专利名称：一种含黄芪多糖的羊胚胎体外培养液及其培养方法
技术领域：
本发明涉及一种适用于羊胚胎切割后的体外培养的含黄芪多糖的羊 胚胎体外培养液及其培养方法，属于家畜胚胎工程技术领域。
(二)
背景技术：
胚胎切割是胚胎工程的重要组成部分，是运用人工方法将哺乳动物 附植前胚胎分成若干个具有继续发育潜力的部分，从而获得同卵双生或 同卵多生后代的生物技术。在胚胎数一定的情况下，通过胚胎分割可获 得较多的后代，有助于提高动物的繁殖力，增加羊、羊等单胎动物的双
胎率；同时也是细胞核移植、胚胎嵌合、胚胎性别鉴定、基因导入等研 究工作的基本操作技术，在畜牧生产、实验生物学或医学上均具有重要 意义。虽然通过胚胎切割技术已经获得了活的后代，但胚胎切割后的体 外发育率和移植后的体内发育率较低，限制了胚胎切割技术在实践中的 推广应用。
完整的早期胚胎被切割后，透明带和部分细胞受到破坏是导致切割 后胚胎体外和体内发育率降低的主要原因。目前，羊切割后的半胚一般 在体外做短暂培养后才能移植。胚胎经分割后获得的半胚，可放入M199 等胚胎常规培养液中，在38.5。C、 5% C02混合空气的培养箱内培养， 使胚胎修复或发育到嚢胚期后再进行胚胎移植。为了提高切割胚的成活 率，人们曾致力于体外培养条件的改善，将半胚与输卵管上皮细胞共培 养，但未发现显著作用。胚胎透明带在维持致密化之间胚胎的三维结构 中起着重要的作用，它使胚胎细胞间保持良好的接触，同时保护胚胎细胞免受胚胎外的免疫细胞等有害因素的影响，并有利于胚胎顺利通过输 卵管。胚胎切割后透明带受到损伤，因此体外培养期间，必须采用一定 措施修复透明带，已证实利用不溶性的琼脂包绕已分割的胚胎，可封闭 透明带上的缺口，使移植后的切割胚胎在生殖道内正常发育，但该方法
操作复杂，不适用于生产中推广应用。Tominaga等在羊的半胚培养液 中加入0.1%或1%的solcolseryl,发现可以提高半胚的成活率。说明培 养条件的改善在 一 定程度上可以提高切割胚的成活率。
除上述切割时对胚胎透明带和细胞的机械损伤外，氧化应激损伤也 是导致切割胚胎发育率降低的一个重要因素。由于生殖道内氧的浓度为 7%左右，但切割后胚胎的体外培养在约含20%氧气的培养箱中完成， 因此产生了比体内培养时更高的自由基浓度。自由基是细胞内正常代谢 中产生的，在体内正常环境下，自由基的产生和消除处于平衡状态。当 自由基过量或持续产生时，平衡遭到破坏，过量的自由基会损害细胞内 的脂质、核酸以及蛋白质，使有关早期胚胎发育的蛋白质没有得到表达 或蛋白结构受到破坏，因而降低了切割后胚胎的体外和体内发育率。
因此，改善胚胎切割后的体外培养液，以修复胚胎的损伤和緩解氧化 应激损伤是提高切割胚胎体外和体内发育率的重要手段,但目前尚无有效 的胚胎切割修复培养液。
黄芪多糖是从黄芪中提取的一种多糖，具有增强免疫功能、抗肿瘤 作用、保护作用，可提高血中抗氧化相关酶的活性，降低相关组织的过 氧化脂质水平，具有良好的抗氧化作用。对于黄芪多糖的研究已有文献 报道。CN1191358C、 CN1262669C、 CN1157414C等多种专利申请公 开了黄芪多糖的提取方法。CN1290512C、 CN1240393C等多种专利公 开了黄芪多糖用作抗肿瘤、降血脂和保健品的用途。但到目前为止，尚未见有关黄芙多糖用于家畜繁殖技术领域，特别是用于切割后胚胎体外 培养的报道。
发明内容
本发明即是为了解决现有技术中羊胚胎切割后的细胞及透明带损伤 和切割胚胎体外培养液中自由基过多，导致切割胚胎体外和体内发育率较 低的不足，提供了一种具有及时修复切割胚胎的损伤，清除胚胎胞体内及 培养环境中过量自由基、提高胚胎发育率功能的含黄芪多糖的羊胚胎体 外培养液及其培养方法。
本发明采用的技术方案是
黄芪多糖在制备羊胚胎体外培养液中的应用。具体的，所述应用如 下所述的羊胚胎体外培养液以常M^培养液为基质，所述基质添加有5~ 100(xg/mL(以黄芪多糖纯量计，下同)的黄芪多糖、100IU/mL的青霉素、 100(ig/mL的链霉素及5 ~ 10mg/mL的血清白蛋白，所述常规胚胎培养液 为人工合成输卵管液或M199、 DMEM中的一种。
一种含黄芪多糖的羊胚胎体外培养液，所述羊胚胎体外培养液以常规
胚胎培养液为基质，所述基质中还含有5 100吗/mL的黄芪多糖、
100IU/mL的青霉素、100pg/mL的链霉素及5 ~ 10mg/mL的血清白蛋白，
所述常规胚胎培养液为人工合成输卵管液或M199、 DMEM中的一种。 黄芪多糖(Astragalus polysaccharides, APS)是从黄芪中提取的一
种多糖，是黄芪的主要活性成分之一，大量体内外实验及临床研究表明，
黄芪多糖具有增强机体免疫功能、强心降压、降血糖、抗应激、抗肿瘤、
抗病毒、抗辐射、抗氧化等多种药理功效，此外，黄芪多糖内含氨基酸，
维生素，微量元素等多种营养物质，可促进切割后胚胎的修复。
黄芪多糖有多种制取方法，属于已知工艺和成熟技术，并已有商品出售，较为成熟的生产厂家有上海康希生物科技有限公司、内蒙古鑫兴生 物科技开发有限公司、四川世坤植化有限公司、安徽宣城市百草植物工贸 有P艮公司、杭州禾田生物技术有限公司等。本发明中所用黄芪多糖由杭州
禾田生物技术有限公司提供，纯度为80%。
具体的，所述羊胚胎体外培养液每1000mL组成如下 黄芪多糖 5~100mg 青霉素 100000IU 链霉素 100000 jig
血清白蛋白 5~10g 常规胚胎培养液补足至1000mL。
优选的，所述常规胚胎培养液为人工合成输卵管液(synthetic oviduct fluid, SOF)。
优选的，所述含有黄芪多糖的羊胚胎体外培养液中黄芪多糖含量为 10iug/mL,所述血清白蛋白含量为8mg/mL。
本发明还涉及一种应用所述含黄芪多糖的羊胚胎体外培养液进行羊 胚胎体外培养的方法，所述方法包括将受精后的早期羊胚胎用人合成输 卵管液反复冲洗后，放入所述含黄芪多糖的羊胚胎体外培养液中进行切 割，切割后的羊胚胎再用所述含黄芪多糖的羊胚胎体外培养液，于38-39°C、 5。/。C02的环境内，进行胚胎体外培养。
所述早期羊胚胎由羊卵母细胞经体外成熟培养、体外受精获得。
所述羊卵母细胞体外成熟培养方法如下从屠宰场获取的卵巢中用注 射器抽取的羊卵母细胞，用成熟培养液在38~39°C、 5。/。C02的环境内培 养20 24小时，获得成熟的羊卵母细胞；所述成熟培养液以常规成熟培养液为基质，所述基质中还含有100IU/mL的青霉素、100吗/mL的链霉 素及体积百分含量8%~20%的血清，所述常规成熟培养液为M199、 DMEM、 F12、 MEM培养液中的一种或两种以上的混合物。
所述羊卵母细胞体外受精方法如下将成熟的羊卵母细胞与精子一同 ;改入受精培养液中，在38 39。C、 5%C02的环境内培养15 ~ 18小时，进 行受精，获得早期羊胚胎；所述受精培养液为含5 10mg/mL肝素的BO 液或Tyrode，s改良液。
所述羊胚胎来自为山羊或者绵羊。所述血清白蛋白通常选用牛血清白 蛋白。所述的血清为小牛血清、胎牛血清或者新生牛血清中一种。
所述羊胚胎切割方法如下先在培养i上轻轻划一痕迹，将胚胎移至 划线中部，用显微手术刀或玻璃针在胚胎中部从上至下将胚胎一分为二， 再将半胚移入干净液滴中冲洗。
本发明胚胎体外培养液,是根据切割后胚胎体外培养时细胞修复和抗 氧化、抗自由基的需要，结合黄芪多糖的特点和功能研制而成。黄芪多 糖内含氨基酸，维生素，微量元素等多种营养物质，可促进切割后胚胎 的修复。此外黄芪多糖能调动和激活细胞内的抗氧化防御系统(超氧化 物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽硫转 移酶等)的生理活性，在抗氧化作用上与以上物质具有协同作用，能够更 好地发挥防御体统的作用，维持体内自由基的动态平衡。因此黄芪多糖 应用于羊胚胎体外培养，不仅可以促进切割后胚胎的修复，还可以有效地
去除培养过程中产生的多余自由基，解决了目前羊切割胚胎发育率低的问
题。其经济成本较低，便于在生产中推广应用。 具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围
并不仅限于此
实施例1:制备含黄芪多糖的羊胚胎体外培养液
准确称取黄芪多糖(杭州禾田生物技术有限公司，纯度80%) lmg (以黄芪多糖纯量计)，先用20 mL的SOF基础培养液溶解，然后向 培养液中加入800 mg牛血清白蛋白和1万国际单位的青霉素，1万微 克的链霉素，轻微搅拌均匀，再加入SOF基础培养液至100毫升，再 次搅拌混匀。用0.22 nM的微滤膜(Millipore Corporation, Bedford. Mass.USA)抽滤消毒后，在4。C下贮存，备用。
实施例2:含黄芪多糖的培养液用于山羊切割胚胎体外培养
山羊卵母细胞在含有100IU/mL的青霉素、100吗/mL的链霉素和体 积百分含量为20%血清(胎牛血清)的M199培养液(购自美国GIBCO 公司)中、在38 39。C、 5%<:02条件下进行成熟培养24小时，将获得 成熟的羊卵母细胞与精子一同放入含10mg/mL肝素的Tyrode，s改良液 中，在38-39。C、 5。/。C02的环境内培养16小时，进行受精，获得早期羊 胚胎。受精后的早期胚胎用人合成输卵管液反复沖洗，放入实施例1含 黄芪多糖的羊胚胎体外培养液中进行切割(先在培养皿上轻轻划一痕迹， 将胚胎移至划线中部，用显微手术刀或玻璃针在胚胎中部从上至下将胚胎 一分为二，再将半胚移入干净液滴中冲洗)后，分别在不含黄芪多糖的 SOF基础培养液(对照组)及实施例1制备的含黄芪多糖的羊胚胎体外 培养液中继续培养2天。培养2天后比较对照组和试验组切割胚胎的嚢 胚发育率，对照组中的胚胎嚢胚期发育率为53.3%,在实施例1制备的含黄芪多糖的羊胚胎体外培养液中的胚胎嚢胚期发育率为65.1%,比对 照组提高11.8%。将两组发育到嚢胚期的胚胎移植到受体内，2个月后 分别统计受体妊娠率，对照组中的切割胚胎受体妊娠率为51.7%，在实 施例1制备的含黄芪多糖的羊胚胎体外培养液中的切割胚胎受体妊娠 率为60.8%，比对照组提高9.1%。结果证实，含黄芪多糖的羊胚胎体 外培养液体外培养山羊切割胚胎可有效提高胚胎体外和体内发育率。
实施例3:含黄芪多糖的培养液用于绵羊胚胎体外培养
操作参照实施例2,绵羊卵母细胞在含有100IU/mL的青霉素、 100吗/mL的链霉素和体积百分含量为10%血清(胎牛血清)的M199培 养液中成熟培养，然后进行体外受精。受精后的早期胚胎进行切割后， 分别在不含黄芪多糖的SOF基础培养液(对照组)及实施例1制备的 含黄芪多糖的羊胚胎体外培养液中继续培养2天。培养2天后比较对照 组和试验组切割胚胎的嚢胚发育率，对照组中的胚胎嚢胚期发育率为 49.1%，在实施例1制备的含黄茂多糖的羊胚胎体外培养液中的胚胎嚢 胚期发育率为60.7%，比对照组4是高11.6%。将两组发育到嚢胚期的胚 胎移植到受体内，2个月后分别统计受体妊娠率，对照组中的切割胚胎 受体妊娠率为50.3%，在实施例1制备的含黄芪多糖的羊胚胎体外培养 液中的切割胚胎受体妊娠率为61.5%，比对照组才是高11.2%。结果证实， 含黄芪多糖的羊胚胎体外培养液体外培养绵羊切割胚胎可有效提高胚 胎体外和体内发育率。
权利要求
1.黄芪多糖在制备羊胚胎体外培养液中的应用。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的羊胚胎体外培养液以常 规胚胎培养液为基质，所述基质中还含有5~ lOOpg/mL的黄芪多糖、 100IU/mL的青霉素、100吗/mL的链霉素及5 ~ 10mg/mL的血清白蛋白； 所述常规胚胎培养液为人工合成输卵管液、Ml99或DMEM中的一种。
3. —种含黄芪多糖的羊胚胎体外培养液，其特征在于所述羊胚胎体外培 养液以常规胚胎培养液为基质，所述基质中还含有5 100pg/mL的黄 芙多糖、100IU/mL的青霉素、lOOpg/mL的链霉素及5 ~ 10mg/mL的血 清白蛋白，所述常规胚胎培养液为人工合成输卵管液、M199或DMEM 中的一种。
4. 如权利要求3所述的羊胚胎体外培养液，其特征在于所述羊胚胎体外 培养液每lOOOmL组成如下黄芪多糖 5~100mg 青霉素 100000IU 链霉素 100000 jig血清白蛋白 5~10g 常规胚胎培养液补足至1000mL。
5. 如权利要求3或4所述的羊胚胎体外培养液，其特征在于所述常^见胚 胎培养液为人工合成输卵管液。
6. 如权利要求3或4所述的羊胚胎体外培养液，其特征在于所述黄芪多 糖含量为10|ug/mL，所述血清白蛋白含量为8mg/mL。
7. —种应用如权利要求3所述含黄芪多糖的羊胚胎体外培养液进行羊胚 胎体外培养的方法，所述方法包括将受精后的早期羊胚胎用人合成 输卵管液反复冲洗后，放入所述含黄芪多糖的羊胚胎体外培养液中进 行切割，切割后的羊胚胎再用所述含黄芪多糖的羊胚胎体外培养液， 于38 39。C、 5。/oC02的环境内，进行胚胎体外培养。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于所述早期羊胚胎由羊卵母细胞 经体外成熟培养、体外受精获得。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于所述羊卵母细胞体外成熟培养 方法如下从屠宰场获取的卵巢中用注射器抽取的羊卵母细胞，用成 熟培养液在38~39°C、 5。/。C02的环境内培养20-24小时，获得成熟的 羊卵母细胞；所述成熟培养液以常规成熟培养液为基质，所述基质中 还含有100IU/mL的青霉素、100吗/mL的链霉素及体积百分含量8% ~ 20%的血清，所述常规成熟培养液为M199、 DMEM、 F12、 MEM培养 液中的 一种或两种以上的混合物。
10. 如权利要求8所述的方法，其特征在于所述羊卵母细胞体外受精方法 如下将成熟的羊卵母细胞与精子一同放入受精培养液中，在38~ 39°C、 5%(:02的环境内培养15 ~ 18小时，进行受精，获得早期羊胚胎； 所述受精培养液为含5 ~ 10mg/mL肝素的BO液或Tyrode，s改良液。
全文摘要
本发明提供了一种适用于羊胚胎切割后的体外培养的含黄芪多糖的羊胚胎体外培养液及其培养方法。所述羊胚胎体外培养液以常规胚胎培养液为基质，所述基质中还含有5～100μg/mL的黄芪多糖、100IU/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素及5～10mg/mL的血清白蛋白。本发明将黄芪多糖应用于羊胚胎体外培养，不仅可以促进切割后胚胎的修复，还可以有效地去除培养过程中产生的多余自由基，解决了目前羊切割胚胎发育率低的问题。其经济成本较低，便于在生产中推广应用。
文档编号C12N5/06GK101555466SQ20091009872
公开日2009年10月14日 申请日期2009年5月18日 优先权日2009年5月18日
发明者俞颂东, 王争光, 白惠琴, 白骊骅, 陈阿琴 申请人:浙江大学