专利名称：一对扩增钩端螺旋菌属16S rRNA基因的引物以及实时PCR定量检测钩端螺旋菌属的方法
技术领域：
本发明涉及一对扩增钩端螺旋菌属(L印tospirillum)16S rRNA基因的引物以及 实时PCR定量检测钩端螺旋菌属的方法
背景技术：
生物冶金技术是利用微生物、空气和水等天然物质从矿石中直接提取有价金属， 而无需选矿及火法炼制的短流程清洁生产工艺，通过微生物氧化矿石产生硫酸高铁和硫酸 等浸出剂，浸出过程基本不消耗除矿石、水、空气以外的其它资源，没有二氧化硫排放，资源 消耗低，对环境友好。生物冶金新技术使浮选-火法冶炼工艺不能利用的低品位及偏远地 区铜资源得以大规模开发，并使过去长年堆存的表外矿即使含铜0. 1 %以下亦有经济利用 价值。生物冶金技术被认为是二十一世纪矿产资源加工的战略性技术。 生物冶金过程是一个化学过程，微生物的作用主要是氧化铁和还原态硫，以及提 供溶解反应发生的空间(胞外聚合层)，但是细菌的作用是不能忽视的。浸矿环境中的细 菌可以分为两种一种就是可以氧化铁或(和)硫的细菌，如At. ferrooxidans，氧化Fe" 的速度是溶解氧氧化速度的5X 105 1 X 106倍，产生的Fe3+通过化学作用氧化硫化矿，氧 化硫产生的硫酸也可溶解一部分硫化矿；还有一种菌就是异养菌，它们通过代谢自养菌产 生的有机物获得能量，一方面可以消除有机物对自养菌的毒害作用，另一方面可以在低氧 压条件下异养生长，以Fe3+为电子受体，可以产生Fe2+供铁氧化菌利用，如Acidiphilium acidophilum。 生物浸矿过程是一个复杂的过程，其中涉及多种因素(生物、化学、物理)的相互 作用，微生物群落会随着浸矿环境中温度、pH、溶解氧浓度、C02浓度、Fe37Fe2+、硫酸盐浓度 和金属离子浓度等的变化而变化，而微生物群落的变化就会影响到浸矿的效率。现有的浸 矿微生物检测的方法多是基于PCR扩增后，再对所扩增的PCR产物进行检测，这种终点法的 检测往往不能真实的反应浸矿环境中的微生物组成。在PCR基础上发展起来的real-time PCR技术，实现了环境中微生物组成的起点检测，省去了电泳检测的时间，使得检测的时间 大大縮短，同时提高了检测的准确性，并能够检测低至几个拷贝的分子。
发明内容
本发明提供一对扩增钩端螺旋菌属(L印tospirillum)16S rRNA基因的引物以及 实时PCR定量检测钩端螺旋菌属的方法，该方法实现了环境中微生物组成的起点检测，省 去了电泳检测的时间，使得检测的时间大大縮短，同时提高了检测的准确性，并能够检测低 至几个拷贝的分子。 为实现上述目的，本发明采取以下技术方案本发明提供的用于检测钩端螺旋菌 属(L印tospirill咖)的引物对包括正向引物(F) (5' -GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和反 向引物(R) (5'-GTTGCTGCGTCAGGGTTT-3')(引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)。 这种利用权利要求1所述引物对的实时PCR的定量检测钩端螺旋菌属的方法，其 特征在于它包括以下步骤 (1)、选择阳性克隆，提取该克隆的16S rDNA，以该DNA为模板用上述引物进行PCR 扩增，切胶纯化，以纯化后的基因组DNA为模板用上述引物进行PCR扩增，测定产物的吸光 度值，并将吸光度值转化成DNA浓度，再将DNA产物的质量转化为拷贝数；纯化的PCR产物 定量后，进行梯度稀释，并以PCR产物为模板，数据构建标准曲线； (2)、在实时定量PCR仪中以上述引物扩增环境中钩端螺旋菌属的16S rDNA基因， 通过仪器检测扩增过程中相应的荧光信号，然后利用(1)中已建好的标准曲线将荧光信号 转换到起始反应的核酸分子拷贝数。 由于细菌在进化过程中基因存在一定的突变，因此在引物设计时在Genbank中选 取某种细菌及相似细菌的16S rDNA序列进行比对，挑取该种细菌不同于别的细菌的序列作 为设计引物的基础(用Promega 3)。 本发明提供的用于检测钩端螺旋菌属(L印tospirillum)的方法为以上面提 供的引物对在实时定量PCR仪中扩增环境中钩端螺旋菌属(L印tospiri 1 lum)的16S rDNA基因。通过仪器检测扩增过程中相应的荧光信号，然后利用已建好的标准曲线将荧 光信号转换到起始反应的核酸分子拷贝数，从而达到定量检测环境样品中钩端螺旋菌属 (X印tospirillum)的数量。
图1为钩端螺旋菌属(L印tospirillum)的标准曲线
图2为3种样品的荧光变化曲线图
具体实施方式
实施例1 挑取本实验室保存的与L印tospirillum sp.(该标准菌株L印tospirillumsp.可 从中国典型培氧物保藏中心购买(武汉))具有99X相似性的阳性克隆，提取该克隆的16S rDNA，以该DNA为模板用上述引物进行PCR扩增，采用A卯lied Biosystems的GeneAmp PCR System 2700型基因扩增仪。50 ii 1的反应体系组成为:5 Xbuffer 10 ii 1，25mM Mg2+ 3ii 1， 10mM dNTPliil，正向引物(F)O. 5iU，反向引物(R)O. 5iU，模板liil， GoTaq DNA聚合酶 0. 25iU，无菌去离子水33. 75iU，每个样品做3个重复。反应条件为95。C预变性2min，然 后为30个循环的95。C变性45s，54。C退火45s，72。C延伸lmin，最后72。C延伸10min。反应 结束后将所得PCR产物按照Promega的Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System操作说 明进行切胶纯化。纯化后的PCR产物采用Optizen 2120紫外分光光度计(Mecasys Co.， Ltd.)在260nm测定产物的吸光度值。然后根据公式(浓度=0D260 X 50 y g/ml X稀释倍 数)将吸光度值转化成DNA浓度。再根据下面的公式将DNA产物的质量转化为拷贝数
^_歸)趣口鹏数=赠糧 单个碱基的平均摩尔质量x模板长度
对于双链DNA，采用660g/摩尔/碱基。10—9g的400bp的PCR产物相当于2. 51X109 个拷贝。 纯化的PCR产物定量后，进行梯度稀释，使得PCR产物的拷贝数为1C)7-101。以此 PCR产物为模板，利用Corbett Research的Rotor-Gene 6000实时定量PCR仪进行扩增。 25iU的反应体系组成为12. 5iU的含有SYBRGreen I染色剂、AmpliTaq Gold DNA聚合 酶、dNTPs和缓冲溶液的SYBRGreen PCR Master Mix(Applied Biosystems，进口的一种试 剂)，正向引物(F)6. 25pmol，反向引物(R)6. 25pmol，模板1 yl，无菌去离子水6. 5 yl，每个 样品做3个重复。反应条件为95t:预变性5min，然后为45个循环的95。C变性15s，6(TC 延伸lmin。反应结束后，将温度由65t:缓慢升至95t:进行溶解曲线分析，检测反应的特异 性。 反应结束后，将温度缓慢升高，此时双链DNA解链成为单链，内参的荧光染料会被 释放出来，荧光信号逐渐减弱。基于产物长度和G/C含量的不同，扩增产物会在不同的温度 点解链。随着产物的解链就可以看到荧光值的降低并被仪器所测量。对溶解曲线进行微 分可以计算出溶解峰。溶解峰可以反映反应中扩增到的产物，因此用溶解曲线就可以对反 应的特异性进行监督了。如果溶解曲线只有一个峰，说明反应的特异性很好，如果出现多个 峰，说明有非特异性产物生成，结果就不可信。 反应结束后，利用软件(软件为Rotor-Gene 6000 series software versionl. 7(Build 3))将反应中的数据构建标准曲线(如图1) 。 R表示所构建标准曲线的 相关系数，R'2表示标准曲线相关系数的平方，M表示标准曲线的斜率，B表示标准曲线的截 距，Efficiency表示反应的扩增效率。通常好的标准曲线R > 0. 99， R'2 > 0. 97。
实施例2 分别提取3种环境样品(摇瓶浸出、柱浸和生物堆浸)中的微生物基因组DNA，用 Promega的基因组DNA纯化试剂盒(Promega， USA)，按照操作说明将DNA粗提液纯化。以 纯化后的基因组DNA作为模板，利用Corbett Research的Rotor-Gene 6000实时定量PCR 仪，采用特异性扩增钩端螺旋菌属(L印tospirillum)、引物对进行扩增。25 的反应体系 组成为12. 5iU的含有SYBR Green I染色剂、AmpliTaq Gold DNA聚合酶、dNTPs和缓冲 溶液的SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)，正向引物(F)6. 25pmol，反向 引物(R)6.25pmol，模板lia，无菌去离子水6.5iU，每个样品做3个重复。反应条件为 95t:预变性5min，然后为45个循环的95。C变性15s，6(TC延伸lmin。反应结束后，将温度 由65t:缓慢升至95t:进行溶解曲线分析，检测反应的特异性。然后导入已建立的标准曲 线利用荧光定量PCR仪自带的软件计算Ct值，之后将Ct值转化为核酸分子的拷贝数。然 后根据转化系数(L印tospirillum sp.为10)将拷贝数转化为细胞数。(由于细菌通常存 在多个拷贝的16S rRNA基因，因此需要一个转化系数将拷贝数转化为细菌数，这个转化系 数在Zammit， C. M. ， Mutch， L. A. ， Watling， H. R. and Watkin， E. L. J. ， 2008. Evaluation of quantitative real—time polymerase chain reaction fore皿meration of biomining microorganisms in culture Hydrometallurgy 94(1-4) :185-189. 中可以查阅。)
经计算钩端螺旋菌属(L印tospirillum)在3种样品中的数量分别为1. IX 105/ mL、l. 1X107mL、2. 8X104/g。 申请人:采用本方法检测过多种其他菌种(包括大肠杆菌、假单胞菌，以及四种待检测细菌互相进行引物验证)，结果发现反应特异性很好，非待测菌株曲线不起飞，没有信号。 本发明的检测限为10个拷贝，检测在10-10'7(10-107)个拷贝间。
序列表 〈110〉北京有色金属研究总院 〈120〉一对扩增钩端螺旋菌属16S rRNA基因的引物以及实时PCR定量检测钩端螺
旋菌属的方法
〈130〉〈160>2<170>PatentIn version〈210〉1〈211>19〈212>DNA〈213〉人工合成〈400>1gagtttgatc ctggctcag〈210〉2〈211>18〈212>DNA<213>人工合成<400>2gttgctgcgt cagggttt
权利要求
一对扩增钩端螺旋菌属16S rRNA基因的引物，其特征在于所述的引物对包括正向引物和反向引物，所述的正向引物的序列是5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，反向引物的序列是5’-GTTGCTGCGTCAGGGTTT-3’。
2. —种利用权利要求1所述引物对的实时PCR的定量检测钩端螺旋菌属的方法，其特征在于它包括以下步骤(1) 、选择阳性克隆，提取该克隆的16S rDNA，以该DNA为模板用上述引物进行PCR扩增，切胶纯化，以纯化后的基因组DNA为模板用上述引物进行PCR扩增，测定产物的吸光度值，并将吸光度值转化成DNA浓度，再将DNA产物的质量转化为拷贝数；纯化的PCR产物定量后，进行梯度稀释，并以PCR产物为模板，数据构建标准曲线；(2) 、在实时定量PCR仪中以上述引物扩增环境中钩端螺旋菌属的16S rDNA基因，通过仪器检测扩增过程中相应的荧光信号，然后利用(1)中已建好的标准曲线将荧光信号转换到起始反应的核酸分子拷贝数。
3. 根据权利要求1所述实时PCR的定量检测钩端螺旋菌属的方法，其特征在于所用的反应体系组成为12. 5 ill的含有SYBR Green I染色剂、AmpliTaq Gold DNA聚合酶、dNTPs和缓冲溶液的SYBR Green PCRMaster Mix，正向引物6. 25pmol，反向引物6. 25pmol，模板1 Pi ，无菌去离子水6. 5 。
4. 根据权利要求1所述实时PCR的定量检测钩端螺旋菌属的方法，其特征在于所用的反应条件为95。C预变性5min，然后为45个循环的95。C变性15s，60。C延伸lmin。
5. 根据权利要求1所述实时PCR的定量检测钩端螺旋菌属的方法，其特征在于所述的环境为生物浸出液或酸性矿坑水。
全文摘要
一对扩增钩端螺旋菌属16S rRNA基因的引物以及实时PCR定量检测钩端螺旋菌属(Leptospirillum)的方法，所述的引物对包括正向引物和反向引物，所述的正向引物的序列是5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，反向引物的序列是5’-GTTGCTGCGTCAGGGTTT-3’。与传统方法相比，本方法具有时间短、通量大、工作量小、可靠性高的优点，从样品的处理到定量检测环境中钩端螺旋菌属(Leptospirillum)的时间缩短至4小时，而且由于是一种起始检测法，检测结果更加准确。
文档编号C12N15/11GK101705285SQ20091020458
公开日2010年5月12日 申请日期2009年12月1日 优先权日2009年12月1日
发明者刘兴宇, 温建康, 陈勃伟 申请人:北京有色金属研究总院