一种提高质粒dna在大肠杆菌工程菌中比含量的培养基的制作方法

专利名称：一种提高质粒dna在大肠杆菌工程菌中比含量的培养基的制作方法
技术领域：
本发明一种提高质粒DNA在大肠杆菌工程菌中比含量的培养基属于生物领域，特 别是涉及一种培养基。
背景技术：
随着近年来重组DNA技术和基因组测序的发展，基因治疗和DNA疫苗研究领域取 得重大进展。而携带有外源基因的质粒DNA为基因治疗和DNA疫苗研究开发中使用的主要 药物载体。目前，治疗性的质粒DNA临床用量已达到了 mg级，因此大量制备的质粒DNA需 要工业规模的大肠杆菌工程菌发酵技术来制备。在发酵工艺方面，早期的质粒发酵培养基 配来源于重组蛋白基因工程菌培养基。但由于与表达重组蛋白为目标的工程菌不同，以表 达质粒DNA为目标的大肠杆菌工程菌的发酵工艺不需要考虑其蛋白表达产物的影响因素， 而仅需为细菌的大量增殖和内含质粒的高效扩增提供最适的发酵条件，因此运用于蛋白发 酵的培养基不一定适用于质粒DNA的发酵工艺。此后不断有学者进行这方面的研究，如根 据化学计量模式(stoichiometric model)的方法重新对培养基配方进行设计和优化。在 发酵策略方面，为了提高细菌发酵密度，与重组蛋白工程菌发酵工艺相似，现有的质粒DNA 发酵工艺普遍采用补料-分批发酵(fed-batch)的方法进行，即在发酵过程中基础培养基 碳源、氮源等营养成分衰竭时，通过限制性流加补料的方式提高菌体生长密度和目标产物 的表达总量。 到目前为止，现有文献公开的质粒DNA工程菌发酵工艺目标主要以提高质粒总产 量或单位体积质粒产量为目标。而良好的质粒DNA发酵工艺除了能生产较高的质粒DNA总 量外，还应能提高单位菌量的质粒DNA含量，即质粒DNA的比含量。质粒DNA比含量的提高 不仅减轻下游的纯化负担，还可减少试剂的消耗，节约成本。如现有的大规模质粒纯化制备 是主要以发酵获得的工程菌在碱裂解法的基础上以色谱纯化技术纯化而得。由于一定的菌 量对应一定比例的碱裂解试剂，因此提高质粒DNA比含量则意味着相同消耗量的碱裂解试 剂可以得到更高含量质粒原液，而且由于相应降低了质粒提取液中的宿主DNA、RNA、蛋白以 及内毒素的比例，意味减轻了下游分子筛排阻层析和离子交换色谱纯化的负担。已知增加 质粒DNA比含量的方法主要通过"饥饿效应"，即通过非细菌菌体增殖的最适条件下，如碳
源或氮源缺乏、较低的生长温度、偏酸或偏碱的ra值和限制溶氧量等，菌体将减少RNA和蛋
白质的合成，而是趋向于将营养底物转化成质粒，从而提高菌体质粒拷贝数。
除了通过"饥饿效应"提高质粒DNA比含量外，现有发酵工艺的研究文献并没有通 过培养基组分的优化配置提高质粒DNA比含量的方法。我们在研究中发现，现有的运用于 质粒DNA工程菌高密度表达的培养基虽然可以达到较高的菌体密度和质粒总量的目标，但 质粒DNA比含量普遍较低(质粒DNA比含量小于1. 6mg/g湿菌)。利用现有的培养基配方， 即使在发酵工艺中用到"饥饿效应"的策略后质粒DNA比含量有了一定程度提高，但结果仍 不令人满意。为了有利于质粒DNA的纯化，有必要开发出一种适用于工程菌高密度发酵培 养且能显著提高质粒DNA比含量的培养基。

发明内容
本发明的目的在于提供一种可以明显提高大肠杆菌工程菌在增殖生长过程中质 粒DNA的合成效率，提高质粒DNA比含量，对发酵培养基不同营养组分配比之间进行优化的 一种提高质粒DNA在大肠杆菌工程菌中比含量的培养基。 本发明的目的是通过以下措施来达到的，本发明的培养基每升包含有下列配比组 分 酵母提取物(yeast extract) 5. OOg/L 甘油(glycerol) 7. 75ml/L 硫酸铵((NH4)2S04) 3.0g/L 磷酸氢二钠(Na2HP04) 6.0g/L 磷酸二氢钾(KH2P04) 3.0g/L 柠檬酸(citric acid) 1. 7g/L 硫酸镁(MgS04) 1.2g/L 其中，酵母提取物(yeast extract)由英国0X0ID公司提供，产品型号LP0021。
培养基用IMol/L NaOH等碱性溶液调pH值至7. 0。 在使用本发明的培养基进行质粒DNA发酵时，按上述配比组分配制的培养基，在 分批发酵(batch fermentation)模式下可单独用于质粒DNA工程菌的发酵培养。可运用 "饥饿效应"策略，如降低发酵温度、限制溶氧值来进一步提高质粒DNA比含量。
在使用本发明的培养基进行质粒DNA发酵时，按上述配比组分配制的培养基，在 补料-分批发酵(fed-batch fermentation)模式下，与补料培养基联用，可用于高密度质 粒DNA工程菌发酵培养。可运用"饥饿效应"策略，如降低发酵温度、限制溶氧值来进一步 提高质粒DNA比含量。 本发明的培养基能显著提高质粒DNA比含量水平，从而有利于下游质粒DNA纯化， 提高大肠杆菌工程菌在增殖生长过程中质粒DNA的合成效率，可减少试剂的消耗，节约成 本。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1 :不同培养基摇瓶发酵结果比较
(l)实验材料 真核表达质粒pcDNAS2S由解放军458医院肝病研究所构建；宿主菌DH5 a由拜迪 公司保存；质粒pcDNAS2S转化DH5 a ，获得工程菌DH5 a /pS2S，拜迪公司保存；酵母提取物 (Yeast Extract)由英国0X0ID公司提供，产品型号LP0021、胰蛋白胨(Tryptone)购自 0X0ID公司；质粒小量抽提试剂盒，购自QIAGEN公司；紫外可见分光光度计，日本日立公司 UV-300型。 甘油(glycerol)、氯化钠(NaCl)、葡萄糖(glucose)、拧檬酸(citric acid)、硫酸 铵((朋4)2504)、硫酸镁(MgS0》、磷酸盐(Na2HP04、KH2P04)、氨苄西林(ampicillin， AMP)等， 均为国产分析纯。
(2)实验过程 按表1配制培养基，分装至三角锥瓶中(20ml/瓶)，灭菌后添加AMP至100 y g/ml 。 于LB培养基中加入琼脂(15g/L)，铺平皿，接种工程菌，于37t:培养过夜。挑单个菌落，接 种于5ml LB(含AMP 100 y g/ml)中，37。C振荡培养至A6。。为0. 6时，分别取菌液200ul接 种到各培养基中按预设的培养参数进行培养。培养结束后分析收菌量(湿菌重)、质粒含量 (mg/L)，并计算质粒含量对菌量的比值。
表1培养基配方表
<table>table see original document page 5</column></row><table>注 配方I来源饶桂荣等。治疗性双质粒HBV DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺研究， 中国生物制品学杂志2007年2月第20巻第2期，第110-113页。 配 方II来 源Michael K. et al. Growth Medium Selection and Its Economiclmpact on Plasmid DNA Production.Journal Of Bioscience AndBioengineering， Vol 104 (6)， 490-497， 2007. 配 方III来 源Kevin 0. et al. Strategiesfor high titre plasmid DNAproduction in Escherichia coli DH5a，Process Biochemistry42，1039—1049，2007
(3)实验结果
实验结果见表2: 表2 DH5 a /pS2S工程菌在不同配方培养基的摇瓶发酵结果
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从表2可以看出，在不同的温度、摇瓶速度的情况下，利用本发明配方配制的培养
基培养表达的质粒DNA比含量都明显高于其他配方的结果。 实施例2 :按照本发明配方配制的培养基大规模发酵工艺研究实验 (1)发酵采用fed-batch模式，发酵罐50L(德国B. Braun公司产品)，发酵培养基
按具体实施例配方表1配制，配40L，发酵罐原位灭菌后备用。 补料培养基配方如下 Yeast Extract 100g/l， Glycerol 400ml/L。 共配IOL，灭菌备用。 (2)实验过程如下 ①摇瓶培养所用培养基为本发明的培养基，用冻存菌种接种于摇瓶培养基中， 37t:剧烈振荡16hr至对数生长期(A6。。为0. 8)。取400ml菌液接种到发酵罐的发酵培养基 中，开始进行fed-batch模式的发酵培养 ②batch阶段接种后首先为batch阶段。在batch阶段，温度控制在35t:;通过补 加10X浓氨水溶液控制pH值在7. 0 ;d02控制在30X左右，开始阶段搅拌速度设为200rpm， 通气量为40L/min。当d02水平低于阈值28%时，搅拌速度增加10rpm以促使d02控制在 30%，在batch阶段搅拌速度最高值设为400rpm。在batch阶段后期由于氧供应不足d02 将会下降，最低至2%左右。batch phase末期营养组分将消耗尽，此时工程菌代谢将趋于 停止，故d02值将在短期内跃升，当d02达到15%时。发酵开始进入fed阶段。
③在fed阶段，发酵温度升至37°C ;d02值依然控制在30%左右，当d02值低于 30%时搅拌速度以lOrpm的增幅增加，直至达到最高转速(800rpm);在fed阶段，当d02值 高于50%、 pH值高于7. 2时表明生长限制性的碳源缺失，此时按预设的补料速度进行补料 (补料值为4mL/min)，直到d02值低于50 %或pH值低于7. 2时停止补料；在fed阶段，通 气量保存不变，当搅拌速度达到最高转数时，d02因供氧矛盾而趋于下降，当d02趋于零值 时停止发酵。 ④在发酵过程中，每隔lh取样，检测菌密度、湿菌量和质粒含量，并计算质粒含量 对菌量的比值。其中，质粒抽提采用QIAGEN质粒小量抽提试剂盒按操作说明进行。菌密度 的测定采用紫外分光光度计测定600nm波长的A值。质粒含量采用紫外分光光度计测定 260nm波长的A值确定。质粒纯度的测定采用紫外分光光度计测定260nm、280nm波长的吸收比值确定(符合质量标准的比值应在1. 75-1. 85之间)，并进行琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像系统扫描，并分析超螺旋质粒的比例(符合质量标准的超螺旋比值应> 90% )。
实验结果见表3。由结果可知，利用本发明培养基的发酵工艺可制得大量的合符质量标准的质粒DNA。质粒DNA比含量可达到2. 4，已超过现有文献(饶桂荣等。治疗性双质粒HBV DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺研究，中国生物制品学杂志2007年2月第20巻第2期，第110-113页)报道的检测结果。 表3利用本发明的培养基进行DH5 a /pS2S工程菌进行补料_分批(fed-batch)发
酵的结果
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权利要求
一种提高质粒DNA在大肠杆菌工程菌中比含量的培养基，其特征是每升包含有下列配比组分酵母提取物不是5.00g/L，甘油7.75ml/L，硫酸铵3.0g/L，磷酸氢二钠6.0g/L，磷酸二氢钾3.0g/L，柠檬酸1.7g/L，硫酸镁1.2g/L，培养基用1Mol/L NaOH等碱性溶液调pH值至7.0。
2. 根据权利要求1所述的一种提高质粒DNA在大肠杆菌工程菌中比含量的培养基，其 特征是在分批发酵模式下单独用于质粒DNA工程菌的发酵培养。
3. 根据权利要求1所述的一种提高质粒DNA在大肠杆菌工程菌中比含量的培养基，其 特征是在补料_分批发酵模式下，与补料培养基联用，可用于质粒DNA工程菌发酵培养。酵母提取物不是甘油 硫酸铵磷酸氢二钠 磷酸二氢钾柠檬酸 硫酸镁
全文摘要
本发明一种提高质粒DNA在大肠杆菌工程菌中比含量的培养基属于生物领域，本发明的培养基每升包含有下列配比组分酵母提取物5.00g/L，甘油7.75ml/L，硫酸铵3.0g/L，磷酸氢二钠6.0g/L，磷酸二氢钾3.0g/L，柠檬酸1.7g/L，硫酸镁1.2g/L，培养基用1mol/L NaOH等碱性溶液调pH值至7.0。本发明的培养基能显著提高质粒DNA比含量水平，从而有利于下游质粒DNA纯化，提高大肠杆菌工程菌在增殖生长过程中质粒DNA的合成效率，可减少试剂的消耗，节约成本。
文档编号C12N1/20GK101768560SQ20091021372
公开日2010年7月7日 申请日期2009年12月2日 优先权日2009年12月2日
发明者丘力功, 王灿顶, 蔡小杰, 赵亮, 韦剑 申请人:广州拜迪生物医药有限公司