaacccgtggaaaacgtggccaagat gcgatgtatgagtatatggctcaagcctgtgcaggaaatcgtgtcaggcgatctttgtga(SEQ ID NO :6)。 · 另一实施方案中，DTA-编码序列包含SEQ ID NO :6所列的核酸序列。在另一实施方案中， DTA-编码序列由SEQ ID NO :6所列的核酸序列组成。在另一实施方案中，DTA-编码序列是 SEQ ID NO :6的同源物。在另一实施方案中，DTA-编码序列是SEQ ID NO :6的变体。在另 一实施方案中，DTA-编码序列是SEQ ID NO :6的片段。在另一实施方案中，DTA-编码序列 是SEQ ID NO :6的片段的同源物。在另一实施方案中，DTA-编码序列是SEQ ID NO :6的片 段的变体。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。在另一实施方案中，DTA的氨基酸序列如SEQ ID NO 7所列MDPDDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVD NENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRF⑶GASRVVLSLPFAEGSS SVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSL(SEQ ID NO :7)。在另一实施方 案中，DTA包含SEQ ID NO :7所列的核酸序列。在另一实施方案中，DTA由SEQ ID NO :7所 列的核酸序列组成。在另一实施方案中，DTA是SEQ ID N0:7的同源物。在另一实施方案 中，DTA是SEQ ID N0:7的变体。在另一实施方案中，DTA是SEQ ID NO 7的片段。在另一 实施方案中，DTA是SEQ ID NO :7的片段的同源物。在另一实施方案中，DTA是SEQ ID N0: 7的片段的变体。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。
在另一实施方案中，DTA与SEQ ID NO :7至少60%同源。在另一实施方案中，DTA 与SEQ ID NO :7至少65%同源。在另一实施方案中，DTA与SEQ ID NO :7至少70%同源。 在另一实施方案中，DTA与SEQ ID NO :7至少72%同源。在另一实施方案中，DTA与SEQ ID NO :7至少74%同源。在另一实施方案中，DTA与SEQ ID NO :7至少76%同源。在另一 实施方案中，DTA与SEQ ID NO :7至少78%同源。在另一实施方案中，DTA与SEQ ID NO: 7至少80%同源。在另一实施方案中，DTA与SEQ ID NO :7至少82%同源。在另一实施方 案中，DTA与SEQ ID NO :7至少84%同源。在另一实施方案中，DTA与SEQ ID NO :7至少 86%同源。在另一实施方案中，DTA与SEQ ID NO :7至少88%同源。在另一实施方案中， DTA与SEQ ID NO :7至少90%同源。在另一实施方案中，DTA与SEQ ID NO :7至少92%同 源。在另一实施方案中，DTA与SEQ ID NO :7至少94%同源。在另一实施方案中，DTA与 SEQ ID NO :7至少95%同源。在另一实施方案中，DTA与SEQ ID NO :7至少96%同源。在 另一实施方案中，DTA与SEQ ID NO :7至少97%同源。在另一实施方案中，DTA与SEQ ID NO :7至少98%同源。在另一实施方案中，DTA与SEQ ID NO :7至少99%同源。在另一实 施方案中，DTA与SEQ ID NO :7超过99%同源。每种可能性代表本发明的一种分别的实施 方案。本发明的构建体在同一构建体上包含多个表达盒，其中细胞毒性基因产物或细 胞抑制基因产物的表达由以下三种转录调节序列中的至少两种指导H19、IGF-II P3和 IGF-II P4调节序列，即，编码基因产物的核酸序列处于这些序列中的至少两种序列的转录 控制下。本文所用的短语“处于H19(或IGF-II P3或IGF-II P4)表达控制下”(或“转录 控制”)是指编码的序列从H19特异性(或IGF-II P3或IGF-II P4)启动子序列或由该启 动子序列衍生的序列的转录，所述启动子序列或由该启动子序列衍生的序列与所述编码的 序列可操作地连接以调节其表达方式(包括空间和时间表达方式)。在另一实施方案中，本发明方法和组合物的调节序列衍生自H19、IGF-II P3或 IGF-II P4转录调节序列。本文所用的描述“衍生自H19、IGF-IIP3或IGF-II P4转录调节 序列”的调节序列是指“衍生”(参见以下)自调节和/或控制H19或IGF-II编码序列表达 的基因区域的序列。如此，调节序列包括但不限于衍生自H19、IGF-II P3或IGF-II P4序 列的启动子或增强子的序列。术语“衍生”是指如下事实转录调节序列(例如，启动子或增强子)可以是基因 的完整的天然调节序列、所述天然调节序列的部分、所述天然调节序列的嵌合构建体、一种 或多种天然调节序列的组合构建体、或通过例如缺失、添加或取代至少一个核苷酸而获得 的天然调节序列的变体。变体调节序列可包含修饰的核苷酸。衍生的序列优选地展示控制 /调节(如，增加)与其可操作地连接的编码序列的表达的特性。本文描述了可以用在本发明的核酸构建体中以指导细胞毒性基因产物或细胞抑 制基因产物的特异性表达的H19调节序列。可用于本发明的H19调节序列包括尤其是上游 H19启动子区和下游H19增强子区。在某些实施方案中，根据本发明可使用的H19启动子 和增强子序列包括但不限于美国专利第6，306，833号中描述的那些H19启动子和增强子序 列，如本文详述的。在另一实施方案中，本发明的组合物的H19特异性转录调节序列是H19启动子。在 另一实施方案中，H19启动子包含SEQ ID NO: 1-2中任一个所列的核酸序列。在另一实施方案中，H19启动子由SEQ ID NO 1~2中任一个所列的核酸序列组成。—种H19启动子区的核苷酸序列显示在SEQ ID NO 1 ctgcagggccccaacaaccctcaccaaaggccaaggtggtgaccgacggacccacagcggggtggctgg gggagtcgaaactcgccagtctccactccactcccaaccgtggtgccccacgcgggcctgggagagtctgtgaggcc gcccaccgcttgtcagtagagtgcgcccgcgagccgtaagcacagcccggcaacatgcggtcttcagacaggaaagt ggccgcgaatgggaccggggtgcccagcggctgtggggactctgtcctgcggaaaccgcggtgacgagcacaagctc ggtcaactggatgggaatcggcctggggggctggcaccgcgcccaccagggggtttgcggcacttccctctgcccct cagcaccccacccctactctccaggaacgtgaggtctgagccgtgatggtggcaggaaggggccctctgtgccatcc gagtccccagggacccgcagctggcccccagccatgtgcaaagtatgtgcagggcgctggcaggcagggagcagcag gcatggtgtcccctgaggggagacagtggtctgggagggagaggtcctggaccctgagggaggtgatggggcaatgc tcagccctgtctccggatgccaaaggaggggtgcggggaggccgtctttggagaattccaggatgggtgctgggtga gagagacgtgtgctggaactgtccagggcggaggtgggccctgcgggggccctcgggagggccctgctctgattgg ccggcagggcaggggcgggaattctggcgggccaccccagttagaaaaagcccgggctaggaccgagga(SEQ ID NO :1)。在另一实施方案中，H19序列是SEQ ID NO :1的同源物。在另一实施方案中，H19 序列是SEQ ID NO 1的变体。在另一实施方案中，H19序列是SEQ ID NO 1的片段。在另 一实施方案中，H19序列是SEQ ID N0:1的片段的同源物。在另一实施方案中，H19序列是 SEQ ID NO :1的片段的变体。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。在另一实施方案中，H19序列与SEQ ID NO :1至少60%同源。在另一实施方案中， H19序列与SEQ ID NO :1至少65%同源。在另一实施方案中，H19序列与SEQ ID NO :1至 少70%同源。在另一实施方案中，H19序列与SEQ ID NO :1至少72%同源。在另一实施方 案中，H19序列与SEQID NO :1至少74%同源。在另一实施方案中，H19序列与SEQ ID NO: 1至少76%同源。在另一实施方案中，H19序列与SEQ ID NO :1至少78%同源。在另一实 施方案中，H19序列与SEQ ID NO :1至少80%同源。在另一实施方案中，H19序列与SEQ ID NO :1至少82%同源。在另一实施方案中，H19序列与SEQ ID NO :1至少84%同源。在另一 实施方案中，H19序列与SEQ ID NO :1至少86%同源。在另一实施方案中，H19序列与SEQ ID NO :1至少88%同源。在另一实施方案中，H19序列与SEQ IDNO :1至少90%同源。在 另一实施方案中，H19序列与SEQ ID NO :1至少92%同源。在另一实施方案中，H19序列与 SEQ ID NO :1至少94%同源。在另一实施方案中，H19序列与SEQ ID NO :1至少95%同源。 在另一实施方案中，H19序列与SEQ ID NO :1至少96%同源。在另一实施方案中，H19序列 与SEQ ID NO :1至少97%同源。在另一实施方案中，H19序列与SEQ ID NO :1至少98%同 源。在另一实施方案中，H19序列与SEQID NO :1至少99%同源。在另一实施方案中，H19 序列与SEQ ID NO :1超过99%同源。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。这一 831个核苷酸的序列从加帽位点(cap site)的-837延伸到_7核苷酸(如 Brarman等人1990的描述)。共有的TATA序列出现在核苷酸-27至-35处。2个共有的 AP2结合位点(8/9匹配)出现在转录起始位点上游大约-500和-40的核苷酸处。当被置 于异源基因编码区的上游时，大约831个碱基对的调节区足以指导可操作地连接的异源基 因在也表达内源H19的癌细胞中表达。在另一实施方案中，位于核苷酸-819至+14的另一 个H19启动子区(SEQ ID NO 2)也足以指导可操作地连接的异源基因在癌细胞中表达gacaaccctcaccaagggccaaggtggtgaccgacggacccacagcggggtggctgggggagtcgaaactcgccagtctccactccactcccaaccgtggtgccccacgcgggcctgggagagtctgtgaggccgcccaccgcttg tcagtagagtgcgcccgcgagccgtaagcacagcccggcaacatgcggtcttcagacaggaaagtggccgcgaatgg gaccggggtgcccagcggctgtggggactctgtcctgcggaaaccgcggtgacgagcacaagctcggtcaactggat gggaatcggcctggggggctggcaccgcgcccaccagggggtttgcggcacttccctctgcccctcagcaccccacc cctactctccaggaacgtgagttctgagccgtgatggtggcaggaaggggccctctgtgccatccgagtccccaggg acccgcagctggcccccagccatgtgcaaagtatgtgcagggcgctggcaggcagggagcagcaggcatggtgtccc ctgaggggagacagtggtctgggagggagaagtcctggccctgagggaggtgatggggcaatgctcagccctgtctc cggatgccaaaggaggggtgcggggaggccgtctttggagaattccaggatgggtgctgggtgagagagacgtgtgc tggaactgtccagggcggaggtgggccctgcgggggccctcgggagggccctgctctgattggccggcagggcagg ggcgggaattctgggcggggccaccccagttagaaaaagcccgggctaggaccgaggagcagggtgagggag (SEQ ID NO :2)。在另一实施方案中，H19序列是SEQ ID NO :2的同源物。在另一实施方案中， H19序列是SEQ ID NO :2的变体。在另一实施方案中，H19序列是SEQ IDNO :2的片段。在 另一实施方案中，H19序列是SEQ ID NO :2的片段的同源物。在另一实施方案中，H19序列 是SEQ ID NO :2的片段的变体。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。在另一实施方案中，H19序列与SEQ ID NO :2至少60%同源。在另一实施方案中， H19序列与SEQ ID NO: 2至少65%同源。在另一实施方案中，H19序列与SEQ ID NO :2至 少70%同源。在另一实施方案中，H19序列与SEQ ID NO :2至少72%同源。在另一实施方 案中，H19序列与SEQID NO: 2至少74%同源。在另一实施方案中，H19序列与SEQ ID NO: 2至少76%同源。在另一实施方案中，H19序列与SEQ ID NO :2至少78%同源。在另一实 施方案中，H19序列与SEQ ID NO :2至少80%同源。在另一实施方案中，H19序列与SEQ ID NO :2至少82%同源。在另一实施方案中，H19序列与SEQ ID NO :2至少84%同源。在另一 实施方案中，H19序列与SEQ ID NO :2至少86%同源。在另一实施方案中，H19序列与SEQ ID NO :2至少88%同源。在另一实施方案中，H19序列与SEQ IDNO :2至少90%同源。在 另一实施方案中，H19序列与SEQ ID NO :2至少92%同源。在另一实施方案中，H19序列与 SEQ ID NO :2至少94%同源。在另一实施方案中，H19序列与SEQ ID NO :2至少95%同源。 在另一实施方案中，H19序列与SEQ ID NO :2至少96%同源。在另一实施方案中，H19序列 与SEQ ID NO :2至少97%同源。在另一实施方案中，H19序列与SEQ ID NO :2至少98%同 源。在另一实施方案中，H19序列与SEQID NO :2至少99%同源。在另一实施方案中，H19 序列与SEQ ID NO :2超过99%同源。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。任选地，人类H19基因的下游增强子区可加入到本发明的H19启动子/DTA构建体 以提供DTA分子的细胞特异性表达的增强水平。如从增强子序列预料的，下游增强子当以 反向或正向(相对于H19增强子在内源H19基因中的方向)被置于处在H19启动子控制下 的异源基因编码区下游时能够施加其作用。在另一实施方案中，H19增强子序列包括以下序列caaggacatggaatttcggaccttctgtccccaccctctctgctgagcctaggaacctctgagcagcag gaaggccttgggtctagagcctagaaatggacccccacgtccacctgcccagcctagacccccagcattgaagggtg gtcagacttcctgtgagaggaagccactaagcgggatggacaccatcgcccactccacccggccctgcccagccctg cccagtccagcccagtccagcccagccctgcccttcccagccctgcccagcccagcteatccctgccctacccagcc cagccctgtcctgccctgcccagcccagcccagcccagccctgccctgccctgccctgcccttcccagccctgaccttcccagccctgcccagcccagctcatccctgccctacccagctcagccctgccctgccctgccctgccctgcccagc cctacccagcccagccctgccctgccctgcccagctcagccctgcccaccccagcccagcccagcccagcatgcgtt ctctggatggtgagcacaggcttgaccttagaaagaggctggcaacgagggctgaggccaccaggccactgggtgct cacgggtcagacaagcccagagcctgctcccctgccacgggtcggggctgtcaccgccagcatgctgtggatgtgca tggcctcagggctgctggctccaggctgcccccgccctggctcccgaggccacccctcttatgccatgaaccctgtg ccacacccacctctgagctgtccccgctcctgccgcctgcaccccctgagcagccccctgtgtgtttcatgggagtc ttagcaaggaaggggagctcgaattcctgcagcccggg(SEQ ID NO 3) ^t^j一^ΜΤ ^ΦτΗΙΘ j^^lj 是SEQ ID NO :3的同源物。在另一实施方案中，H19序列是SEQ ID NO :3的变体。在另一 实施方案中，H19序列是SEQ ID NO :3的片段。在另一实施方案中，H19序列是SEQ ID NO: 3的片段的同源物。“同源物”可以指本文公开的任何程度的同源性。在另一实施方案中， H19序列是SEQ ID NO :3的片段的变体。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。在另一实施方案中，H19增强子序列包括以下序列ccgggtaccgagctcccaggaagataaatgatttcctcctctctagagatgggggtgggatctgagcac tcagagccaagggcgcagtgggtccgggcgggggccctcctcggccctcccaacatgggggccaggaggtcagcccc tcaacctggaccccggctgggtctcagggaatggtctcccccagtggcccagcttgcttgtgttttcagatgggtgt gcatgggtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgatgcctgacaagccccagagagccaa agacctgagtggagatcttgtgacttctcaaaagggggattggaaggttcgagaaagagctgtggtcagccttgctc tcccttaaggctgtggtaaccacactaggcatagcataggcctgcgccccgtccctccttccctcctccgcgcctct cctttctctttctcccccctctaccccgctccctggcctgctcctggtgacaccgttggcccccttccagggctgag ggaagccagcgggggccccttcctgaaagcccacctgcaggccggcttgctgggaaggggctgctctcgcagaggct cccgcccgccctgcagccgtttcctggaagcagtcgctgtgggtattctgttccttgtcagcactgtgcttgcaaag aaagcagacactgtgetccttgtccttagggagccccgctccatcacccaacacctggctggacacaggcgggaggc cgggtccgcggggagcggcgcggggctggggccggaccattaaacacacacgggcgccaggcactgcaggctcctcc tcctcctcctgcccagcgcctctgctcacaggcacgtgccaagcccctaggccaggaggccagcagtgggtgcagaa caagctcctgggaagggggtgcagggcggacccccggggagaagggctggcagggctgtgggggacgctgaccgtgg gccccacgttgcagaaaactggntgcctggctggaagatgggggagatgccaagcctctgaggcagcacgagcaggg tgcatggaggccggggcgcggggaggctgcactgcagcatgcaccccaaagcccanagggagtggagaccaggccct ggaatcgagaagtagaaaggcggcttggaggcctcggaaccggctgacctccaacagagtgggtctccagcctggct ctgccctgccgcaggtcccctcccctcattaccaggcctagagcctccagtcccggtggcccccagcccgagggtga acggcctcaccctgggtcgtgggacagagggcacgttcatcaagagtggctcccaagggacacgtggctgtttgcag ttcacaggaagcattcgagataaggagcttgttttcccagtgggcacggagccagcaggggggctgtggggcagccc agggtgcaaggccaggctgtggggctgcagctgccttgggccccactcccaggcctttgcgggaggtgggaggcggg aggcggcagctgcacagtggccccaggcgaggctctcagccccagtcgctctccgggtgggcagcccaagagggtct ggctgagcctcccacatctgggactccatcacccaacaacttaattaaggctgaatttcacgtgtcctgtgacttgg gtagacaaagcccctgtccaaaggggcagccagcctaaggcagtggggacggcgtgggtggcgggcgacgggggaga tggacaacaggaccgagggtgtgcgggcgatgggggagatggacaacaggaccgagggtgtgcgggcgatgggggag atggacaacaggaccgagggtgtgcgggacacgcatgtcactcatgcacgccaatggggggcgtgggaggctgggga gcagacagactgggctgggctgggcgggaaggacgggcagatg(SEQID NO 4)。在另一实施方案中，H19 序列是SEQ ID NO :4的同源物。在另一实施方案中，H19序列是SEQ ID NO :4的变体。在另一实施方案中，H19序列是SEQ ID NO :4的片段。在另一实施方案中，H19序列是SEQ ID NO :4的片段的同源物。“同源物”可以指本文公开的任何程度的同源性。在另一实施方案 中，H19序列是SEQ ID NO :4的片段的变体。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。在另一实施方案中，H19增强子序列包括以下序列ccgggtaccgagctcccaggaagataaatgatttcctcctctctagagatgggggtgggatctgagcac tcagagccaagggcgcagtgggtccgggcgggggccctcctcggccctcccaacatgggggccaggaggtcagcccc tcaacctggaccccggctgggtctcagggaatggtctcccccagtggcccagcttgcttgtgttttcagatgggtgt gcatgggtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgatgcctgacaagccccagagagccaa agacctgagtggagatcttgtgacttctcaaaagggggattggaaggttcgagaaagagctgtggtcagccttgctc tcccttaaggctgtggtaaccacactaggcatagcataggcctgcgccccgtccctccttccctcctccgcgcctct cctttctctttctcccccctctaccccgctccctggcctgctcctggtgacaccgttggcccccttccagggctgag ggaagccagcgggggccccttcctgaaagcccacctgcaggccggcttgctgggaaggggctgctctcgcagaggct cccgcccgccctgcagccgtttcctggaagcagtcgctgtgggtattctgttccttgtcagcactgtgcttgcaaag aaagcagacactgtgetccttgtccttagggagccccgctccatcacccaacacctggctggacacaggcgggaggc cgggtccgcggggagcggcgcggggctggggccggaccattaaacacacacgggcgccaggcactgcaggctcctcc tcctcctcctgcccagcgcctctgctcacaggcacgtgccaagcccctaggccaggaggccagcagtgggtgcagaa caagctcctgggaagggggtgcagggcggacccccggggagaagggctggcagggctgtgggggacgctgaccgtgg gccccacgttgcagaaaactggntgcctggctggaagatgggggagatgccaagcctctgaggcagcacgagcaggg tgcatggaggccggggcgcggggaggctgcactgcagcatgcaccccaaagcccanagggagtggagaccaggccct ggaatcgagaagtagaaaggcggcttggaggcctcggaaccggctgacctccaacagagtggggccggccctggagg caaagaggtgcccggggtccggccctgcctgggggagctatgtgtcatgggcaagccacaggatatgtagcccgctc tgagcctatggacccagggcagggctgcaaggcagggcaggggagacagcacgggggagcaaggagcagagaggggg cctcaggctctcccaggaggaacattctcccgacaggaggaagagacggcccaggggtgactgtggggagccatggt ggcagctggggtcgtggcagatgggagagaggctggcgaggtgaaggtgcaggggtcagggctctggggcccacatg cctgtgggagcaggcaggcccagggctctccgccactccccactcccgcttggctcataggctgggcccaagggtgg ggtgggatgagcaggagatggggcccagggggcaagcagggccccaaagacatttagaaaaaccggtttatgcaggc agcattcagagcaggcggcgtgcgtggcgggggccctgggagcacagagaggcacacgtagggcccccgaggggctc cccattggccggcagtgacatcacccctgtgtcaacagtgatgtctgcagctccggccagccagggtttatggagcg agacccagcccggcctgggccctcactccccaggcccacacactagcccactgttcagggtccggggtggcggcatg gcctgggggtcctggcaccgctgctcctctgcccaccctaacttcccggcatcgcggctgccccctctgagcgtccc caaccagtaagtgtggggcccagcaggcctgccgtcctcctcctcttcccctctagagagaaacgtggaggtcctgg ggctgggggcgctcatagccctgtgacacaggtgcatggggtcaggggtcccagaatggcccctgggaaggacctca gctgggccggcggctctaggcttcaggggtctgtctgcacaggggntagcccctcccagacctctgtgaagccagta cgggcctcccctccctgccccgtgctctgtccggtgcttcctggactgcactgcgggccactggtgagagggtggac agggaagggccgccgtggtgcctgttcctgcccacctggctgtgtggtcccctccaagtagggacaacccttctgag ggcttgggggcaccctggggttgccagggcctcccagagccctgtgagcccctggggggtctggcctgatgcccccc tccacgtccagggccggctgtggcccagaaccccagcttcccagcaggccggtgtgcggtggtgacccaggagaggc ctcgcctccactgaggggccaccgacctctgtcagaccacagagacccccaaggagtctgaaggctggagacccggggctgggaccaggtgggactttcccacggagccgtccccaggcccagctggggacacgtcccccttctctccagacac accctgcctgccaccaggacacaccggcctgttgggggtctcttttaagtgcttgccactctgaggtgactgtccct ttccaaagaggtttctgtggggcccaggtgggatgcgtcggcctgagcaggaggatctgggccgccaggggctgggg actgtctcctggggaaggaagcgcctgggagcgtgtgtgctgacccaggaccatccagggaggcccgtctgtggggc aagcgggaagggagcggctggagaggcttggccgcccccgccctgcctcccattccttagctccatgcctgtcaac ctctgtcacccagtgagtgatgtccaggggccctggaaaggtcacagcatgtttgagcggggtgagagagaggggaa aggcgggggcggggaaaagtacgtggaggaagctttaggcccaaggaaggagacagggttctgggagggagggagcc actggggccgccgggaaggtccctgcttgctgctgccacccagaaccctcgcctcttagctagcccccgcagcccca gcctttctggcntgtggccctctcccccatccccaggtgtcctgtgcaaccaggccttggacccaaaccctcctgcc ccctcctctccctcctcaccctcccaatgcagtggtctccagcctggctctgccctgccgcaggtcccctcccctca ttaccaggcctagagcctccagtcccggtggcccccagcccgagggtgaacggcctcaccctgggtcgtgggacaga gggcacgttcatcaagagtggctcccaagggacacgtggctgtttgcagttcacaggaagcattcgagataaggagc ttgttttcccagtgggcacggagccagcaggggggctgtggggcagcccagggtgcaaggccaggctgtggggctgc agctgccttgggccccactcccaggcctttgcgggaggtgggaggcgggaggcggcagctgcacagtggccccaggc gaggctctcagccccagtcgctctccgggtgggcagcccaagagggtctggctgagcctcccacatctgggactcca tcacccaacaacttaattaaggctgaatttcacgtgtcctgtgacttgggtagacaaagcccctgtccaaaggggca gccagcctaaggcagtggggacggcgtgggtggcgggcgacgggggagatggacaacaggaccgagggtgtgcgggc gatgggggagatggacaacaggaccgagggtgtgcgggcgatgggggagatggacaacaggaccgagggtgtgcggg acacgcatgtcactcatgcacgccaatggggggcgtgggaggctggggagcagacagactgggctgggctgggcggg aaggacgggcagatg(SEQ ID NO :5)。在另一实施方案中，H19序列是SEQ ID NO :5的同源物。 在另一实施方案中，H19序列是SEQ ID NO 5的变体。在另一实施方案中，H19序列是SEQ ID NO :5的片段。在另一实施方案中，H19序列是SEQ ID NO :5的片段的同源物。“同源物” 可以是指本文公开的任何程度的同源性。在另一实施方案中，H19序列是SEQ ID N0:5的 片段的变体。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。在另一实施方案中，这一增强子的片段，如SEQ ID NO :3_5中任一个所列的序列的 片段还可用于促进基因表达。在一个实施方案中，增强子由SEQ ID N0:3-5中任一个所列 的序列组成。本文进一步描述了可用于本发明的核酸构建体中以指导细胞毒性基因产物或细 胞抑制基因产物的特异性表达的IGF-II P3调节序列。在另一实施方案中，本发明的组合 物的IGF-II P3转录调节序列是IGF-II P3启动子。在另一实施方案中，P3启动子对应 于IGF-II基因的核苷酸序列-1229至+140(IGF_II基因序列的一个实例见于染色体11， NC_000011. 8，碱基对 2106926. . 2116578)。在另一实施方案中，本发明的方法和组合物的IGF-II基因序列是cccaaccccgcgcacagcgggcactggtttcgggcctctctgtctcctacgaagtccgtagagcaactc ggatttgggaaatttctctctagcgttgcccaaacacacttgggtcggccgcgcgccctcaggacgtggacagggag ggcttccccgtgtccaggaaagcgaccgggcatgcccccagtctcccccaaatttgggcattgtccccgggtcttcc aacggactgggcgnngctcccggacactgaggactggccccggggtctcgctcaccttcagcagcgtccaccgcctg ccacagagcgttcgatcgctcgctgcctgagetcctggtgcgcccgcggacgcagcctccagcttcgcggtgagctc cccgccgcgccgatcccctccgcctctgcgcccctgaccggctctcggcccgcatctgctgctgtcccgccggtgctggcgctcgtccgctgcgccggggaggccggcgtggggcgcgggacacggctgcggacttgcggctgcgctgcgctcg ctcctgctgggcgccccgaaatccgcgccactttcgtttgctcattgcaaagatctcatttgtggggaaagcggctg gagggtcccaaagtggggcgggcagggggctggggcgagggacgcggaggagaggcgctcccgccgggcggtaaagt gcctctagcccgcgggcctaggactccgccgggagggcgcgcggagngcgaagtgattgatggcggaagcggggggg caaggggggcaggggggcgcgggattccgccggcgaccccttccccttggctaggcttaggcggcggggggctggcg gggtgcgggattttgtgcgtggtttttgacttggtaaaaatcacagtgctttcttacatcgttcaaactctccagga gatggtttccccagacccccaaattatcgtggtggcccccgagaccgaactcgcgtctatgcaagtccaacgcactg aggacggggtaaccattatccagatattttgggtgggccgcaaaggcgagctacttagacgcaccccggtgagctcg gccatgcaggtaggatttgagctgtgtttcccgccctgatcctctctcctctggcggccggagcctccgtaggctcc aagcctggcccagattcggcggcgcagccggccttccgcgcgtccgcacctagcgggggctccggggctccggcgcg gcaccggggggcgctcgggatctggctgaggctccaaggcccgcgtggccggctcctcctgctggggcaggtggcgg ctgcgcgccccgcccgagcccaggggccccctcagccgcaacaaccagcaaggaccccccgactcagccccaagcca cctgcatctgcactcagacggggcgcacccgcagtgcagcctcctggtggggcgctgggagcccgcctgcccctgcc tgcccggagaccccagctcacgagcacaggccgcccgggcaccccagaaacccgggatggggcccctgaattctcta ggacgggcattcagcatggccttggcgctctgcggctccctgccccccacccagcctcgcccccgcgcaccccccag cccctgcgaccgccgcccccccccccggggccccagggccccagcccgcaccccccgccccgctcttggctcgggtt gcgggggcgggccgggggcggggcgagggctccgcgggcgcccattggcgcgggcgcgaggccagcggccccgcgcg gccctgggccgcggctggcgcgactataagagccgggcgtgggcgcccgcagttcgcctgctctccggcggagctgc gtgaggcccggccggccccggccccccccttccggccgcccccgcctcctggcccacgcctgcccgcgctctgccca ccagcgcctccatcgggcaaggcggccccgcgtcgacgccgcccgctgcctcgctgctgactcccgtcccgggcgcc gtccgcggggtcgcgctccgccgggcctgcggattccccgccgcctcctcttcatctacctcaactccccccatccc cgcttcgcccgaggaggcggttccccccgcaggcagtccggctcgcaggccgccggcgttgtcaccccccccgcgct ccccctccagccctccccccggcgcgcagcctcgggccgctcccctttccgcgctgcgtcccggagcggccccggtg ccgccaccgcctgtccccctcccgaggcccgggctcgcgacggcagagggctccgtcggcccaaaccgagctgggcg cccgcggtccgggtgcagcctccactccgccccccagtcaccgcctcccccggcccctcgacgtggcgcccttccct ccgcttctctgtgctccccgcgcccctcttggcgtctggccccggcccccgctctttctcccgcaaccttcccttcg ctccctcccgtcccccccagctcctagcctccgactccctccccccctcacgcccgccctctcgccttcgccgaacc aaagtggattaattacacgctttctgtttctctccgtgctgttctctcccgctgtgcgcctgcccgcctctcgctgt cctctctccccctcgccctctcttcggcccccccctttcacgttcactctgtctctcccactatctctgcccccctc tatccttgatacaacagctgacctcatttcccgataccttttcccccccgaaaagtacaacatctggcccgccccag cccgaagacagcccgtcctccctggacaatcagacgaattctccccccccccccaaaaaaaagccatccccccgctc tgccccgtcgcacattcggcccccgcgactcggccagagcggcgctggcagaggagtgtccggcaggagggccaacg cccgctgttcggtttgcgacacgcagcagggaggtgggcggcagcgtcgccggcttccaggtaagcggcgtgtgcgg gccgggccggggccggggctggggcggcgcgggcttgcggcgacgcccggcccttcctccgcccgctCCCggCCCgg ggcctgcggggctcggcggggcggctgagccgggggggaggaggaggaggaggaggaggacggacggctgcgggtcc cgttccctgcgcggagcccgcgctaccnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnngacgtccccgctgaagggggtegg tctgtgggtgcagggggtgccgcctcacatgtgtgattcgtgccttgcgggccctggcctccggggtgctgggtaac gaggaggggcgcggagccgcagaagcccaccctggtgtcgttgacgccggtgccagcgagaccgcgagaggaagacg ggggcgggcggggccaggatggagaggggccgagttggcaggagtcatggcagacgccacactcgcgaccatctcccccacacccctctggcctctgtccgcaacatttccaaacaggagtcccgggagagggggagaggggctgctggtctga ggctaagaagggcagagccttcgacccggagagaggccgcggccgcctgccccagtggcaacgttgaagttttccat acaacggaggtcgggaaggagaccccccccccccttcactgccctgtgaagagatgagccgggggtgcaggatggga gcccatggcacttcgctacgggatgtccagggctccggttgggggtgcaggagagaagagactggctgggaggaggg agagggcgggagcaaaggcgcgggggtgtggtcagagggagaggggtgggggttaggtggagcccgggctgggagga gtcggctcacacataaaactgaggcactgaccagcctgcaaactggatattagcttctcctgtgaaagagacttcca gcttcctcctcctcctcttcctcctcctcctcctgccccagcgagccttctgctgagctgtaggtaaccagggctgt ggagtgaaggacccccgctgccatcccactccagcctgaggcagggcagcagggggcacggcccacgcctgggcctc gggccctgcagccgccagcccgctgcctctcggacagcacccccctcccctcttttcctctgcccctgcccccacct ggcgtctctgctccctcacctgctccttccctttctgttccttcccttcggccccctccttgcccagctcaggactt 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ggaaggggctggtcctccttggagcacatgctctgtaggggtggggctgtctgccatcttggcggcgctggaggcct gagaagtggcgatgtaacgctgggctggccctgcccccatggtgtcataggacggaggcaggtcgggtgtccagcct gggcccctgcagctgtggatgccgctgagctcctgcaataatgaccgtgcagatggtcacccctcgtgtaaaattac tagtgcttcttgcaaatggaaggaactgggccttttctgtgtgcttctggacgcttcattctgcacatggccctgcg ccctcacctcggcattatgacctgtgtgttacttttgtaataaaaataatgtttataggaaagccgtgctttcaatt ttcaactgaatttgtaggttggcaaatttggtttgggaggggcacctctggcctggggcttggcctggctgccccgc tcacgccacttctctcccgcccccagacaccaatgggaatcccaatggggaagtcgatgctggtgcttctcaccttc ttggccttcgcctcgtgctgcattgctgcttaccgccccagtgagaccctgtgcggcggggagctggtggacaccct ccagttcgtctgtggggaccgcggcttctacttcagtaagtagcagggaggggcttcctcagacctggtcaggcccc tagagtgaccggtgaggatctcccatcctcaagccaggggagcacactcctaggtcagcagcccagccgcttgctct gagactttgaccttcccgccgcgtttctgagcacgtgcggtgtcccagggcatccacaccagctgcctttcccatca cacgcctccttcgaagggtgggccagaggtgccccctagacgtcaggggcatctacaggggtctccctgggcatcag aatttctgttgggggccgtgaggctcctgctcctgaggcaccgcacgcctagtgcagggcttcaggctctggaggaa gagcctgcctttcttcctgcaccttttggacattttgacaagggacgtgcgttcggtgaatgatcagaattaaaatc aataaagtgatttatataattaaaatcaataagacaagtgcagttggtgggtggcaggggtgagcggtgcatgcgcc tccttgggccccaaggctgccgtggggggtgcccacctgctgacctcaaggacgcttcagcctttcctcatgtttct ctcttggttctccagcctgggggctggcaggtgggtgcatggcccattgtccttgagaccccacccccagataggggggctgggtggatgcagaggcaggcatggtgcctgggcatgcctgatggggcaggggaggggccgctccttactggca gaggccgcaacttattccacctgacactcaccacgtgacatctttaccaccactgcttactcacgctgtgaaatggg ctcacaggatgcaaatgcacttcaaagcttctctctgaaaagttcctgctgcttgactctggaagcccctgcccgcc ctggcctctcctgtgccctctctcttgcctgccccatttgggggtaggaagtggcactgcagggcctggtgccagcc agtccttgcccagggagaagcttccctgcaccaggctttcctgagaggaggggagggccaagcccccacttgggggc ccccgtgacggggcctcctgctccctcctccggctgatggcacctgccctttggcaccccaaggtggagcccccagc gaccttccccttccagctgagcattgctgtgggggagagggggaagacgggaggaaagaagggagtggttccatcac gcctcctcagcctcctctcctcccgtcttctcctctcctgcccttgtctccctgtctcagcagctccaggggtggtg tgggcccctccagcctcccaggtggtgccaggccagagtccaagctcacggacagcagtcctcctgtgggggccctg aactgggctcacatcccacacattttccaaaccactcccattgtgagcctttggtcctggtggtgtccctctggttg tgggaccaagagcttgtgcccatttttcatctgaggaaggaggcagcagaagtcacgggctggtctgggccccactc acctcccctctcacctctcttcttcctgggacgcctctgcctgccggctctcacttccctcccctgacccgcagggt ggctgcgnccttccagggcctggcctgagggcaggggtggtttgctgggggttcggcctccgggggctgggggtcgg tgcggtgctaacacggctctctctgtgctgtgggacttccaggcaggcccgcaagccgtgtgagccgtcgcagccgt ggcatcgttgaggagtgctgtttccgcagctgtgacctggccctcctggagacgtactgtgctacccccgccaagtc cgagagggacgtgtcgacccctccgaccgtgcttccggtgagggtcctgggcccctttcccactctctagagacaga gaaatagggcttcgggcgcccagcgtttcctgtggcctctgggacctcttggccagggacaaggacccgtgacttcc ttgcttgctgtgtggcccgggagcagctcagacgctggctccttctgtccctctgcccgtggacattagctcaagtc actgatcagtcacaggggtggcctgtcaggtcaggcgggcggctcaggcggaagagcgtggagagcaggcacctgct gaccagccccttcccctcccaggacaacttccccgagatacccctgggcaagttcttccaatatgacacctggaagc agtccacccagcgcctgcgcaggggcctgcctgccctcctgcgtgcccgccggggtcacgtgctcgccaaggagctc gaggcgttcagggaggccaaacgtcaccgtcccctgattgctctacccacccaagaccccgcccacgggggcgcccc cccagagatggccagcaatcggaagtgagcaaaactgccgcaagtctgcagcccggcgccaccatcctgcagcctcc tcctgaccacggacgtttccatcaggttccatcccgaaaatctctcggttccacgtcccctggggcttctcctgacc cagtccccgtgccccgcctccccgaaacaggctactctcctcggccccctccatcgggctgaggaagcacagcagca tcttcaaacatgtacaaaatcgattggctttaaacacccttcacataccctccccccaaattatccccaattatccc cacacataaaaaatcaaaacattaaactaacccccttcccccccccccacaacaaccctcttaaaactaattggctt tttagaaacaccccacaaaagctcagaaattggctttaaaaaaaacaaccaccaaaaaaaatcaattggctaaaaaa aaaaagtattaaaaacgaattggctgagaaacaattggcaaaataaaggaatttggcactccccacccccctctttc tcttctcccttggactttgagtcaaattggcctggacttgagtccctgaaccagcaaagagaaaagaagggccccag aaatcacaggtgggcacgtcgcgtctaccgccatctcccttctcacgggaattttcagggtaaact(SEQ ID NO 10)。在另一实施方案中，IGF-II序列包含SEQ ID NO :10所列的核酸序列。在另一实 施方案中，IGF-II序列的核酸序列由SEQ ID N0:10组成。在另一实施方案中，IGF-II序 列与SEQ ID NO 10同源。在另一实施方案中，IGF-II序列是SEQ ID N0:10的变体。在另 一实施方案中，IGF-II序列是SEQ ID N0:10的片段。在另一实施方案中，IGF-II序列是 SEQ ID NO :10的片段的同源物。在另一实施方案中，IGF-II序列是SEQ ID N0:10的片段 的变体。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。在另一实施方案中，本发明的方法的IGF-II P3转录调节序列是IGF-IIP3启动子(本文也称为“P3”)。在另一实施方案中，P3启动子的序列是gagetcggccatgcaggtaggatttgagctgtgtttcccgccctgatcctctctcctctggcggccgga gcctccgtaggctccaagcctggcccagattcggcggcgcagccggccttccgcgcgtccgcacctagcgggggctc cggggctccggcgcggcaccggggggcgctcgggatctggctgaggctccaaggcccgcgtggccggctcctcctgc tggggcaggtggcggctgcgcgccccgcccgagcccaggggccccctcagccgcaacaaccagcaaggaccccccga ctcagccccaagccacctgcatctgcactcagacggggcgcacccgcagtgcagcctcctggtggggcgctgggagc ccgcctgcccctgcctgcccggagaccccagctcacgagcacaggccgcccgggcaccccagaaacccgggatgggg cccctgaattctctaggacgggcattcagcatggccttggcgctctgcggctccctgccccccacccagcctcgccc ccgcgcaccccccagcccctgcgaccgccgcccccccccccggggccccagggccccagcccgcaccccccgccccg ctcttggctcgggttgcgggggcgggccgggggcggggcgagggctccgcgggcgcccattggcgcgggcgcgaggc cagcggccccgcgcggccctgggccgcggctggcgcgactataagagccgggcgtgggcgcccgcagttcgcctget ctccggcggagctgcgtgaggcccggccggccccggccccccccttccggccgcccccgcctcctggcccacgcctg cccgcgctctgcccaccagcgcctccatcgggcaaggcggccccgcgtcgac (SEQ ID NO :8 ；前 6 个减基对 [bp]是加入的限制性位点，该限制性位点任选地可用在亚克隆中)。在另一实施方案中，IGF-II P3启动子包含SEQ ID NO :8所列的核酸序列。在另 一实施方案中，IGF-II P3启动子的核酸序列由SEQ ID NO :8组成。在另一实施方案中， IGF-II P3启动子与SEQ ID NO 8同源。在另一实施方案中，IGF-II P3启动子是SEQ ID NO :8的变体。在另一实施方案中，IGF-II P3启动子是SEQ ID NO :8的片段。在另一实施 方案中，IGF-IIP3启动子是SEQ ID NO :8的片段的同源物。在另一实施方案中，IGF-II P3 启动子是SEQ ID NO :8的片段的变体。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。在另一实施方案中，P3启动子的序列是gacgggggtgggcggggccaggatggagaggggccgagttggcaggagtcatggcagacgccacattcg cgacactctccccacaccccctctggctctgtccgcaacatttccaaacaggagtcccgggagagggggagaggggc tgctggtctgaggctaagaagggcagagccttcgacccggagagaggccgcggcccctgcccagtgggcagcgtgga agtttccatacaaggaggtgggaaggagaccccccccccccttcactgccctgtgcagagatgagccgggggtgcag gatgggagcccatggcacttcgctacgggatggtcagggctcccggttgggggtgcaggagagaagagactggctgg gaggagggagagggcgggagcaaaggcgcgggggagtggtcagcagggagaggggtggggggtagggtggagcccgg gctgggaggagtcggctcacacataaaagctgaggcactgaccagcctgcaaactggacattagcttctcctgtgaa agagacttccagcttcctcctcctcctcttcctcctcctcctcctgccccagcgagccttctgctgagctgtaggta accagggccgtggatgagactctc(SEQ ID NO: 12)。在另一实施方案中，IGF-II P3启动子包含SEQ ID NO :12所列的核酸序列。在另 一实施方案中，IGF-II P3启动子的核酸序列由SEQ ID N0:12组成。在另一实施方案中， IGF-II P3启动子与SEQ ID NO 12同源。在另一实施方案中，IGF-II P3启动子是SEQ ID NO: 12的变体。在另一实施方案中，IGF-II P3启动子是SEQ ID NO: 12的片段。在另一实 施方案中，IGF-II P3启动子是SEQ ID NO :12的片段的同源物。在另一实施方案中，IGF-II P3启动子是SEQ ID NO :12的片段的变体。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。在另一实施方案中，IGF-II P3启动子包含其Spl结合位点。在另一实施方案中， Spl结合位点是SEQ ID NO 12的残基10-18。在另一实施方案中，Spl结合位点是SEQ ID NO 12的残基388-399。在另一实施方案中，Spl结合位点是见于SEQ ID NO 8或SEQ IDNO :12中的另一 Spl结合位点。在另一实施方案中，IGF-II P3启动子包含TATA盒。在另 一实施方案中，TATA盒是SEQ ID NO 12的残基476-482。在另一实施方案中，TATA盒是见 于SEQ ID NO :8或SEQ ID NO 12中的另一 TATA盒。每种可能性代表本发明的一种分别的 实施方案。在另一实施方案中，IGF-IIP3 序列与选自 SEQ ID NO :8、SEQ ID N0:12 禾口 SEQ ID NO :17的序列至少60%同源。在另一实施方案中，IGF-II P3序列与SEQ ID NO :8或 SEQ ID NO :12至少65%同源。在另一实施方案中，IGF-II P3序列与SEQ ID NO :8或SEQ ID NO :12至少70%同源。在另一实施方案中，IGF-II P3序列与SEQ ID NO :8或SEQ ID NO :12至少72%同源。在另一实施方案中，IGF-II P3序列与SEQ ID NO :8或SEQID NO: 12至少74%同源。在另一实施方案中，IGF-II P3序列与SEQ ID NO :8或SEQ ID NO 12 至少76%同源。在另一实施方案中，IGF-II P3序列与SEQ ID NO :8或SEQ ID N0:12至少 78%同源。在另一实施方案中，IGF-IIP3序列与SEQ ID NO :8或SEQ ID N0:12至少80% 同源。在另一实施方案中，IGF-II P3序列与SEQ ID NO :8或SEQ ID N0:12至少82%同 源。在另一实施方案中，IGF-II P3序列与SEQ ID NO :8或SEQ ID NO :12至少84%同源。 在另一实施方案中，IGF-II P3序列与SEQ ID NO :8或SEQ ID NO :12至少86%同源。在 另一实施方案中，IGF-II P3序列与SEQ ID NO :8或SEQ ID NO :12至少88%同源。在另 一实施方案中，IGF-IIP3序列与SEQ ID NO :8或SEQ ID NO :12至少90%同源。在另一实 施方案中，IGF-II P3序列与SEQ ID NO :8或SEQ ID NO :12至少92%同源。在另一实施 方案中，IGF-II P3序列与SEQ ID NO :8或SEQ ID NO 12至少94%同源。在另一实施方 案中，IGF-II P3序列与SEQ ID NO :8或SEQ ID NO :12至少95%同源。在另一实施方案 中，IGF-II P3序列与SEQ ID NO :8或SEQ ID NO :12至少96%同源。在另一实施方案中， IGF-IIP3序列与SEQ ID NO :8或SEQ ID NO :12至少97%同源。在另一实施方案中，IGF-II P3序列与SEQ ID NO :8或SEQ ID NO :12至少98%同源。在另一实施方案中，IGF-II P3 序列与SEQ ID NO :8或SEQ ID NO :12至少99%同源。在另一实施方案中，IGF-II P3序 列与SEQ ID NO :8或SEQ ID NO :12超过99%同源。每种可能性代表本发明的一种分别的 实施方案。在另一实施方案中，IGF-II P3启动子包含见于相对于P3起始位点的-291-+130 的启动子元件。在另一实施方案中，IGF-II P3启动子包含见于相对于P3起始位点 的-1232-812的启动子元件。在另一实施方案中，IGF-II P3启动子包含见于相对于P3起 始位点的-238-+140的启动子元件。在另一实施方案中，IGF-II P3启动子包含见于相对 于P3起始位点的残基-515的5’的启动子元件。在另一实施方案中，IGF-II P3启动子包 含见于相对于P3起始位点残基-238的5’的启动子元件。每种可能性代表本发明的一种 分别的实施方案。本文进一步描述了可用于本发明的核酸构建体中以指导细胞毒性基因产物或细 胞抑制基因产物的特异性表达的IGF-II P4调节序列。在另一实施方案中，本发明的组合 物的IGF-II P4转录调节序列是IGF-II P4启动子(在本文还称为“P4”)。在另一实施方 案中，P4启动子的序列列在SEQ IDNO :9，如在下文列出的。在另一实施方案中，IGF-II P4启动子包含SEQ ID NO :9所列的核酸序列。在另 一实施方案中，IGF-II P4启动子的核酸序列由SEQ ID NO :9组成。在另一实施方案中，IGF-II P4启动子与SEQ ID NO :9同源。在另一实施方案中，IGF-II P4启动子是SEQ ID NO :9的变体。在另一实施方案中，IGF-II P4启动子是SEQ ID NO :9的片段。在另一实施 方案中，IGF-IIP4启动子是SEQ ID NO :9的片段的同源物。在另一实施方案中，IGF-II P4 启动子是SEQ ID NO :9的片段的变体。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。在另一实施方案中，P4的启动子序列列在SEQ ID NO 13 ggatccccaaaatgtgttccttgctttcatctgccaattttacgtaatatggctctacggcaaaattcc caatttcatatggagaattttctttaactacccctcctcacaaattggtcccccaagctagctggcccctatttgag acctctttctctatgttcccaattgcatggagcaacttctctcatcccccaaacctgtaatctatttttctggagtc tcgagtttagtcattaatcacggttcccacattaacggagtccccggggtcccctcctccaggacacccattcgcta agcccgcaaggcagaaagaactctgccttgcgttccccaaaatttgggcattgttccggctcgccggccacccactg cagcttccccaaccccgcgcacagcgggcactggtttcgggcctctctgtctcctacgaagtccccagagcaacteg gatttgggaaatttctctctagcgttgcccaaacacacttgggtcggccgcgcgccctcaggacgtggacagggagg gcttccccgtgtccaggaaagcgaccgggcattgcccccagtctcccccaaatttgggcattgtccccgggtcttcc aacggactgggcgttgctcccggacactgaggactggccccggggtctcgctcaccttcagcagcgtccaccgcctg ccacagagcgttcgatcgctcgctgcctgagetcctggtgcgcccgcggacgcagcctccagcttcgcggtgagetc cccgccgcgccgatcccctccgcctctgcgcccctgaccggctctcggcccgcatctgctgctgtcccgccggtgct ggcgctcgtctccggctgccgccggggaggc(SEQ ID NO 13)0在另一实施方案中，IGF-II P4启动子包含SEQ ID NO 13所列的核酸序列。在另 一实施方案中，IGF-II P4启动子的核酸序列由SEQ ID N0:13组成。在另一实施方案中， IGF-II P4启动子与SEQ ID NO 13同源。在另一实施方案中，IGF-II P4启动子是SEQ ID NO: 13的变体。在另一实施方案中，IGF-II P4启动子是SEQ ID NO: 13的片段。在另一实 施方案中，IGF-II P4启动子是SEQ ID NO :13的片段的同源物。在另一实施方案中，IGF-II P4启动子是SEQ ID NO :13的片段的变体。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。在另一实施方案中，IGF-II P4序列与选自SEQ ID NO 9和SEQ IDNO 13的序列 至少60%同源。在另一实施方案中，IGF-II P4序列与SEQID NO :9或SEQ ID N0:13至少 65%同源。在另一实施方案中，IGF-II P4序列与SEQ ID NO :9或SEQ ID N0:13至少70% 同源。在另一实施方案中，IGF-II P4序列与SEQ ID NO :9或SEQ ID N0:13至少72%同 源。在另一实施方案中，IGF-II P4序列与SEQ ID NO :9或SEQ ID NO :13至少74%同源。 在另一实施方案中，IGF-II P4序列与SEQ ID NO :9或SEQID NO :13至少76%同源。在另 一实施方案中，IGF-II P4序列与SEQ ID NO :9或SEQ ID NO :13至少78%同源。在另一实 施方案中，IGF-II P4序列与SEQ ID NO :9或SEQ ID NO :13至少80%同源。在另一实施 方案中，IGF-IIP4序列与SEQ ID NO :9或SEQ ID NO :13至少82%同源。在另一实施方案 中，IGF-II P4序列与SEQ ID NO :9或SEQ ID NO :13至少84%同源。在另一实施方案中， IGF-II P4序列与SEQ ID NO :9或SEQ ID NO :13至少86%同源。在另一实施方案中，IGF-II P4序列与SEQ ID NO :9或SEQ ID NO :13至少88%同源。在另一实施方案中，IGF-II P4 序列与SEQ ID NO :9或SEQ ID NO :13至少90%同源。在另一实施方案中，IGF-IIP4序列 与SEQ ID NO :9或SEQ ID NO :13至少92%同源。在另一实施方案中，IGF-II P4序列与 SEQ ID NO :9或SEQ ID NO 13至少94%同源。在另一实施方案中，IGF-II P4序列与SEQ ID NO :9或SEQ ID NO :13至少95%同源。在另一实施方案中，IGF-II P4序列与SEQ IDNO :9或SEQ ID NO :13至少96%同源。在另一实施方案中，IGF-II P4序列与SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO :13至少97%同源。在另一实施方案中，IGF-IIP4序列与SEQ ID NO :9或SEQ ID NO 13至少98%同源。在另一实施方案中， IGF-II P4序列与SEQ ID NO :9或SEQ ID NO :13至少99%同源。在另一实施方案中，IGF-II P4序列与SEQ ID NO :9或SEQ ID NO :13超过99%同源。每种可能性代表本发明的一种分 别的实施方案。在另一实施方案中，P4启动子对应于相对IGF-P4起始位点，IGF-II基因的核苷酸 序列-546至+102。在另一实施方案中，可进一步描绘来自在癌细胞中表达的基因组印记 (imprinted)和非印记基因的这些调节序列以界定获得期望的肿瘤特异性表达所需的最小 调节序列。例如，通过添加、取代或缺失可改变启动子区，然后分析其保留的肿瘤特异性表 达功能。可逐个检测H19下游增强子的各个部分增强从H19启动子转录的能力。在另一实施方案中，本发明方法和组合物的TNF-α蛋白由具有以下序列的核苷 酸分子编码tcatgagcaccgagagcatgatcagggatgtggagctggccgaggaggccctgcccaagaaaacaggcg gccctcagggcagcagaagatgcctgttcctgagcctgttcagcttcctgatcgtggccggagccaccaccctgttc tgcctgctgaacttcggcgtgatcggcccccagagagaggagttccccagagacctgagcctgatctcccccctggc ccaggctgtgagaagcagcagcagaacccccagcgacaagcccgtggcccacgtggtggccaacccccaggccgagg gccagctgcagtggctgaacagaagagccaacgccctgctggccaacggcgtggagctgagagacaaccagctggtg gtgcccagcgagggcctgtacctgatctacagccaggtgctgttcaagggccagggctgccccagcacccacgtgct gctgacccacaccatcagcagaatcgccgtgtcctaccagaccaaggtgaacctgctgtccgccatcaagagccctt gccagagagagacccccgagggcgccgaggccaagccctggtacgagcctatctacctgggcggcgtgttccagctg gagaagggcgacagactgagcgccgagatcaacagacccgactacctggatttcgccgagagcggccaggtgtactt cggcatcatcgccctgtgataatctagaaccatgg(SEQ ID NO 14)。在另一实施方案中，编码 TNF-Gt 的核酸序列由SEQ IDNO 14组成。在另一实施方案中，编码TNF-α的序列与SEQ ID NO 14 同源。在另一实施方案中，编码TNF-α的序列是SEQ ID NO :14的变体。在另一实施方案 中，编码TNF-α的序列是SEQ ID NO :14的片段。在另一实施方案中，编码TNF-α的序列 是SEQ ID NO :14的片段的同源物。在另一实施方案中，编码TNF-α的序列是SEQ ID NO: 14的片段的变体。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。在另一实施方案中，TNF-α的氨基酸序列是 MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLNFGVIGPQREEFPRDLSL ISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCP STHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEK⑶RLSAEINRPDYLDFAES GQVYFGIIAL (SEQ ID NO 15)。在另一实施方案中，TNF- a t 的序列由 SEQ ID NO 15 组成。 在另一实施方案中，TNF-α的序列与SEQ ID NO :15同源。在另一实施方案中，TNF-α的序 列是SEQ ID N0:15的变体。在另一实施方案中，TNF-α的序列是SEQ ID NO :15的片段。 在另一实施方案中，TNF-α的序列是SEQ ID NO :15的片段的同源物。在另一实施方案中， TNF-α的序列是SEQ ID NO :15的片段的变体。每种可能性代表本发明的一种分别的实施 方案。
本发明的调节序列或(如编码细胞毒性基因产物或细胞抑制基因产物的序列)中 的变化可使用本领域公知的多种化学方法和酶促方法产生。例如，可缺失限制性位点界定 的序列区域。可采用寡核苷酸定向诱变以通过确定的方式改变序列和/或在序列的特异性 区中引入限制性位点。另外，可使用DNA核酸酶如Bal31或ExoIII和Sl核酸酶产生缺失 突变体。通过将DNA与核酸酶培养增加的时间阶段而产生调节序列中逐渐更大的缺失。评价改变的序列完成所需功能的能力，如指导异源编码序列在合适的宿主细胞中 的肿瘤特异性表达。将保留指导肿瘤特异性表达的能力的任何改变的调节序列为了进一步 用途并入本发明的核酸构建体在本发明范围内。本发明的构建体可使用本领域公知的标准重组和合成方法产生。分离的核酸序列 可作为完全(即，完整)基因或其部分从其天然来源获得。核酸分子还可使用重组DNA技 术(如，聚合酶链式反应(PCR)扩增、克隆)或化学合成产生(参见如Sambrook等人，2001， Molecular Cloning :ALaboratory Manual (分子克隆实验手册)，Cold Springs Harbor Laboratory, New York ；Ausubel等人，1989，第2章和第4章)。核酸序列包括天然核酸序 列和其同系物，包括但不限于，天然等位基因变体和修饰的核酸序列，在所述修饰的核酸序 列中，核苷酸已被插入、缺失、取代和/或倒转，其方式是这样的修饰实质上不干扰核酸分 子编码本发明的功能寡核苷酸的能力。核酸分子类似物可使用本领域公知的大量方法产生(参见例如，Sambrook等人， 2001，同上)。例如，核酸分子可使用多种技术修饰，包括但不限于经典诱变技术和重组DNA 技术，如定点诱变、化学处理核酸分子以诱导突变、限制性酶裂解核酸片段、连接核酸片段、 聚合酶链式反应(PCR)扩增和/或诱变核酸序列的选择区、合成寡核苷酸混合物和连接混 合物基团以“构造”核酸分子混合物、和其组合。例如，通过筛选该核酸编码的寡核酸关于肿 瘤进展的功能，例如由本文所述的方法，可从修饰的核酸的混合物中选择核酸分子类似物。任选地，构建体还可包含在癌症特异性(如H19特异性)转录控制下的编码另外 的基因产物的一种或多种序列。构建体还可包含如本领域已知的其它的调节序列或选择标 记。本发明的核酸构建体(本文也称为“表达载体”)或本发明的构建体系统可包括使得这 种载体适于在原核细胞、真核细胞或优选地原核细胞和真核细胞二者(如穿梭载体)中复 制和整合的其它序列。另外，典型的克隆载体也可含有转录和翻译起始序列、转录和翻译终 止子和多聚腺苷酸化信号。增强子元件可刺激从连接的同源性或异源性启动子转录达1，000倍。增强子在位 于转录起始位点的下游或上游时是具有活性的。许多衍生自病毒的增强子元件具有广泛的 宿主范围并且在多种组织中具有活性。例如，SV40早期基因增强子适于许多细胞类型。适 于本发明的其它增强子包括衍生自多瘤病毒、人类或鼠巨细胞病毒(CMV)的那些增强子， 各种逆转录病毒例如鼠白血病病毒、鼠肉瘤病毒或鲁斯氏肉瘤病毒以及HIV的长期重复序 列(long term repeat)0在表达载体的构建中，启动子优选位于与自其天然配置中转录起始位点的距离大 约相同的自异源转录起始位点的距离。然而，如本领域已知的，该距离中的一些变化可调 节，而不丧失启动子的功能。多聚腺苷酸化序列还可加到表达载体以增加RNA稳定性。需要两种不同的序列元 件用于准确和有效的多聚腺苷酸化位于多聚腺苷酸化位点下游的GU或U丰富的序列和位于上游11-30核苷酸的6个核苷酸AAUAAA的高保守序列。适于本发明的示例性终止和多 聚腺苷酸化信号包括衍生自SV40的那些。除了已描述的元件，本发明的表达载体通常可含有其它特化的元件，所述元件意 于增加克隆的核酸的表达水平或促进携带重组DNA的细胞的鉴定。例如，多种动物病毒含 有促进容许细胞类型中病毒基因组的染色体外复制的DNA序列。只要质粒上携带或宿主细 胞的基因组具有的基因提供了合适的因子，携带这些病毒复制子的质粒就游离复制。载体可包括或不包括真核复制子。如果存在真核复制子，那么使用合适的选择标 记，载体是在真核细胞中可扩增的。如果载体不包含真核复制子，则游离扩增是不可能的。 相反，重组DNA整合至工程化细胞的基因组中，其中启动子指导期望核酸的表达。哺乳动物表达载体的实例包括但不限于可从Invitrogen获得的pcDNA3、 pcDNA3. 1(+/-)、pGL3、pZeoSV2(/-)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、 pCR3. 1、pSinR印5、DH26S、DHBB, pNMTl、pNMT41、pNMT81,可从 Promega 获得的 pCI，可从 Strategene 获得的 pMbac、pPbac、pBK-RSV 和 pBK_CMV，可从 Clontech 获得的 pTRES，以及 它们的衍生物。这些可作为本发明构建体的载体骨架。还可以使用含有真核病毒例如逆转录病毒的调节元件的表达载体。SV40载体包括 例如pSVT7和pMT2。衍生自牛乳头状瘤病毒的载体包括pBV-lMTHA，衍生自埃巴病毒的载 体包括pHEBO和p205。其它示例性载体包括pMSG、pAV009/A+、pMT010/A+、pMAMneo-5、杆状 病毒pDSVE，以及允许蛋白质在SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠 乳腺肿瘤病毒启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或显示对在真核细胞中 的表达有效的其它启动子的指导下表达的任何其它载体。如上所述，病毒在许多情况下是进化成逃避宿主防御机制的非常特化的感染因 子。通常，病毒在特异的细胞类型中感染和繁殖。病毒载体的靶向特异性利用了其特异性靶 向预定的细胞类型的天然特异性，由此将重组基因引入感染的细胞。因此，本发明使用的载 体类型将取决于所转化的细胞类型。根据所转化的细胞类型选择合适的载体的能力很好地 在本领域普通技术人员的能力范围内，本文不提供选择考虑因素的一般描述。例如，骨髓细 胞可使用I型人类T细胞白血病病毒(HTLV-I)靶向，肾脏细胞可使用存在于杆状病毒苜蓿 银纹夜蛾(Autographa California)多核型多角体病毒(AcMNPV)中的异源启动子靶向，如 Liang, C.Y 等)κ (2004). Highefficiency gene transfer into mammalian kidney cells using baculovirus vectors (使用杆状病毒载体高效地将基因转移到哺乳动物肾脏细胞 中).ArchVirol 149，51-60 所述。由于重组病毒载体提供诸如横向感染和靶向特异性的优点，因此它们可用于本发 明的基因的体内表达。横向感染是例如逆转录病毒的生命周期中固有的，是单个感染的细 胞产生许多萌芽的子代病毒颗粒并感染邻近细胞的过程。结果是大面积细胞迅速受感染， 其中大部分不是由最初的病毒颗粒起始感染的。这与其中感染因子仅通过子代传播的垂直 型感染不同。还可以制备不能横向传播的病毒载体。如果期望目的是将特定基因仅引入局 限数量的靶细胞中，这一特征是有用的。各种方法可用于将本发明的表达载体引入细胞。这些方法通常描述于=Sambrook 等人，同上；Ausubel 等人，Current Protocols in MolecularBiology (分子生物学最新 实验方案)，John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989) ；Chang 等人，Somatic GeneTherapy (体细胞基因治疗)，CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995) ；Vega 等人，Gene Targeting(基因革巴向)，CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995)，Vectors :A Survey of Molecular Cloning Vectors andTheir Uses (载体分子克隆载体和其应用的调查)， Butterworths, BostonMass. (1988)；禾口 Gilboa 等人[Biotechniques 4(6) :504_512， 1986]，并且包括，例如稳定转染或瞬时转染、脂质体转染、电穿孔和使用重组病毒载体感 染。另外，参见美国专利第5，464，764和5，487，992号的阳性-阴性选择方法。基因治疗可根据本发明使用基因治疗方法来预防或治疗癌症。基因治疗是指通过向受治疗 者施用表达的或可表达的核酸而进行的治疗。本领域中可获得的用于基因治疗的任何方法可根据本发明使用。已经证实长期有 效使用基因治疗载体来改善大型哺乳动物中的疾病。例如，向患有利伯先天性黑矇(由于 视网膜色素上皮细胞中基因(RPE65)突变而导致失明的疾患)的犬施用含有野生型基因的 腺相关病毒(“AAV”)已经成功地纠正了遗传缺陷(Ackland等人，2001 ,Nature Genetics 28:92)。通过RT PCR证实野生型RPE65基因的表达。而且，通过视网膜的电生理学研究以 及通过对受治疗的动物的公正观察证实功能恢复。显示治疗有效达至少四个月。基因治疗已证明在糖尿病并发症的治疗中有用。基因治疗与功能治疗性血管发生VEGF(血管内皮生长因子)和其它蛋白已经处于治疗多基因和复杂疾病诸如心肌 缺血、高血压、动脉粥样硬化和再狭窄的临床试验中(PachoriAS等人，Gene therapy :role in myocardial protection (基因治疗心肌保护中的作用)· Handb Exp Pharmacol. 2006 ； (176 Pt 2) :335-50)。进一步地，表达VEGF的质粒显示在III期研究中具有效力，在十三 名患者中进行的该研究比较了 ANGl与安慰剂在患有严重肢体缺血的糖尿病患者中的肌内 递送(Kusumanto 等人，Molecular Therapy 3 :S73)。基因治疗还已经成功用于治疗X-染色体的遗传病症，即重度联合免疫缺陷 (SCID)和慢性肉芽肿病(CGD) JnBlaese RM, Immunol Res. 2007 ；38 (1-3) :274_84综述的。进一步地，近来的研究显示，p53可成功地并治疗性地在正常和恶性组织中表达 (Fischer U, Janssen K, Schulze-Osthoff K, BioDrugs. 2007 ；21 (5) :273_97)。因此，使用包含可操作地连接于多于一种转录调节序列的异源多核苷酸的本发明 载体的基因治疗方法可用于预防或治疗癌症和过度增生疾病。本发明的载体可体内递送(即，直接递送到受治疗者)。因此，在一个实施方案中， 本发明的载体直接注射到靶组织或细胞来源部位。在另一实施方案中，本发明的载体可作 为植入物引入靶组织，例如以聚合物制剂(参见如，美国专利第5，702，717号)。在另一实 施方案中，本发明的载体靶向于期望的细胞或组织。在某些实施方案中，体内核酸转移技术(即体内基因治疗)包括使用病毒或非病 毒构建体例如腺病毒、慢病毒、I型单纯疱疹病毒或腺病毒相关病毒(AAV)和基于脂质的系 统的转染。本发明的载体可作为裸DNA直接注射到靶组织中。在另一实施方案中，本发明 的载体可使用微粒轰击引入胞内，例如通过使用Biolistic基因枪(DuPont)。质粒DNA 可用下列物质辅助递送，例如阳离子聚合物、阳离子脂质体(如lipofectin，胆固醇衍生 物如D.D.A.B.和阳离子磷脂)或其衍生物(如抗体轭合的)、聚赖氨酸轭合物、短杆菌肽S、人工病毒包被蛋白或其它上述细胞内载运体；也可以体内进行裸基因构建体的直接 注射、电穿孔或CaPO4沉淀法以及基于聚氮丙啶的非病毒基因递送系统。用于癌症基因 治疗的核酸转移和表达系统的综述包括Lungwitz (2005) Eur. J. Phar. Biopharm. 60(2) 247-66 ；Aigner (2006) J. Biotechnol. 254 12-25 ；Christopher 和 Wong(2006) Curr. Pharm. Des. 1995-2006 ；和 Wolff (2005) Acta Myol. 24 :202_8。测量肿瘤细胞中基因的表达H19、IGF-II P3和IGF-II P4驱动的在肿瘤和细胞系中的表达可例如使用RNA分 析、原位杂交或报告子基因构建体的技术确定。此外，可相似地确定具有活化的IGF-I基因 表达的肿瘤细胞，并在基因治疗中使用IGF-I启动子靶向以指导异源多核苷酸的表达。对于大多数RNA分析应用，用本领域熟知的任何多种技术制备与目的基因转录物 特异杂交的标记的探针。标记的探针可含有与H19核苷酸序列互补的至少15-30个碱基， 更优选地含有与H19转录物互补的至少50-150个碱基。针对H19表达的特别优选的杂交 探针是与H19信使的3’末端互补，从多聚腺苷酸位点上游大约800个碱基对到多聚腺苷酸 位点的多核苷酸。在本发明的具体实施方案中，用T7或T3表达质粒体外产生标记的反义RNA探 针。在标记的核苷酸的存在下通过随机引物法，例如用Prime-It试剂盒(Stratagene ，La Jolla, Calif ；目录号300392)，也能标记H19探针。可选地，标记的探针也能用PCR反应或 标准切口平移反应的方法产生，其中在PCR反应中，用H19编码区的cDNA克隆和设计为用 来扩增编码区的某一区域的引物。适于多核苷酸探针的标记包括掺入了放射性同位素(如35S和32p)、荧光标签、发 光标签和显色标签以及酶促部分的核苷酸。用标准技术使标记的探针与细胞或组织样品原位杂交，例如用美国专利第 5，955，273号中描述的技术，所述专利通过参考并入。可选地，如果能获得足够量的合适细 胞，可进行标准RNA分析(如Northern分析、RNA酶保护法或引物延伸法)以确定目的基 因mRNA的表达水平。另外，可“原位”进行上述基因表达测定，即直接在从活检或切除术获得的患者组 织的组织切片(固定的和/或冷冻的)上进行，这样不必纯化核酸。诸如上面描述的那些 核酸试剂可在这些原位方案中用作探针和/或引物(例如参见，NuOVO，1992，“PCR In Situ Hybridization =Protocols AndApplications (原位杂交的 PCR 法方法禾口应用)，，，Raven Press, NY)。确定一种细胞类型或肿瘤是否能特异地活化含有可操作地连接到异源多核苷酸 的特定转录调节序列的表达构建体的一种替代方法是把上述表达构建体实际转染到细胞 中。为这些目的，异源多核苷酸优选地是标记基因产物。对标记基因产物测定中的阳性结 果揭示，细胞或细胞系能够活化从该转录调节序列的表达。此外，还可使用足够敏感以检测微量RNA的各种扩增方法来确定肿瘤是否表达 H19和/或IGF-II。这样的方法包括PCR、RT-PCR和原位PCR(以上所有还可称为“嵌套 式”PCR和嵌套式RT-PCR)、LCR(连接酶链式反应)和3SR(自主序列复制，self sustained sequence implication)。根据优选的实施方案，使用RT-PCR和嵌套式RT-PCR。通过本领 域使用的方法诸如凝胶分离来鉴定扩增产物。
药物组合物和药盒另一方面，本发明提供包含本发明的核酸构建体和任选地一种或多种药学上可接 受的载运体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。根据一方面，本发明提供包含以下的药物组合物i)包含编码细胞毒性基因蛋白 的至少两种核酸序列的核酸构建体，其中一种核酸序列可操作地连接于H19特异性转录调 节序列，另一种核酸序列可操作地连接于IGF-II P4转录调节序列；和ii)药学上可接受的 载运体、赋形剂或稀释剂。另一方面，本发明提供包含以下的药物组合物i)包含编码细胞毒性基因蛋白的 至少两种核酸序列的核酸构建体，其中一种核酸序列可操作地连接于IGF-II P3转录调节 序列，另一种核酸序列可操作地连接于IGF-II P4转录调节序列；和ii)药学上可接受的载 运体、赋形剂或稀释剂。另一方面，本发明提供包含以下的药物组合物i)包含编码细胞毒性基因蛋白的 至少两种核酸序列的核酸构建体，其中一种核酸序列可操作地连接于H19特异性转录调节 序列，另一种核酸序列可操作地连接于IGF-IIP3转录调节序列；和ii)药学上可接受的载 运体、赋形剂或稀释剂。根据一个实施方案，本发明提供包含以下的药物组合物i)包含编码白喉毒素的 第一开放阅读框和编码白喉毒素的第二开放阅读框的核酸构建体，所述第一开放阅读框可 操作地连接于H19特异性转录调节序列，所述第二开放阅读框可操作地连接于IGF-II P4 转录调节序列；和ii)药学上可接受的载运体、赋形剂或稀释剂。在一个实施方案中，所述 核酸构建体还包含编码白喉毒素的第三开放阅读框，所述第三开放阅读框可操作地连接于 IGF-II P3转录调节序列。在另一实施方案中，本发明提供包含以下的药物组合物i)包含编码白喉毒素的 第一开放阅读框和编码白喉毒素的第二开放阅读框的核酸构建体，所述第一开放阅读框可 操作地连接于H19特异性转录调节序列，所述第二开放阅读框可操作地连接于IGF-II P3 转录调节序列；和ii)药学上可接受的载运体、赋形剂或稀释剂。在另一实施方案中，所述 核酸构建体还包含编码白喉毒素的第三开放阅读框，所述第三开放阅读框可操作地连接于 IGF-II P4转录调节序列。在另一实施方案中，本发明提供包含以下的药物组合物i)包含编码白喉毒素的 第一开放阅读框和编码白喉毒素的第二开放阅读框的核酸构建体，所述第一开放阅读框可 操作地连接于IGF-II P3转录调节序列，第二开放阅读框可操作地连接于IGF-II P4转录 调节序列；和ii)药学上可接受的载运体、赋形剂或稀释剂。在另一实施方案中，所述核酸 构建体还包含编码白喉毒素的第三开放阅读框，所述第三开放阅读框可操作地连接于H19 特异性转录调节序列。在另一实施方案中，白喉毒素是白喉毒素A (DTA)。在另一实施方案中，所述白喉毒 素包含SEQ ID NO 7所列的序列。在另一实施方案中，H19特异性转录调节序列是包含SEQ ID NO 1~2中任一个所 列的核酸序列的启动子。在另一实施方案中，IGF-II P4转录调节序列是包含SEQ ID NO :9所列的核酸序 列的启动子。
在另一实施方案中，IGF-II P3转录调节序列是包含选自SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 12和SEQ ID NO 17的序列所列的核酸序列的启动子。在另一实施方案中，所述核酸构建体是质粒或真核表达载体。在另一实施方案中，提供了含有用于一个个体哺乳动物的疗程的抗肿瘤治疗的药 品包装(pharmaceutical pack)，该药品包装包含具有单位剂型形式的本发明核酸构建体 的单位的容器。在一些实施方案中，本发明的构建体以易于施用的形式的包装提供。在其它实施 方案中，本发明的构建体以浓缩形式提供于包装中，任选地带有制备用于施用的最终溶液 所需的稀释剂。在又其它的实施方案中，产品包含可用于本发明的固体形式的化合物，任选 地包含带有用于本发明中可用的化合物的合适溶剂或载运体的单独容器。在又其它的实施方案中，以上包装/药盒包括其它组成部分，如，稀释、混合和/或 施用产品的说明书、其它容器、注射器、针头等等。其它的这样的包装/药盒组成部分对本 领域技术人员将是易于明显的。在特定实施方案中，药盒还包含向患有癌症、特别是患有特征为在肿瘤的至少一 部分细胞中表达H19RNA和/或从P3和/或P4启动子表达IGF-II的肿瘤的受治疗者施用 所述核酸构建体的说明书，如本文详述的。本文所用的“药物组合物”是指本文描述的一种或多种活性成分如编码DTA分子 的构建体与其它成分如生理上合适的载运体和赋形剂的制品。药物组合物的目的是便于向 受治疗者施用化合物。下文中，可互换使用的短语“治疗上可接受的载运体”和“药学上可接受的载运体” 是指不对生物体造成显著刺激和不废除施用的化合物的生物活性和性质的载运体或稀释 剂。本文所用的“药学上可接受的载运体、赋形剂或稀释剂”可以是指单个辅助材料或指这 种治疗上惰性的成分的各种混合物和组合。本文中术语“赋形剂”是指加入到药物组合物中以进一步便于施用活性成分的惰 性物质。特别适用于施用核酸剂的赋形剂的实例包括而不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖类和 各类型淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。在本发明的另一实施方案中，治疗组合物还包含药学上可接受的载运体。本文所 用的“载运体”是指适于用作递送治疗剂如本发明的核酸分子到合适的体内或体外部位的 运载体(vehicle)的任何物质。如此，载运体可作为包含本发明的核酸分子的治疗组合物 的药学上可接受的赋形剂起作用。特别适于施用核酸剂的优选载运体能够保持本发明的核 酸分子在这样的形式在核酸分子到达细胞时，核酸分子能够进入细胞并被细胞表达。本发 明的载运体包括(1)运输核酸分子，但不将核酸分子特异性地靶向于细胞的赋形剂或制 品(formularies)(本文称为非靶向载运体)；和(2)将核酸分子递送到受治疗者中的特定 部位或特定细胞的赋形剂或制品(即，靶向载运体)。非靶向载运体的实例包括但不限于 水、磷酸缓冲盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、含血清溶液、汉克氏溶液、其它生理上平衡的 水溶液、油类、酯类和二醇类。水性载运体可包含接近接受者的生理条件所需的合适的辅助 物质，例如，通过增强化学稳定性和等渗性。合适的辅助物质包括，例如，乙酸钠、氯化钠、乳酸钠、氯化钾、氯化钙、和用于产生 磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液和碳酸氢盐缓冲液的其它物质。辅助物质还可包括防腐剂，如硫柳汞、间甲酚和邻甲酚、福尔马林和苯甲醇。用于气雾递送的优选辅助物质包括对受治疗 者无毒的表面活性剂物质，例如，包含约六至约二十二个碳原子的脂肪酸的酯类或偏酯类。 酯类的实例包括己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、olesteric acid和油 酸。其它载运体可包括与例如穿过皮肤的基因枪一起使用的金属颗粒(如，金颗粒)。本发 明的治疗组合物可由常规方法灭菌。靶向载运体在本文称为“递送运载体”。本发明的递送运载体能够递送本发明的治 疗组合物到受治疗者中的靶部位。“靶部位”是指受治疗者中的部位，人们期望向其递送治 疗组合物。特别适于施用核酸剂的递送运载体的实例包括但不限于人工和天然含脂质的递 送运载体。天然含脂质的递送运载体包括细胞和细胞膜。人工含脂质的递送运载体包括脂 质体和微团。本发明的递送运载体可被修饰以靶向于受治疗者中的特定部位，从而将本发 明的核酸分子靶向于该部位并在该部位利用本发明的核酸分子。合适的修饰包括操纵递送 运载体的脂质部分的化学配方(chemical formula)和/或向运载体引入能够将递送运载 体特异性靶向于优选部位例如优选细胞类型的化合物。特异性靶向是指通过运载体中的化 合物与细胞表面上的分子相互作用而导致递送运载体结合到特定细胞。合适的靶向化合物 包括能够选择性(即，特异性)结合特定部位的另一分子的配体。这种配体的实例包括抗 体、抗原、受体和受体配体。例如，可将对靶细胞表面上存在的抗原特异性的抗体引入脂质 体递送运载体的外表面以将递送运载体靶向于靶细胞。操纵递送运载体的脂质部分的化学 配方可调节递送运载体的胞外和胞内靶向。例如，可向脂质体的脂质配方加入改变脂质体 脂质双层的电荷的化学品，以使脂质体与具有特定电荷特征的特定细胞融合。在某些特定实施方案中，特别适于施用核酸剂的递送运载体是脂质体。脂质体能 够在受治疗者中保持稳定足量的时间以递送本发明的核酸分子到受治疗者中优选的部位。 本发明的脂质体在其所施用于的受治疗者中优选地稳定至少约30分钟，更优选地至少约1 小时，甚至更优选地至少约24小时。本发明的脂质体包括脂质组合物，该组合物能够将本发明的核酸分子靶向于受治 疗者中特定部位或选择的部位。适于与本发明一起使用的脂质体包括任何脂质体。本发明优选的脂质体包括标准 地用于例如本领域技术人员已知的基因递送方法中的那些脂质体。在某些实施方案中，更 优选的脂质体包括具有聚阳离子脂质组合物的脂质体和/或具有轭合到聚乙二醇的胆固 醇骨架的脂质体。优选地药物组合物还可包括转染剂如DOTMA、DOPE和DC-Chol (Tonkinson等人， 1996)。转染剂的优选实例是聚(乙胺)(poly(ethylamine)，PEI)。可使用特别适于施用核酸剂的其它剂，如阳离子脂质、聚赖氨酸和树枝状聚合物 (dendrimer)。可选地，可施用裸DNA。治疗应用另一方面，本发明提供用于在需要其的受治疗者中治疗癌症的方法，该方法包括 向受治疗者施用治疗有效量的本发明核酸分子，其中所述受治疗者患有特征为在肿瘤的至 少一部分细胞中表达H19RNA和/或从P3和/或P4启动子表达IGF-II的肿瘤。另一方面，提供了用于在需要其的受治疗者中抑制肿瘤进展的方法，该方法包括 向受治疗者施用治疗有效量的本发明核酸分子，其中所述受治疗者患有特征为在肿瘤的至少一部分细胞中表达H19RNA和/或从P3和/或P4启动子表达IGF-II的肿瘤。另一方面，提供了用于在需要其的受治疗者中抑制或阻止肿瘤转移的方法，该方 法包括向受治疗者施用治疗有效量的本发明核酸分子，其中该肿瘤特征为在肿瘤的至少一 部分细胞中表达H19RNA和/或从P3和/或P4启动子表达IGF-II。另一方面，提供了用于在需要其的受治疗者中减轻或缓和与肿瘤性病症相关的症 状的方法，其中该受治疗者患有特征为在肿瘤的至少一部分细胞中表达H19RNA和/或从P3 和/或P4启动子表达IGF-II的肿瘤，该方法包括向受治疗者施用治疗有效量的本发明核 酸分子。在另一实施方案中，核酸构建体包含编码白喉毒素的第一开放阅读框，所述第一 开放阅读框可操作地连接于H19特异性转录调节序列，和编码白喉毒素的第二开放阅读 框，所述第二开放阅读框可操作地连接于IGF-II P4转录调节序列。在另一实施方案中，所 述肿瘤的细胞能够表达由H19启动子指导的转录物和/或由IGF-II P4启动子指导的转录 物。在一个实施方案中，所述核酸构建体还包含编码白喉毒素的第三开放阅读框，所述第三 开放阅读框可操作地连接于IGF-II P3转录调节序列。在另一实施方案中，核酸构建体包含编码白喉毒素的第一开放阅读框，所述第一 开放阅读框可操作地连接于H19特异性转录调节序列，和编码白喉毒素的第二开放阅读 框，所述第二开放阅读框可操作地连接于IGF-II P3转录调节序列。在另一实施方案中，所 述肿瘤的细胞能够表达由H19启动子指导的转录物和/或由IGF-II P3启动子指导的转录 物。在另一实施方案中，所述核酸构建体还包含编码白喉毒素的第三开放阅读框，所述第三 开放阅读框可操作地连接于IGF-II P4转录调节序列。在另一实施方案中，核酸构建体包含编码白喉毒素的第一开放阅读框，所述第一 开放阅读框可操作地连接于IGF-II P3转录调节序列，和编码白喉毒素的第二开放阅读框， 所述第二开放阅读框可操作地连接于IGF-IIP4转录调节序列。在另一实施方案中，所述肿 瘤的细胞能够表达由IGF-IIP3启动子指导的转录物和/或由IGF-II P4启动子指导的转 录物。在另一实施方案中，所述核酸构建体还包含编码白喉毒素的第三开放阅读框，所述第 三开放阅读框可操作地连接于H19特异性转录调节序列。在另一实施方案中，所述白喉毒素是白喉毒素A (DTA)。在另一实施方案中，所述白 喉毒素包含SEQ ID NO 7所列的序列。在另一实施方案中，H19特异性转录调节序列是包含SEQ ID NO 1~2中任一个所 列的核酸序列的启动子。在另一实施方案中，IGF-II P4转录调节序列是包含SEQ ID NO :9所列的核酸序 列的启动子。在另一实施方案中，IGF-II P3转录调节序列是包含选自SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 12和SEQ ID NO 17的序列所列的核酸序列的启动子。本发明还涉及增加受治疗者对治疗剂的敏感性的方法，该方法包括向需要其的受 治疗者施用有效量的本发明核酸分子。本文所用的“治疗”癌症(或治疗患有癌症的受治疗者)是指采取步骤来获得有 益结果或期望结果，包括但不限于，缓和或改善癌症的一种或多种症状，减轻疾病程度，延 迟或延缓疾病进展，改善、缓和或稳定疾病状态，部分或完全减退，延长存活和本领域中已知的其它有益结果。在另一实施方案中，所述受治疗者是人类。在另一实施方案中，可根据本发明方法治疗的肿瘤是在肿瘤发作或进展期间表达 H19RNA和/或从P3和/或P4启动子表达IGF-II的肿瘤。在另一实施方案中，本发明方法 的靶肿瘤的细胞内源表达由H19启动子指导的转录物(如H19转录物)和由IGF-II P3启 动子指导的转录物(如IGF-II转录物)。在另一实施方案中，靶肿瘤的细胞内源表达由H19 启动子指导的转录物和由IGF-II P4启动子指导的转录物(如IGF-II转录物)。在另一实 施方案中，靶肿瘤的细胞内源表达由IGF-II P3启动子指导的转录物和由IGF-II P4启动 子指导的转录物。在另一实施方案中，靶肿瘤是内源表达P3驱动的IGF-II转录物、P4驱 动的IGF-II转录物和H19转录物的肿瘤。在另一实施方案中，靶肿瘤内源表达IGF-II-P3、 IGF-II-P4和H19驱动的转录物中的至少两种。每种可能性代表本发明的一种分别的实施 方案。在另一实施方案中，已经对靶肿瘤进行表达H19和/或在P3或P4启动子或二者 控制下表达IGF-II的基因分型。在另一实施方案中，靶肿瘤未被基因分型。每种可能性代 表本发明的一种分别的实施方案。例如，在一些实施方案中，该肿瘤选自维尔姆斯瘤、肝母细胞瘤、胚胎横纹肌肉瘤、 生殖细胞肿瘤和滋养层肿瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、睾丸精原细胞瘤、畸胎瘤、卵巢未成熟畸 胎瘤、骶尾瘤、绒毛膜癌、胎盘部位滋养层肿瘤、膀胱癌、肝细胞癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、乳 腺癌、头颈鳞状细胞癌、食道癌、甲状腺癌、神经原性肿瘤、星形细胞瘤、恶性神经节瘤、成神 经细胞瘤、骨肉瘤、黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、肾细胞癌、结肠直肠癌、结肠癌、成神 经管细胞瘤(medulloblastoma)、成胶质细胞瘤、肾上腺皮质肿瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺 癌、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、头颈癌、口腔癌、妊娠期滋养层肿瘤、脑膜瘤和肝癌。在 一些特定实施方案中，该肿瘤选自头颈癌、口腔癌和妊娠期滋养层肿瘤。在另一实施方案中，该受治疗者患有贝-威二氏综合征(BWS)，从而具有发展H19 和/或IGF-II相关肿瘤如维尔姆斯瘤或肝母细胞瘤的倾向。在另一实施方案中，靶肿瘤是实体瘤。在另一实施方案中，靶肿瘤是癌。在某些特 定实施方案中，肿瘤可以是膀胱癌症(如膀胱癌)、肝癌(如肝细胞癌)、卵巢癌(如透明细 胞癌)、胰腺癌(如胰腺导管癌、上皮样癌)。在某些其它优选的实施方案中，所述肿瘤选自膀胱癌、肝细胞癌、卵巢癌和胰腺癌 组成的组。在另一实施方案中，靶肿瘤是膀胱癌。在另一实施方案中，靶肿瘤是肝细胞癌。 在另一实施方案中，靶肿瘤是结肠癌。在另一实施方案中，靶肿瘤是表皮膀胱癌。在另一实 施方案中，靶肿瘤是宫颈癌。在另一实施方案中，靶肿瘤是肺癌。在另一实施方案中，靶肿 瘤是肺腺癌。在另一实施方案中，靶肿瘤是小细胞肺癌。在另一实施方案中，靶肿瘤是乳腺 癌。在另一实施方案中，靶肿瘤是头颈中鳞状细胞癌。在另一实施方案中，靶肿瘤是肾细胞 癌。在另一实施方案中，靶肿瘤是食道癌。在另一实施方案中，靶肿瘤是胰腺癌。在另一实 施方案中，靶肿瘤是肝母细胞瘤。在另一实施方案中，靶肿瘤是横纹肌肉瘤。在另一实施方 案中，靶肿瘤是甲状腺癌。在另一实施方案中，靶肿瘤是恶性神经节瘤。在另一实施方案中， 靶肿瘤是卵巢癌。在另一实施方案中，靶肿瘤是鳞状细胞支气管癌。在另一实施方案中，靶 肿瘤是肝脏新生物。在另一实施方案中，靶肿瘤是结肠直肠癌。在另一实施方案中，靶肿瘤是子宫内膜癌。在另一实施方案中，靶肿瘤是睾丸瘤。在另一实施方案中，靶肿瘤是睾丸生 殖细胞瘤。在另一实施方案中，靶肿瘤是鳞状细胞支气管癌。在另一实施方案中，靶肿瘤是 前列腺癌。在另一实施方案中，靶肿瘤是维尔姆斯瘤。在另一实施方案中，靶肿瘤是星形细 胞瘤。在另一实施方案中，靶肿瘤是成神经细胞瘤。每种可能性代表本发明的一种分别的 实施方案。在另一实施方案中，本发明方法的靶疾病是其中至少一些细胞能够在H19启动子 和/或IGF-II P4启动子控制下表达转录物的细胞增生病症。在另一实施方案中，靶疾病 是其中至少一些细胞能够在H19启动子和/或IGF-II P3启动子控制下表达转录物的细胞 增生病症。在另一实施方案中，靶疾病是其中至少一些细胞能够在IGF-II P4启动子和/ 或IGF-II P3启动子控制下表达转录物的细胞增生病症。每种可能性代表本发明的一种分 别的实施方案。在另一实施方案中，本发明的方法还包括检测从受治疗者获得的肿瘤细胞中 H19RNA和/或IGF-II RNA的存在的步骤，其中至少一部分肿瘤细胞中该RNA的存在指示所 述肿瘤可由本发明方法治疗。例如，H19RNA和/或IGF-II RNA的存在可由本领域已知的 方法检测，如PCR、RT-PCR、原位PCR、原位RT-PCR、LCR和3SR、和与包含可检测部分的探针 的杂交。在其它实施方案中，RNA的存在可在源于肿瘤的细胞或组织样品中确定，或在可选 实施方案中，在含有细胞的体液标本中、接触原发肿瘤部位、或组织原发肿瘤部位以外的组 织或器官(如为了检测肿瘤转移灶)的冲洗液标本中。示例性转移肿瘤包括，如结肠直肠癌转移到肝脏和转移性乳腺癌。在特定实施方 案中，本发明的构建体用于阻止或抑制肝转移灶的形成。为了治疗患有疾病的受治疗者，以有效方式施用本发明的药物组合物于受治疗者 以使组合物能够治疗受治疗者的疾病。根据本发明，治疗疾病是指缓和疾病和/或相关的 症状和/或阻止原发疾病的出现导致的继发疾病发展。因此，术语“治疗有效量”在本文是指本发明的核酸构建体以在施用于受治疗者时 有效治疗受治疗者的量施用于受治疗者。有效施用方案(S卩，以有效方式施用药物组合物)包括导致治疗疾病的合适的剂 量参数和施用模式。有效的剂量参数和施用模式可使用本领域中特定疾病的标准方法确 定。这样的方法包括，例如，确定存活率、副作用(即，毒性)和疾病的进展或消退。根据本发明，适合的单剂量大小是当经适合的时间段施用一次或多次时能够治疗 患有疾病的受治疗者的剂量。例如，适合的单剂量大小可在需要其的受治疗者中引起肿瘤 细胞质量减少。适合用于直接注射技术的本发明的药物组合物的剂量可被本领域技术人员 用于基于受治疗者的尺寸(size)确定用于系统施用的合适的单剂量大小。适合的施用途径可以例如，包括口部、直肠、跨粘膜、特别是经鼻、肠或肠胃外递 送，包括肌内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、动脉内、囊泡 内(进入膀胱)或眼内注射。可选地，人们可以在局部而不是系统方式施用制品，例如经由直接注射制品到患 者身体的特定区域或通过直接施用到体腔如膀胱、子宫等等，在另一特定实施方案中，考虑 病灶内施用如瘤内注射。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可包括以下成分用于注射的无菌稀释剂如水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇(或其它合成溶剂)、抗菌剂(如， 苯甲醇、尼泊金甲酯)、抗氧化剂(如，抗坏血酸、亚硫酸氢钠)、螯合剂(如，乙二胺四乙 酸)、缓冲剂(如，乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐)、和调节张力的剂(如，氯化钠、葡萄糖)。可 用酸或碱调整PH，例如如盐酸或氢氧化钠。肠胃外制品可封装在安瓿、一次性注射器或玻璃 或塑料制造的多剂量小瓶中。适于肠胃外施用的药物组合物包括但不限于，含水和不含水的无菌可注射溶液或 悬浮液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得组合物与预期接受者的血液大致等渗的 溶质。这样的组合物还可包含例如水、醇类、多元醇类、甘油和植物油。即用注射溶液和悬 浮液可从无菌粉末、粒剂和片剂制备。这样的组合物应包含治疗有效量的本发明的载体和/ 或其它治疗剂、连同合适量的载运体以提供适于向受治疗者施用的形式。制剂应适合施用 模式。在某些实施方案中，本发明的组合物可用于单独治疗癌症或与针对癌症的公认或 实验性治疗方案一起治疗癌症。适于与本发明联合用于治疗癌症的治疗方法包括但不限于 化学疗法、放射疗法、光疗和光动力疗法、手术、营养疗法、烧蚀疗法、放射疗法和化学疗法 联合、臂疗法(brachiotherapy)、质子束疗法、免疫疗法、细胞疗法和光子束放射手术疗法。可与本发明构建体共同施用的抗癌药物包括但不限于阿西维辛、阿柔比星、盐 酸阿考达唑、阿克罗宁、阿霉素、阿多来新、阿地白介素、六甲密胺、安波霉素、醋酸双氢胺蒽 醌、氨鲁米特、安吓唳、阿那曲唑、安曲霉素、门冬酰胺酶、曲林菌素、阿扎胞苷、阿扎替派、固 氮霉素、巴马司他、苯佐替派、比卡鲁胺、盐酸比生群、二甲磺酸双奈法德、比折来新、硫酸博 来霉素、布喹那钠、溴匹立明、白消安、放线菌素C、卡普睾酮、卡醋胺、卡贝替姆、卡钼、卡莫 司汀、盐酸卡柔比星、卡折来新、西地芬戈、苯丁酸氮芥、西罗里霉素、顺钼、克拉屈滨、甲磺 酸克立那托、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、盐酸柔红霉素、地西他滨、右奥马 钼、地扎胍宁、甲磺酸地扎胍宁、地吖醌、多西他奇、多柔比星、盐酸多柔比星、屈洛昔芬、柠 檬酸屈洛昔芬、丙酸甲雄烷酮、偶氮霉素、依达曲沙、盐酸依氟鸟氨酸、依沙芦星、恩洛钼、恩 普氨酯、依匹哌啶、盐酸表柔比星、厄布洛唑、盐酸依索比星、雌莫司汀、雌莫司汀磷酸钠、 依他硝唑、依托泊苷、磷酸依托泊苷、氯苯乙嘧胺、盐酸法倔唑、法扎拉滨、芬维A胺、氟脲 苷、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟西他滨、磷喹酮、福司曲星钠、吉西他滨、盐酸吉西他滨、羟 基脲、盐酸去甲氧基柔红霉素、异环磷酰胺、伊莫福新、干扰素α-2a、干扰素α _2b、干扰 素α-η 、干扰素α-η3、干扰素β-la、干扰素Y _lb、异丙钼、盐酸伊立替康、醋酸兰瑞肽、 来曲唑、醋酸亮丙立得、盐酸利阿唑、洛美曲索钠、洛莫司汀、盐酸洛索蒽醌、马索罗酚、美坦 生、盐酸氮芥、醋酸甲地孕酮、醋酸美仑孕酮、美法仑、美诺立尔、巯嘌呤、甲氨蝶呤、甲氨蝶 呤钠、氯苯氨啶、美妥替哌、米丁度胺、米托克星、丝裂红素、丝裂吉菌素、丝裂马菌素、丝裂 霉素C、米托司培、米托坦、盐酸米托蒽醌、麦考酚酸、诺考达唑、诺加霉素、奥马钼、奥昔舒 仑(oxisuran)、紫杉醇、培门冬酶、佩利霉素、奈莫司汀(pentamustine)、硫酸培来霉素、培 磷酰胺、哌泊溴烷、哌泊舒凡、盐酸吡罗蒽醌、光辉霉素、普洛美坦、吓吩姆钠、罗迈新、泼尼 莫司汀、盐酸丙卡巴胼、博罗霉素、盐酸博罗霉素、吡唑呋喃菌素、利波腺苷、罗谷亚胺、沙芬 戈、盐酸沙芬戈、司莫司汀、辛曲秦、磷乙酰天冬氨酸钠、稀疏霉素、盐酸锗螺胺、螺莫司汀、 螺钼、链黑菌素、链唑霉素、磺氯苯脲、他利霉索、紫杉酚、替可加兰钠、喃氟啶、盐酸替洛蒽 醌、替莫泊芬、替尼泊苷、替罗昔隆、睾内酪、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、塞替派、噻唑呋林、替拉扎明、盐酸拓扑替康、枸橼酸托瑞米芬、醋酸曲托龙、磷酸曲西立滨、三甲曲沙、葡萄糖醛酸三 甲曲沙、曲普瑞林、盐酸妥布氯唑、尿嘧啶氮芥、乌瑞替派、伐普肽、维替泊芬、硫酸长春碱、 硫酸长春新碱、长春地辛、硫酸长春地辛、硫酸长春匹定、硫酸长春甘酯、硫酸长春罗新、酒 石酸长春瑞滨、硫酸长春瑞滨、硫酸长春利定、伏氯唑、折尼钼、净司他丁和盐酸佐柔比星。 其它抗肿瘤药剂包括公开于“Antineoplastic Agents (抗肿瘤药剂)”(Calabresi，P和 Chabner, B. A.)第 52 章，及其序论，Goodman 禾口 Gilman StJ"ThePharmacological Basis of Therapeutics (治疗的药理学基础)”，第八版，1202-1263，1990，McGraw-Hill，Inc. (Health Professions Division)的那些。每种可能性代表本发明的一种分别的实施方案。展示以下实施例以更完全地阐释本发明的一些实施方案。然而，以下实施例不应 以任何方式解释为对本发明广泛范围的限制。实验细节部分多启动子载体的概述产生在单个构建体上携带从两个不同调节序列表达DTA毒素的两个分别的基因 的双启动子表达载体，如下所示-H19 启动子 +IGF-II-P4 启动子(以下“H19-DTA-P4-DTA” ；在图 1 中描绘)；-IGF-II-P3 启动子 +IGF-II-P4 启动子(以下“P4-DTA-P3-DTA” ；随后描述)；和-H19 启动子 +IGF-II-P3 启动子；(以下 “H19-DTA-P3-DTA” ；随后描述)。转染使用体外jetPEITM转染试剂(Polyplus Transfection)如制造商建议地进行 转染。48小时后，收集细胞，使用萤光素酶测定系统(Luciferase AssaySystem)试剂盒 (Promega)确定萤光素酶活性。使用Lumac Biocounter装置测量光输出。由Bio-Rad蛋白 测定试剂确定裂解物的总蛋白含量，将结果对总蛋白标准化，表示为光单位/μ g蛋白。在 SV40转录控制下表达萤光素酶的质粒LucSV40 (Promega)用作转染效率的阳性对照，因为 其含有SV40启动子和增强子，而含有Lucl但缺少调节序列的质粒(Promega)用作阴性对 照以确定基础的非特异性萤光素酶表达(这在所有细胞系中是可忽略的)。所有实验进行 三个重复。产生H19-DTA-P4-DTA合成DTA盒和合成P4盒各自从PCR产物组装并使用SacI和KpnI限制性位点亚克 隆至IJpGA4 中(ampR，可从 GeneArt，Regensburg，Germany 获得)。从转化的 K12 XLlO gold 细菌纯化质粒DNA(Pure YieldTM质粒Midipr印，Promega)，由UV光谱法确定浓度。通过测 序验证最终的构建体,分别称为0704870 (SEQ ID NO 21)和0704867 (SEQ ID NO :23)。序 列一致性(Sequence congruence)是 100%。使用的P4启动子具有如下序列acttcccggtcggtctgtgggtgcagggggtgccgcctcacatgtgtgattcgtgccttgcgggccctg gcctccggggtgctgggtaacgaggaggggcgcggagccgcagaagcccaccctggtatgttgacgcggtgccagcg agaccgcgagaggaagacgggggtgggcggggccaggatggagaggggccgagttggcaggagtcatggcagacgcc acattcgcgacatctcccccacaccccctctggctctgtccgcaacatttccaaacaggagtcccgggagaggggga gaggggctgctggtctgaggctaagaagggcagagccttcgacccggagagaggccgcggcccctgcccagtgggca gcgtggaagtttccatacaaggaggtgggaaggagaccccccccccccttcactgccctgtgcagagatgagccgggggtgcaggatgggagcccatggcacttcgctacgggatggtccagggctcccggttgggggtgcaggagagaagaga ctggctgggaggagggagagggcgggagcaaaggcgcgggggagtggtcagcagggagaggggtggggggtagggtg gagcccgggctgggaggagtcggctcacacataaaagctgaggcactgaccagcctgcaaactggacattagcttct cctgtgaaagagacttccagcttcctcctcctcctcttcctcctcctcctcctgccccagcgagccttctgctgagc tgtagggggatcttctagagtcg(SEQID NO 9)0然后，产生仅从IGF-II P4启动子表达DTA的载体。为了产生此载体，使用NheI 和KpnI限制性位点从0704870扩增DTA序列并亚克隆到0704867。从转化的K12 KHlOB细 菌纯化质粒DNA，由UV光谱法确定浓度。通过测序验证最终的构建体(0704877)。序列一 致性是100%。为了产生H19-DTA-P4-DTA载体，使用NotI和KpnI限制性位点，从0704877扩增 P4-DTA盒并亚克隆到从H19启动子表达DTA的载体052966。052966在下文称为“H19-DTA” 并具有以下序列ggtaccgacaaccctcaccaagggccaaggtggtgaccgacggacccacagcggggtggctgggggagt cgaaactcgccagtctccactccactcccaaccgtggtgccccacgcgggcctgggagagtctgtgaggccgcccac cgcttgtcagtagagtgcgcccgcgagccgtaagcacagcccggcaacatgcggtcttcagacaggaaagtggccgc gaatgggaccggggtgcccagcggctgtggggactctgtcctgcggaaaccgcggtgacgagcacaagctcggtcaa ctggatgggaatcggcctggggggctggcaccgcgcccaccagggggtttgcggcacttccctctgcccctcagcac cccacccctactctccaggaacgtgagttctgagccgtgatggtggcaggaaggggccctctgtgccatccgagtcc ccagggacccgcagctggcccccagccatgtgcaaagtatgtgcagggcgctggcaggcagggagcagcaggcatgg tgtcccctgaggggagacagtggtctgggagggagaagtcctggaccctgagggaggtgatggggcaatgctcagcc ctgtctccggatgccaaaggaggggtgcggggaggccgtctttggagaattccaggatgggtgctgggtgagagaga cgtgtgctggaactgtccagggcggaggtgggccctgcgggggccctcgggagggccctgctctgattggccggcag ggcaggggcgggaatcctgggcggggccaccccagttagaaaaagcccgggctaggaccgaggagcagggtgaggga 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KHlOB细菌纯化质粒DNA，由UV光谱法确定浓度。通过测序验证最 终的构建体。序列一致性是100%。H19-DTA-P4-DTA 的序列是ccctcaccaagggccaaggtggtgaccgacggacccacagcggggtggctgggggagtcgaaactcgcc agtctccactccactcccaaccgtggtgccccacgcgggcctgggagagtctgtgaggccgcccaccgcttgtcagt agagtgcgcccgcgagccgtaagcacagcccggcaacatgcggtcttcagacaggaaagtggccgcgaatgggaccggggtgcccagcggctgtggggactctgtcctgcggaaaccgcggtgacgagcacaagctcggtcaactggatgggaa tcggcctggggggctggcaccgcgcccaccagggggtttgcggcacttccctctgcccctcagcaccccacccctac tctccaggaacgtgagttctgagccgtgatggtggcaggaaggggccctctgtgccatccgagtccccagggacccg cagctggcccccagccatgtgcaaagtatgtgcagggcgctggcaggcagggagcagcaggcatggtgtcccctgag gggagacagtggtctgggagggagaagtcctggaccctgagggaggtgatggggcaatgctcagccctgtctccgga tgccaaaggaggggtgcggggaggccgtctttggagaattccaggatgggtgctgggtgagagagacgtgtgctgga actgtccagggcggaggtgggccctgcgggggccctcgggagggccctgctctgattggccggcagggcaggggcgg gaatcctgggcggggccaccccagttagaaaaagcccgggctaggaccgaggagcagggtgagggagaagcttggca ttccggtactgttggtaaagccaccatggatcctgatgatgttgttgattcttctaaatcttttgtgatggaaaact 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此外，使用相同策略产生对照构建体H19-Luc-P3_Luc。H19-Luc-P3_Luc的序列如 下gacaaccctcaccaagggccaaggtggtgaccgacggacccacagcggggtggctgggggagtcgaaac tcgccagtctccactccactcccaaccgtggtgccccacgcgggcctgggagagtctgtgaggccgcccaccgcttg tcagtagagtgcgcccgcgagccgtaagcacagcccggcaacatgcggtcttcagacaggaaagtggccgcgaatgg gaccggggtgcccagcggctgtggggactctgtcctgcggaaaccgcggtgacgagcacaagctcggtcaactggat gggaatcggcctggggggctggcaccgcgcccaccagggggtttgcggcacttccctctgcccctcagcaccccacc cctactctccaggaacgtgagttctgagccgtgatggtggcaggaaggggccctctgtgccatccgagtccccaggg acccgcagctggcccccagccatgtgcaaagtatgtgcagggcgctggcaggcagggagcagcaggcatggtgtccc ctgaggggagacagtggtctgggagggagaagtcctggccctgagggaggtgatggggcaatgctcagccctgtctc cggatgccaaaggaggggtgcggggaggccgtctttggagaattccaggatgggtgctgggtgagagagacgtgtgc tggaactgtccagggcggaggtgggccctgcgggggccctcgggagggccctgctctgattggccggcagggcaggg gcgggaattctgggcggggccaccccagttagaaaaagcccgggctaggaccgaggagcagggtgagggaagcttgg cattccggtactgttggtaaagccaccatggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatccgct 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ctgtttctgaggagccttcaggattacaagattcaaagtgcgctgctggtgccaaccctattctccttcttcgccaa aagcactctgattgacaaatacgatttatctaatttacacgaaattgcttctggtggcgctcccctctctaaggaag tcggggaagcggttgccaagaggttccatctgccaggtatcaggcaaggatatgggctcactgagactacatcagct attctgattacacccgagggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttgt ggatctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcaaagaggcgaactgtgtgtgagaggtcctatgattatgtccg gttatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatggatggctacattctggagacatagcttac tgggacgaagacgaacacttcttcatcgttgaccgcctgaagtctctgattaagtacaaaggctatcaggtggctcc cgctgaattggaatccatcttgctccaacaccccaacatcttcgacgcaggtgtcgcaggtcttcccgacgatgacg ccggtgaacttcccgccgccgttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggattacgtc gccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgcggaggagttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggtcttaccgg aaaactcgacgcaagaaaaatcagagagatcctcataaaggccaagaagggcggaaagatcgccgtgtaatctcgag acgtagggtacc(SEQ ID NO :20)。实施例1 含有分别从H19和P4启动子表达的DTA基因的单个构建体的更优的抗 膀胱癌活性首先通过确定双启动子构建体H19-DTA-P4-DTA相对于单启动子构建体裂解三种 不同人类膀胱癌细胞系的能力，体外检验了所述双启动子构建体的抗癌治疗效力。通过测 量以LucSV40共转染后萤光素酶活性的抑制来确定抗肿瘤活性。以所示浓度的H19-DTA、 P4-DTA 或 H19-DTA-P4-DTA 和 2 μ g LucSV40 共转染 T24P、Umuc3 和 HT-1376 膀胱癌细胞系。 确定作为转染后细胞存活的指示物的萤光素酶活性，并与仅转染LucSV40的细胞的活性比较。H19-DTA和P4-DTA能够驱动DTA基因的表达，因此以剂量响应方式减少萤光素酶活性。 然而，H19-DTA-P4-DTA在T24P细胞中在裂解癌细胞系方面相对于每种单启动子构建体表 现出远远更优的效力(图2A-C)。当用UMUC3细胞(图3A-C)和HT_1376(图40A-B)重复 实验时获得非常相似的结果。因此，在同一构建体上携带从H19和P4表达DTA毒素的两个单独基因的DTA表达 载体相对于仅携带任一种基因的表达载体表现出裂解各种人类膀胱癌细胞系的显著更优 的能力。实施例2 含有分别从H19和P4启动子表达的DTA基因的单个构建体的更优的抗 肝癌活性在体外检验实施例1中描述的构建体对Hep3B人类肝癌(肝细胞癌)细胞的抗癌 治疗效力。如对膀胱癌细胞系观察到的，双启动子构建体H19-DTA-P4-DTA在裂解肝癌细胞 系方面相对于每种单启动子构建体表现出远远更优的效力(图4A-B)。因此，本发明的H19-DTA-P4-DTA双启动子表达载体相对于单独的任一种基因表 现出裂解肝癌细胞的显著更优的能力。实施例3 含有分别从H19和P4启动子表达的DTA基因的单个构建体的更优的抗 卵巢癌活性在体外检验实施例1中描述的构建体对ES-2人类卵巢癌(透明细胞癌)细胞的 抗癌治疗效力。如对膀胱癌细胞系观察到的，双启动子构建体H19-DTA-P4-DTA在裂解卵巢 癌细胞系方面相对于每种单启动子构建体表现出远远更优的效力(图5A-B)。因此，本发明的H19-DTA-P4-DTA双启动子表达载体相对于单独的任一种基因表 现出裂解卵巢癌细胞的显著更优的能力。实施例4 含有分别从H19和P4启动子表达的DTA基因的单个构建体的更优的抗 胰腺癌活性在体外检验实施例1中描述的构建体对PC-I仓鼠胰腺癌(胰腺导管癌)和 CRL-1469人类胰腺癌(上皮样癌)细胞的抗癌治疗效力。如对膀胱癌细胞系观察到的，双 启动子构建体H19-DTA-P4-DTA在裂解仓鼠(图6A-B)和人类(图7A-B)胰腺癌细胞系方 面相对于每种单启动子构建体表现出远远更优的效力。因此，本发明的H19-DTA-P4-DTA双启动子表达载体相对于单独的任一种基因表 现出裂解胰腺癌细胞的显著更优的能力。总之，当针对广泛的肿瘤细胞进行检验时，H19-DTA-P4-DTA表达载体相对于仅携 带任一种基因的表达载体一致地表现出显著更优的能力。跨每种这些癌细胞系的这些结果 的一致性证明本发明的H19-DTA-P4-DTA构建体总体上针对癌症的更优的能力。实施例5 含有分别的P3和P4驱动的DTA基因的单个构建体针对六种不同癌类 型的更优的活性然后，检验从IGF-II-P3和IGF_II_P4启动子表达DTA的双启动子表达构建体 P4-DTA-P3-DTA与相应的单启动子构建体相比针对两种不同人类膀胱癌细胞系(T24P和 HT-1376)的活性。将细胞共转染2yg LucSV40和图中所示浓度的P3-DTA、P4-DTA或 P4-DTA-P3-DTA。确定萤光素酶活性，并与仅转染LucSV40的细胞的活性比较。P3-DTA和 P4-DTA能够驱动DTA基因的表达，因此在两种细胞系中以剂量响应方式减少萤光素酶活性。然而，双启动子构建体P4-DTA-P3-DTA在T24P细胞(图8A-B)和HT-1376细胞(图 9A-B)中在裂解癌细胞系方面相对于每种单启动子构建体表现更优的效力。在H印3B人类 肝癌细胞中也获得非常相似的结果(图10A-B)。在ES-2人类卵巢癌细胞中也获得非常相 似的结果(图11A-B)。在PC-I仓鼠胰腺癌细胞(图12A-B)和CRL-1469人类胰腺癌细胞 (图13A-B)中也获得非常相似的结果。因此，当针对六种不同癌细胞系进行检验时，在同一构建体上携带从IGF-II-P3 和IGF-II-P4启动子表达DTA毒素的两个分别的基因的DTA表达载体相对于仅携带任一种 基因的表达载体一致地表现出显著更优的能力。跨广泛的肿瘤细胞的这些结果的一致性证 明本发明的P4-DTA-P3-DTA构建体总体上针对癌症的更优的能力。实施例6 含有分别的H19和P3驱动的DTA基因的单个构建体针对膀胱癌细胞的 更优的活性然后，检验双启动子表达构建体H19-DTA-P3-DTA与相应的单启动子构建体相比 针对人类膀胱癌细胞系T24P的能力。通过确定构建体裂解人类膀胱癌细胞系的能力体外检验其治疗效力，如通过共 转染LucSV40并测量萤光素酶活性的抑制来确定的。将人类膀胱癌细胞系T24P共转染 2 μ g LucSV40和图中所示浓度的H19-DTA、P3-DTA或H19-DTA-P3-DTA。确定萤光素酶活 性，并与仅转染LucSV40的细胞的活性比较。H19-DTA和P3-DTA能够驱动DTA基因的表 达，因此在所有三种细胞系中以剂量响应方式减少萤光素酶活性。然而，双启动子构建体 H19-DTA-P3-DTA在裂解所述癌细胞系方面相对于每种单启动子构建体表现出更优的效力 (图 14A-B)。因此，当针对膀胱癌细胞进行检验时，在同一构建体上携带从H19和IGF-II-P3启 动子表达DTA毒素的两个分别的基因的DTA表达载体相对于仅携带任一种基因的表达载体 表现出显著更优的能力。实施例7 分别从H19和P4启动子表达的DTA基因当存在于单个构建体时表现大 于加和的抗癌活性然后，在人类膀胱癌细胞系T24P和HT-1376、人类卵巢癌细胞系ES-2、人类肝癌细 胞系H印3B、仓鼠胰腺细胞系PC-I和人类胰腺癌细胞系CRL-1469中检验双启动子构建体 H19-DTA-P4-DTA的大于加和的抗癌作用的存在。将T24P、ES-2、H印3B、PC-I和CRL-1469 共转染2yg LucSV40和(a)图中所示浓度的单启动子构建体H19-DTA+P4-DTA的组合、或 (b)与单启动子构建体中的一种构建体相同量的H19-DTA-P4-DTA。因此，接受两种单启动 子构建体的样品中共转染的DNA的总量是以H19-DTA-P4-DTA转染的细胞的两倍。确定萤 光素酶活性，并与仅转染LucSV40的细胞的活性比较。双启动子构建体H19-DTA-P4-DTA在 T24P细胞中在裂解所述癌细胞系方面相对于两种单启动子构建体(H19-DTA+P4-DTA)的组 合活性表现更优的效力(图15A-B)。在H印3B人类肝癌细胞(图16A-B)、ES_2人类卵巢癌 细胞(图17A-B)、PC-I仓鼠胰腺细胞(图18A-B)、CRL-1469人类胰腺癌细胞(图19A-B) 和HT-1376细胞(图23A-B)中获得非常相似的结果。因此，当针对广泛的肿瘤细胞进行检验时，在单个表达载体上存在的H19驱动的 和IGF-II P4驱动的DTA-编码基因相对于仅携带任一种基因的表达载体表现出大于加和 的抗癌活性。跨每种这些癌细胞系的这些结果的一致性证明本发明的H19/P4构建体总体
64上针对癌症的更优的能力。实施例8 分别从P3和P4启动子表达的DTA基因当存在于单个构建体时表现大 于加和的抗癌活性然后，完全如前一实施例所述的，在HT-1376、ES-2、H印3B、PC-I和CRL-1469细 胞中检验P4-DTA-P3-DTA双启动子质粒的大于加和的抗癌作用的存在。双启动子构建 体P4-DTA-P3-DTA在HT-1376细胞中在裂解癌细胞系方面相对于两种单启动子构建体 (P3-DTA+P4-DTA)的组合活性表现更优的效力(图20A-B)。在ES-2细胞(图21A-B) ,Hep3B 细胞(图22)和CRL-1469细胞(图24A-B)中获得非常相似的结果。因此，当针对广泛的肿瘤细胞进行检验时，在单个表达载体上存在的IGF-II P3驱 动的和IGF-II P4驱动的DTA-编码基因相对于仅携带任一种基因的表达载体表现大于加 和的抗癌活性。跨每种这些癌细胞系的这些结果的一致性证明本发明的P3-DTA-P4-DTA构 建体总体上针对癌症的更优的能力。实施例9 膀胱癌动物模型皮下膀胱肿瘤的异位模型将于磷酸缓冲盐水中的2X IO6 T24P或3X106 HT-1376人类膀胱癌细胞皮下注射 到6-7周大的裸(nude)雌性小鼠背部以建立异位的膀胱肿瘤。接种10天后，出现可测量 的肿瘤，用 H19-DTA-P4-DTA、P4-DTA-P3-DTA 和 H19-DTA-P3-DTA 表达载体治疗。治疗异位皮下肿瘤将动物分成相同大小的组(η = 6)。向每个肿瘤施用25 μ g/肿瘤的表达载 体(分别是 P4-DTA-P3-DTA、H19-DTA-P4-DTA 或 H19-DTA-P3-DTA)或对照载体(分别是 P4-Luc-P3-Luc、H19-Luc-P4-Luc 或 H19-Luc-P3_Luc)的 3 次注射。在每个时间点，使用卡 尺测量肿瘤大小，根据式宽度2X长度X0. 5计算肿瘤体积。最后一次注射3天后处死动 物，切下肿瘤，测量其活体外重量和体积。实施例10 :H19-DTA-P4-DTA构建体在几种体内膀胱癌模型中表现大于加和的抗
癌活性T24P 结果在体内膀胱癌模型中检验H19-DTA-P4-DTA的抗癌治疗活性。将T24P人类膀胱癌 细胞皮下注射到无胸腺雌性小鼠的背部以模拟异位膀胱癌。10天后，小鼠发展可测量的异 位肿瘤。通过向每个异位膀胱癌肿瘤直接施用25 μ g表达载体或对照载体(分别在H19启 动子、P4启动子或两种启动子下表达萤光素酶的H19-Luc、P4-Luc和H19-Luc-P4-Luc)的3 次注射而检验载体的治疗效力。确定肿瘤大小，在每次治疗结束时计算肿瘤大小的体内增 加倍数。以两天的间隔三次注射H19-DTA(图25)和P4_DTA(图26)分别与H19_Luc和 P4-Luc治疗相比，分别能够抑制肿瘤发展达至少49%和57%。然而，以两天的间隔三次注 射双启动子质粒H19-DTA-P4-DTA与H19-Luc-P4-Luc治疗相比抑制肿瘤发展至少70% (图 27)。因此，双启动子构建体与每种单启动子构建体(H19-DTA和P4-DTA)相比表现抑制肿 瘤体内发展的增强的能力。为了证明H19-DTA-P4-DTA与H19-Luc-P4_Luc组之间的差异，切下肿瘤并活体外 确定其重量和体积。用H19-DTA-P4-DTA治疗的小鼠表现出与H19-Luc-P4-Luc治疗相比，活体外肿瘤体积减少至少61% (图28)且活体外肿瘤重量减少至少54% (图29)。为了检验H19-DTA-P4-DTA的体内抗癌活性是否大于加和，用每种单启动子构 建体25 μ g的H19-DTA+P4-DTA组合的三次注射治疗另一组含有T24P肿瘤的小鼠。因 此，施用的共转染DNA的总量是H19-DTA-P4-DTA组的两倍。如图30所示，与组合的 H19-Luc+P4-Luc治疗的小鼠相比，接受H19-DTA和P4-DTA质粒二者的小鼠中的肿瘤发展 被抑制了 63%。与用对照质粒H19-LUC-P4-LUC治疗的小鼠相比，在用双-启动子构建体 H19-DTA-P4-DTA治疗的小鼠中观察到增强的作用，其中肿瘤发展被抑制了 70% (图27)。 因此，H19-DTA-P4-DTA载体表现大于加和的体内抗癌活性。图31概述了所有T24P膀胱癌模型数据。H19-DTA-P4-DTA清楚地表现优于单独的 每种单启动子质粒的活性以及还优于其组合的活性。HT-1376 结果在另一膀胱癌模型HT-1376中检验H19-DTA-P4-DTA的治疗能力。如对T24P模型 所述的进行实验。对包含HT-1376肿瘤的小鼠施用25ygH19-DTA和25yg P4-DTA的组 合或25 μ g H19-DTA-P4-DTA。与组合的H19-Luc+P4_Luc治疗的肿瘤相比，施用H19-DTA 和P4-DTA的组合抑制肿瘤发展至少64. 5 % (图32)，而与H19-Luc-P4-Luc治疗相比 H19-DTA-P4-DTA抑制肿瘤发展至少67% (图33)。因此，与单启动子构建体的组合活性相 比，H19-DTA-P4-DTA表现增强的抗肿瘤活性。实施例11 :P4-DTA-P3-DTA构建体在体内膀胱癌模型中表现大于加和的抗癌活性然后，如上文在实施例9-10中描述的，检验P4-DTA-P3-DTA在T24P体内膀胱癌模 型中的抗癌治疗活性。实验如上述进行。以两天的间隔三次注射？3-014与？3-1^(治疗相比能够抑制肿瘤生长至少50.5% (图34)，而以相同方式施用的P4-DTA与P4-LUC治疗相比抑制肿瘤生长至少57 % (图35)。 相反，以两天的间隔3次注射双启动子质粒P4-DTA-P3-DTA与P3-Luc/P4-Luc治疗相比抑 制肿瘤发展至少70% (图36)。因此，P4-DTA-P3-DTA与每种单启动子构建体(P3-DTA和 P4-DTA)相比表现增强的抗肿瘤活性。为了检验P4-DTA-P3-DTA的体内抗癌活性是否大于加和，用每种单启动子构建体 25 μ g的P3-DTA+P4-DTA组合的三次注射治疗另一组含有T24P肿瘤的小鼠。因此，施用的 共转染DNA的总量是P4-DTA-P4-DTA组的两倍。与组合的P3-Luc+P4-Luc治疗相比，肿瘤 发展被抑制了至少63.3% 37)，其小于用P4-DTA-P3-DTA治疗观察到的70% (图36)。 因此，P4-DTA-P3-DTA载体表现大于加和的体内抗癌活性。实施例12 :H19-DTA-P3-DTA表达载体的体内肿瘤生长抑制然后，如上文在实施例9-10中描述的，检验双启动子质粒H19-DTA-P3-DTA在T24P 体内膀胱癌模型中的抗癌治疗活性。实验如上述进行。以两天的间隔三次注射H19-DTA与H19-LUC治疗相比能够抑制肿瘤生长至少49% (图25)，而以相同方式施用的P3-DTA与P3-LUC治疗相比抑制肿瘤生长至少50. 5% (图 38)。相反，以两天的间隔3次注射H19-DTA-P3-DTA与H19-Luc-P3-Luc治疗相比抑制肿瘤 发展至少59% (图39)。因此，H19-DTA-P3-DTA与每种单启动子构建体(H19-DTA和P3-DTA) 相比表现增强的抗肿瘤活性。总之，本文展示的结果证明，本发明的多启动子构建体与相应的单启动子构建体相比，展现增强的、大于加和的抑制肿瘤发展的能力。 具体实施方案的前述描述将如此完全地揭示本发明的一般特征，以致其它人通过 应用现有知识能够不经过度试验而为了各种应用容易地修改和/或改变这样的具体实施 方案并不偏离总范围，因此，这样的改变和修改应该并且意为包涵在公开的实施方案的等 价物的含义和范围中。应理解的是，本文采用的措辞或术语是为了描述而非限制。为了实 现各种公开的功能的工具、材料和步骤可采用多种替代形式而不偏离本发明。
权利要求
一种核酸构建体，包含a)编码白喉毒素的第一开放阅读框，所述第一开放阅读框可操作地连接于H19特异性转录调节序列；和b)编码白喉毒素的第二开放阅读框，所述第二开放阅读框可操作地连接于选自IGF II P4序列和IGF II P3序列的IGF II转录调节序列。
2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述白喉毒素是白喉毒素A(DTA)。
3.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述H19特异性转录调节序列是包含SEQ ID NO 1-2中任一个所列的核酸序列的启动子。
4.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述IGF-IIP4转录调节序列是包含SEQ ID NO :9所列的核酸序列的启动子。
5.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体是质粒。
6.一种真核表达载体，包含权利要求1所述的核酸构建体。
7.根据权利要求2所述的核酸构建体，其中所述白喉毒素包含SEQIDNO :7所列的序列。
8.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述IGF-II转录调节序列是IGF-IIP4转 录调节序列。
9.根据权利要求8所述的核酸构建体，所述核酸构建体还包含编码白喉毒素的第三开 放阅读框，所述第三开放阅读框可操作地连接于IGF-II P3转录调节序列。
10.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述IGF-II转录调节序列是IGF-IIP3 转录调节序列。
11.根据权利要求10所述的核酸构建体，所述核酸构建体还包含编码白喉毒素的第三 开放阅读框，所述第三开放阅读框可操作地连接于IGF-IIP4转录调节序列。
12.一种用于在需要其的人类受治疗者中治疗肿瘤的方法，包括向所述人类受治疗者 施用权利要求1所述的核酸构建体，其中所述肿瘤的细胞能够表达由H19启动子指导的转 录物、由IGF-II P3启动子指导的转录物或由IGF-II P4启动子指导的转录物，从而治疗人 类受治疗者的肿瘤。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述肿瘤是癌。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述肿瘤选自膀胱癌、肝细胞癌、卵巢癌和胰腺 癌组成的组。
15.一种用于在需要其的人类受治疗者中抑制肿瘤进展的方法，包括向所述人类受治 疗者施用权利要求1所述的核酸构建体，其中所述肿瘤的细胞能够表达由H19启动子指导 的转录物、由IGF-II P4启动子指导的转录物或由IGF-II P3启动子指导的转录物，从而抑 制人类受治疗者的肿瘤进展。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述肿瘤是癌。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述肿瘤选自膀胱癌、肝细胞癌、卵巢癌和胰腺 癌组成的组。
18.一种用于在需要其的人类受治疗者中抑制肿瘤转移的方法，包括向所述人类受治 疗者施用权利要求1所述的核酸构建体，其中所述肿瘤的细胞能够表达由H19启动子指导 的转录物、由IGF-II P4启动子指导的转录物或由IGF-II P4启动子指导的转录物，从而抑制人类受治疗者的肿瘤进展。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述肿瘤是癌。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述肿瘤选自膀胱癌、肝细胞癌、卵巢癌和胰腺 癌组成的组。
21.一种核酸构建体，包含a)编码白喉毒素的第一开放阅读框，所述第一开放阅读框可操作地连接于IGF-IIP3 转录调节序列；和b)编码白喉毒素的第二开放阅读框，所述第二开放阅读框可操作地连接于IGF-IIP4 转录调节序列。
22.根据权利要求21所述的核酸构建体，其中所述白喉毒素是白喉毒素A(DTA)。
23.根据权利要求21所述的核酸构建体，其中所述IGF-IIP3转录调节序列是包含选 自SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 12和SEQ ID NO 17的序列所列的核酸序列的启动子。
24.根据权利要求21所述的核酸构建体，其中所述IGF-IIP4转录调节序列是包含SEQ ID NO :9所列的核酸序列的启动子。
25.根据权利要求21所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体是质粒。
26.一种真核表达载体，包含权利要求21所述的核酸构建体。
27.根据权利要求22所述的核酸构建体，其中所述白喉毒素包含SEQIDN0:7所列的 序列。
28.根据权利要求21所述的核酸构建体，所述核酸构建体还包含编码白喉毒素的第三 开放阅读框，所述第三开放阅读框可操作地连接于H19特异性转录调节序列。
29.一种用于在需要其的人类受治疗者中治疗肿瘤的方法，包括向所述人类受治疗者 施用权利要求21所述的核酸构建体，其中所述肿瘤的细胞能够表达由IGF-II P3启动子指 导的转录物或由IGF-II P4启动子指导的转录物，从而治疗人类受治疗者的肿瘤。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述肿瘤是癌。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述肿瘤选自膀胱癌、肝细胞癌、卵巢癌和胰腺 癌组成的组。
32.一种用于在需要其的人类受治疗者中抑制肿瘤进展的方法，包括向所述人类受治 疗者施用权利要求21所述的核酸构建体，其中所述肿瘤的细胞能够表达由IGF-II P3启动 子指导的转录物或由IGF-II P4启动子指导的转录物，从而抑制人类受治疗者的肿瘤进展。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述肿瘤是癌。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述肿瘤选自膀胱癌、肝细胞癌、卵巢癌和胰腺 癌组成的组。
35.一种用于在需要其的人类受治疗者中抑制肿瘤转移的方法，包括向所述人类受治 疗者施用权利要求21所述的核酸构建体，其中所述肿瘤的细胞能够表达由IGF-II P3启动 子指导的转录物或由IGF-II P4启动子指导的转录物，从而抑制人类受治疗者的肿瘤进展。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述肿瘤是癌。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述肿瘤选自膀胱癌、肝细胞癌、卵巢癌和胰腺 癌组成的组。
38.一种核酸构建体，包含编码细胞毒性基因产物或细胞抑制基因产物的第一开放阅读框，所述第一开放阅读框 可操作地连接于第一转录调节序列；和编码所述细胞毒性基因产物或细胞抑制基因产物的第二开放阅读框，所述第二开放阅 读框可操作地连接于第二转录调节序列；其中所述第一转录调节序列和所述第二转录调节序列选自以下组成的组 i)第一转录调节序列是H19特异性转录调节序列，第二转录调节序列是IGF-II P4转 录调节序列； )第一转录调节序列是H19特异性转录调节序列，第二转录调节序列是IGF-II P3转 录调节序列；和iii)第一转录调节序列是IGF-II P4转录调节序列，第二转录调节序列是IGF-II P3 转录调节序列。
39. 一种用于在需要其的人类受治疗者中治疗肿瘤、抑制肿瘤进展或抑制肿瘤转移的 方法，包括向所述人类受治疗者施用权利要求38所述的核酸构建体，其中所述肿瘤的细胞 能够表达由H19启动子指导的转录物、由IGF-II P3启动子指导的转录物或由IGF-II P4 启动子指导的转录物。
全文摘要
本发明涉及癌症治疗领域，特别是可用于治疗表达H19和/或IGF-II的肿瘤的新颖构建体。更具体地，本发明提供利用使得能够表达由多于一种肿瘤特异性启动子指导的细胞毒性基因产物的核酸构建体的组合物和方法。
文档编号C12N15/11GK101903046SQ200880121367
公开日2010年12月1日 申请日期2008年10月23日 优先权日2007年10月25日
发明者亚弗拉罕·霍奇伯格, 多伦·阿米特 申请人:耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展有限公司