专利名称：一种拮抗害虫的新颖苏云金杆菌菌株的制作方法
技术领域：
本发明是关于一种新颖的苏云金杆菌菌株，特别是关于一种具有crylAb、CrylAC、 crylD、crylE基因片段的苏云金杆菌菌株，该菌株可用于拮抗鳞翅目的害虫。
背景技术：
随着人们对于生活质量的重视以及环保意识的兴起，目前以生物性杀虫剂取代传 统农药来避免食物链的最终累积的趋势已成为主流，而且传统农药的使用已破坏生态系统 平衡，并产生抗药性的问题，以致某些害虫发生猖獗，造成很大的防治困难及损失。其中，以 苏云金杆菌为生物性杀虫剂中最广为应用，且使用简便又安全。苏云金杆菌(苏力菌，Bacillus thuringiensis)是一种昆虫病源细菌，为革兰氏 阳性杆菌，在营养缺乏或环境不良的时候，苏云金杆菌会进入不分裂的半静止期，或是分化 形成孢子和杀虫结晶蛋白，其结晶蛋白具有专一性，对特定的昆虫具有毒性，且毒性大小依 昆虫的种类有所强弱，但对人类、鸟类、害虫的天敌、蜜蜂等均无害。因此，过去20年来科学 家已分离出许多苏云金杆菌内的杀虫基因，并研制成重组基因产品，或是将杀虫基因直接 注入植物体内而免去喷洒杀虫剂的动作等等。真正活化苏云金杆菌内孢子的是肠液的碱性 环境，而非蛋白酶，肠道的高PH值不仅对苏云金杆菌结晶的溶解、消化很重要，且对毒性表 现相当重要。苏云金杆菌的内毒素基因位于质体上，因此很容易进行转殖基因工程。早期的内 毒素重组基因大多限制于单一基因片段的转殖。最近则利用多重内毒素基因或是差异性很 大的基因，甚至是嵌合(chimeric)基因，以增强杀虫效果、扩大杀虫范围。 各类苏云金杆菌毒蛋白间的类源关系，因其内含质体核酸序列的变异所产生的杀 虫结晶蛋白不同，杀虫对象亦互异，主要分成六大类(Hofte and ffhiteley, 1989 ；Gill et al.,1992 ；Gleave et al.,1993 ；Lereclus et al.,1993 ；Shin et al.,1995 ；Kostichka et al.，1996)，其中Cryl类对鳞翅目有毒杀虫效果；Cry2类对鳞翅目及双翅目或只对双 翅目有效；Cry3类只对鞘翅目有效；Cry4只对双翅目有效；Cry5不产生结晶，部分可杀鳞 翅目和鞘翅目，部分则否；CytA则是无特定杀虫作用范围，但会产生细胞溶解和溶血的效 果(cytolytic and hemolytic efficiency)；其中以Cryl所编码(encode)的氨基酸最多， 而CytA最少。中国台湾专利号385229揭露了一种新颖的生物杀虫组合物，其包含一种由杀虫 细菌与病毒，如苏云金杆菌结晶蛋白质或孢子或相关混合物，和核多角体病毒，从中挑选而 得的活性杀虫成份；一种聚合物；及一种无机光线阻碍剂。此发明亦包含生物杀虫组合物 的方法和控制昆虫的方法；中国台湾专利号385229专利与本发明的差异在于本发明的新 颖苏云金杆菌菌株是利用基因片段产生的内毒素拮抗害虫，并非以结晶蛋白或孢子或相关 混合物控制害虫。美国专利号6500617揭露了一种非天然获得抗虫基因的方法，此方法以DNA重组 的方式建立重组基因库，并纯化重组抗虫基因的有效多肽，其中此对昆虫有毒性的多肽为苏云金杆菌的S-内毒素；美国专利号6500617专利与本发明的差异在于，本发明的新颖苏 云金杆菌菌株是以天然方式获得该抗虫基因片段，而非以DNA重组的方式获得。美国专利号6177615揭露了一种新颖合成的苏云金杆菌核酸片段，该核酸片段可 以转译出S -内毒素，具有拮抗鳞翅目昆虫的杀虫活性，此发明也揭露此序列可转译成结 晶蛋白；美国专利号6177615专利与本发明的差异在于，本发明的新颖苏云金杆菌菌株所 含的抗虫基因片段并非合成，而是本身即具有该基因片段，经由筛选获得该新颖菌株并使 用。美国专利号5994266揭示了一种杀虫组合物，其杀虫成分为δ -内毒素或可引发 杀虫活性的片段，且该S-内毒素或可引发杀虫活性的片段选自cry I A, cry I B, cry I C， cry I D, cry II A, cry II B, cry II C, cry III A, cry III B, cry III C, cry IV A, cry IV B, cry IV C，cry IV D，cry V及cry VI，美国专利号5994266专利与本发明的差异在于，本发明 的新颖苏云金杆菌菌株所含的抗虫基因片段并非经人工方式获得，而是本身即具有该基因 片段，经由筛选得到该新颖菌株并用于拮抗昆虫。由上述文献可知苏云金杆菌的内毒素基因产物具拮抗昆虫效果，故目前科学家大 多以遗传工程的方式筛选或合成具多种抗虫活性基因的片段。本发明的新颖苏云金杆菌菌 株，为一天然菌株，具crylAb、CrylAC、CrylD、CrylE，经筛选后获得该菌株，并非由人为进行 遗传工程合成，仅利用不同基因片段的引物对(primer)进行筛选及确认，得到具有多种抗 虫活性基因片段的新颖苏云金杆菌
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种苏云金杆菌菌株，应用于生物性控制虫害的技术 领域，利用一 PCR筛选方式鉴定出含crylAb、crylAc、crylD、crylE基因的菌株(strain)， 该苏云金杆菌菌株可有效拮抗害虫的侵袭。本发明的第二目的在于提供一种苏云金杆菌菌株，应用于生物性控制虫害的技术 领域，可制成一种用于控制害虫的组合物，该组合物为一可接受的载体及一杀虫有效剂量 的S -内毒素，对受害虫侵袭的区域或预防害虫寄生的区域施加一有效剂量的该组合物， 可有效防治害虫的生长，进而提升作物的产能。本发明的第三目的在于提供一种苏云金杆菌菌株，应用于生物性防治虫害的技术 领域，利用苏云金杆菌菌株和/或其内毒素控制害虫的方法，所防治的害虫包含夜蛾科、螟 蛾科或菜蛾科。本发明首先提供了一种拮抗害虫的苏云金杆菌菌株，该苏云金杆菌菌株具有 cryIAb> crylAc、crylD 禾口 crylE 基因片段。根据上述方案，所述苏云金杆菌菌株进一步含有cry2A基因片段。本发明还提供了一种用于控制害虫的组合物，该组合物包括可接受的载体及杀虫 有效剂量的S -内毒素，所述内毒素得自具有(3巧认13、(^7认(3、(^710和(^7比基因片段的 苏云金杆菌菌株。根据上述方案，其中所述苏云金杆菌菌株，进一步含有cry2A基因片段。本发明还提供了一种控制害虫的方法，该方法包括对受害虫侵袭的区域或预防害虫寄生的区域施加有效剂量的苏云金杆菌菌株和/或具其内毒素的组合物，其特征在于所述苏云金杆菌菌株为具有crylAb、crylAc, crylD和 crylE基因片段的苏云金杆菌菌株。根据上述方案，其中所述苏云金杆菌菌株进一步含有crt2A基因片段。
根据上述方案，其中所述苏云金杆菌菌株的内毒素为δ-内毒素。本发明还提供了一种利用苏云金杆菌菌株和/或其内毒素防治害虫的方法，该方 法包括对受害虫侵袭的区域或预防害虫寄生的区域施加有效剂量的所述苏云金杆菌菌 株和/或具其内毒素的组合物，其特征在于所述苏云金杆菌菌株为具有crylAb、crylAc, crylD, crylE基因片段的苏云金杆菌菌株。根据上述方案，其中所述苏云金杆菌菌株进一步含有crt2A基因片段。根据上述方案，其中所述苏云金杆菌菌株可用于控制害虫。根据上述方案，其中所述害虫选自夜蛾科、螟蛾科或菜蛾科所组成群组的其中之
ο根据上述方案，其中所述夜蛾科选自玉米穗虫或拟尺蠖的族群。根据上述方案，其中所述螟蛾科选自豆荚螟、大菜螟或粉斑螟蛾的族群。根据上述方案，其中所述菜蛾科选自小菜蛾的族群。根据上述方案，其中所述苏云金杆菌菌株的内毒素为δ -内毒素。本发明还提供了一种经分离的苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株F201 及其代谢物。所述的苏云金杆菌菌株F201已经于2009年7月10日保藏在德国微生物和细 胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ)(德国微生物和细胞培养物保藏中心地址Inhoffenstr. 7B D_38124Braunschweig)， 取得的保藏编号为DSM 22750。本发明所述的苏云金杆菌菌株F201亦称为苏云金杆菌 DSM22750。
图1为本发明的苏云金杆菌菌株(F201)以PCR扩增的cryl基因产物的电泳分析图；图2为本发明的苏云金杆菌菌株(F201)以PCR扩增的cry2基因产物的电泳分析 图。用于专利程序的微生物保存保藏日期2009年7月10日；保藏单位德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)；保藏编号DSM22750 ；分类命名苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)。为了易于说明，本发明藉由下述的较佳实施例并配合附图而得到充分了解，并使 得熟悉本领域的技术人员可以据以完成本发明，然本发明的实施型态并不限制于下列实施 例中。
具体实施例方式本发明提供一种新颖的苏云金杆菌菌株，该苏云金杆菌菌株能够抑制害虫的生长。以下为该苏云金杆菌菌株的来源、纯化与分离方式、鉴定方式以及拮抗标的害虫的效果 的详细说明。菌种采集根据Smith and Couche (1991)的方法，选择座落于非农业区的中国台湾台北市 区-行政院农业委员会林业试验所台北植物园，以采集不同科、不同种的植物，每棵植物选 取距离地面3m以上的分枝，以大型封口袋带携回，并保存于4°C备用。菌种分离与鉴定携回植物分枝，处理前先阴干，每一分枝取3叶片，以灭菌过的不锈钢圆柱模型 (直径4. 4cm)，在一叶片上截取固定叶面积(30cm2) —片，正反面总计叶面积120cm2/样品 (sample)为量，用灭菌棉花棒沾Triton X-100 (Amresco)稀释液(50p pm) 6ml刷洗叶面及叶 背，收集洗叶水，进行离心(15，OOOxg, 6分钟)，收集沉淀物以0. 5ml无菌水再次悬浮(Smith and Couche,1991)。依据 Akiba and Katoh (1986)，Travers et al. (1987)，Chak and Yang (1990)， Chilcott and Wigley (1993)等四种方法进行分离。经热处理过的洗叶悬浮液，涂于 NA (nutrient agar)平板培养基上，28°C培养五天，挑单一菌落，在位相差光学显微镜下，以 1，000倍油镜进行观察，并选取含结晶及孢子的菌株，分别编号保存于4°C (Kao et al., 1996)。菌种培养各菌株分别以无菌水悬浮稀释，在NA平板培养基以划线法，再纯化3次并确认， 挑单一菌落，分别移到 5ml LB 液体培养基(Luria-Bertani Medium :bacto-tryptone 1%, bacto-yeast extract 0. 5%, NaCl 1%, pH 7· 0)，于恒温振荡培养箱(28°C, 250rpm)隔夜 培养，再取0. 5ml继代培养5ml同条件3小时。菌种鉴定对继代培养后的菌株进行分析，挑选一菌株命名为F201(即本发明的苏云金杆菌 DSM 22750)，进行菌种型态分析与后续实验。DNA聚合酶链连锁反应(PCR)与载体选殖本发明参照Kalman et al. (1993)所发表的各个内毒素特异性的核苷酸引物(如 下所示)的组合来确认本发明的F201苏云金杆菌中的内毒素基因型态。(1) cryIAb基因片段的扩增以cryl专一性序列作为反向引物(SEQ ID NO. 1)以及以cryIAb专一性序列作为 正向引物(SEQ ID NO. 2)进行PCR扩增反应来确认是否有cryIAb基因片段的存在。(2) cryIAc基因片段的扩增以cryl专一性序列作为反向引物(SEQ ID NO. 3)以及以cryIAc专一性序列作为 正向引物(SEQ ID N0. 4)进行PCR扩增反应来确认是否有cryIAc基因片段的存在。(3)crylD基因片段的扩增以cryl专一性序列作为反向引物(SEQ ID N0. 3)以及以crylD专一性序列作为 正向引物(SEQ ID N0. 5)进行PCR扩增反应来确认是否有crylD基因片段的存在。(4) crylE基因片段的扩增以cryl专一性序列作为反向引物(SEQ ID N0. 3)以及以crylE专一性序列作为正向引物(SEQ ID NO. 6)进行PCR扩增反应来确认是否有crylE基因片段的存在。(5)cry2A基因片段的扩增以cry II A2专一性序列作为反向引物(SEQ ID NO. 7)以及以cry II Al专一性序 列作为正向引物(SEQ ID NO. 8)进行PCR扩增反应来确认是否有cry2A基因片段的存在。F201苏云金杆菌的内毒素基因组合请参阅图1，其为利用上述SEQ ID NO. 1 6引物对进行PCR的筛选结果。根据 Kalman et al. (1993)，已知crylAb基因片段长度为238bp、crylAc基因片段长度为487bp、 crylD基因片段长度为414bp、crylE基因片段长度为883bp。因此，根据图1所示的片段长 度可以得知本发明F201苏云金杆菌具有crylAb、crylAc、CrylD、CrylE的内毒素多重基因 片段。请参阅图2，其为利用上述SEQ ID NO. 7和SEQ ID N0. 8引物对进行PCR的筛选结 果。根据Kalman et al. (1995)，已知cry2A基因片段长度为569bp。因此，根据图2所示 的片段长度可以得知本发明F201苏云金杆菌进一步具有cry2A的内毒素基因片段。F201苏云金杆菌拮抗标的害虫的活件本发明更进一步提供一种具有杀虫作用的组合物，其中该组合物包含有效剂量的 F201苏云金杆菌菌株的培养物以及其可接受的载体。并且，该培养物中包含有内毒素。采 用有效生产杀虫内毒素的标准培养方法及发酵方式(YamamOtO，1990)培养本发明的F201 苏云金杆菌菌株或其变异株(Yamamoto,T. 1990. Identification of entomocidal toxins of Bacillus thuringiensis by high-performance liquid chromatography. Pp. 46-60. In "Analytical Chemistry of Bacillus thuringiensis". L. A. Hickle, and W. L. Fitch Eds. American Chemical Society, Washington, D. C.)。再取发酵后的培养沉淀物，依发酵 后的培养沉淀物中总蛋白在混拌后饲料中的质量含量(PPm)的不同，进行试验以确认其拮 抗标的害虫的效果。实施例部分，共有三科，分别为夜蛾科、螟蛾科及菜蛾科，此类昆虫是蔬菜、豆科作 物、纤维作物等的害虫，会造成作物开花受影响、无法结穗等伤害，使得农民收成受到极大 的损失。以下针对此三科昆虫，分别测试F201对其拮抗的效果；对照组则使用市售Valent Bioscience公司的见达利(Xentari)作为比较，分别测试昆虫幼虫的死亡率，以下表1为 F201试验昆虫的科别总表；表2为各科供试昆虫进行试验的数据总表。表1F201试验昆虫分科
权利要求
1.一种拮抗害虫的苏云金杆菌菌株，该苏云金杆菌菌株具有cirlAb、CtylAC、CiTlD和 crylE基因片段。
2.如权利要求1所述的苏云金杆菌菌株，该苏云金杆菌菌株中还含有cry2A基因。
3.一种用于控制害虫的组合物，该组合物包括可接受的载体及杀虫有效剂量的δ-内 毒素，所述内毒素得自具有crylAb、crylAc, crylD和crylE基因片段的苏云金杆菌菌株。
4.如权利要求3所述的用于控制害虫的组合物，其中所述苏云金杆菌菌株还含有 crt2A基因。
5.一种控制害虫的方法，该方法包括对受害虫侵袭的区域或预防害虫寄生的区域施加有效剂量的苏云金杆菌菌株和/或 具其内毒素的组合物，其特征在于所述苏云金杆菌菌株为具有crylAb、crylAc, crylD和 crylE基因片段的苏云金杆菌菌株。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述苏云金杆菌菌株还含有cry2A基因。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述苏云金杆菌菌株的内毒素为δ-内毒素。
8.一种利用苏云金杆菌菌株和/或其内毒素防治害虫的方法，该方法包括对受害虫侵袭的区域或预防害虫寄生的区域施加有效剂量的所述苏云金杆菌菌株和/ 或具其内毒素的组合物，其特征在于所述苏云金杆菌菌株为具有crylAb、crylAc, crylD和 crylE基因片段的苏云金杆菌菌株。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述苏云金杆菌菌株还含有cry2A基因。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述害虫选自夜蛾科、螟蛾科或菜蛾科。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述夜蛾科选自玉米穗虫或拟尺蠖的族群。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述螟蛾科选自豆荚螟、大菜螟或粉斑螟蛾的族群。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述菜蛾科选自小菜蛾的族群。
14.如权利要求8所述的方法，其中所述苏云金杆菌菌株的内毒素为δ-内毒素。
全文摘要
本发明提供了一种拮抗害虫的新颖苏云金杆菌菌株，应用于生物性控制虫害的技术领域，利用一PCR筛选方式鉴定出含cry1Ab、cry1Ac、cty1D、cty1E基因的该菌株，该菌株可制成一种用于控制害虫的组合物，该组合物包括可接受的载体及杀虫有效剂量的δ-内毒素，对受害虫侵袭的区域或预防害虫寄生的区域施加有效剂量的该组合物，可有效防治害虫的生长。
文档编号C12N1/20GK102051337SQ20091021014
公开日2011年5月11日 申请日期2009年10月27日 优先权日2009年10月27日
发明者曾经洲, 郭雪, 高穗生 申请人:行政院农业委员会农业药物毒物试验所