一种提取质粒dna的试剂和方法
【专利摘要】本发明公开了一种提取质粒DNA的试剂和方法，它包括菌体裂解试剂、蛋白质抽提试剂、质粒DNA沉淀试剂和质粒DNA溶解试剂。用本发明所述提取质粒的方法提取质粒操作时间短，提取质粒平均时间为8分钟；本发明所用提取质粒的试剂组成简单，均为常见实验试剂，来源广泛且价格低，各组分均可以采用国产分析纯就可以提取到高产量和纯度的质粒，大大降低了费用；获得的质粒DNA产量高，纯庋好，无杂蛋白和RNA的污染，提取到的质粒DNA可以直接用于酶切、连接、测序、原核转化和真核转染等实验，大大方便了生物实验操作，节省了实验时间，提高了实验效率。
【专利说明】一种提取质粒DNA的试剂和方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种提取质粒DNA的试剂和方法。
【背景技术】
[0002]质粒DNA是基因工程常用的载体，可以携带外源基因进入细菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达，质粒DNA的提取和纯化是分子生物学研究领域中应用最广泛和最基本的技术，质粒提取的效率和质量对于后续实验(酶切、PCR扩增和测序等)的成功与否有着直接的关系。目前在国内外，很多生物试剂公司都研制了与提取质粒技术相关的试剂盒，如普洛麦格(promega)、碧云天、生工等。该类试剂盒多以纯化柱为主,成本高,价格昂贵,试剂繁杂且耗时较长。若以改良的碱裂解、?)—氯仿抽提方法提取质粒，获得的质粒DNA产量低，质量不高，不能满足下游的酶切和测序的要求，同时多种试剂混合应用，无疑加大了实验的工作量，使得实验时间显著延长，影响生物学实验操作和实验结果。
【发明内容】
[0003]本发明解决了以上不足，提供了一种提取质粒DNA的试剂和方法，本发明所用提取质粒的试剂成本低，提取质粒DNA的方法操作简单，且本发明所述的试剂和方法提取出的质粒产量高、纯度高，本发明具有快速、高效、高质且成本低的优点。
[0004]为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案:
[0005]一种提取质粒DNA的试剂，其特征在于它包括菌体裂解试剂、蛋白抽提试剂、质粒DNA沉淀试剂和质粒DNA溶解试剂；所述菌体裂解试剂的组分为:10mM Tris-HClUmMEDTA, 150mM氯化钠和5mg/ml溶菌酶，以超纯水为溶剂，所述Tris-HCl的PH值为7.5-7.8 ；所述蛋白质抽提试剂的组分为酚和氯仿的体积比为1:1的混合物；所述质粒DNA沉淀试剂的组分是PH为7.5的5.5M醋酸钠溶液和无水乙醇，其中醋酸钠溶液和无水乙醇体积比为1: 4 ;所述质粒DNA溶解试剂的组分为含有0.15mg/ml RNase的超纯水。
[0006]本发明还提供了一种提取质粒DNA的方法，它包括以下步骤:
[0007](1)摇菌扩增质粒；将携带质粒的大肠杆菌接种于LB固体培养基中，挑选单克隆菌落接种于LB液体培养基扩增培养，置于在30-37.5 °C恒温摇床上培养，摇床转速为200-250转/分钟；
[0008](2)取培养12-15小时OD6tltl达到0.5~0.6之间的生长状态良好的细菌菌液1.5ml于1.5ml离心管，室温下以12000g离心30秒，弃上清；
[0009](3)沉淀中加入100 μ I所述菌体裂解试剂，充分振荡混匀；
[0010](4)加入100 μ I所述蛋白抽提试剂，置于涡旋振荡仪上混匀5秒钟；
[0011](5)室温下以12000g离心5分钟以释放质粒DNA ；
[0012](6)收集上清，切勿触动蛋白质界面；
[0013](7)加入20 μ I质粒DNA沉淀试剂和200 μ I的无水乙醇，颠倒混匀；
[0014](8)室温下以12000g离心I分钟以沉淀质粒DNA ；[0015](9)弃上清，并干燥质粒DNA ；
[0016](10)用50 μ1质粒DNA溶解试剂溶解质粒DNA，-20°C保存备用。
[0017]与现有产品相比，本发明的优点是:本发明的所用试剂采用溶菌酶溶解细菌，通过酚-氯仿一步法去除蛋白质和RNA。用本发明所述提取质粒的方法提取质粒的操作时间短，提取一种质粒的时间只需8分钟；本发明所用提取质粒的试剂组成简单，均为常见实验试剂，来源广泛且价格低，各组分均可以采用国产分析纯就可以提取到高产量和纯度的质粒，大大降低了费用；获得的质粒DNA产量高，纯度好，无蛋白和RNA的污染，满足分子生物学相关实验要求，提取到的质粒DNA可以直接用于下游的酶切、连接、测序、原核转化和真核转染等实验，大大方便了生物实验操作，节省了实验时间，提高了实验效率。
【专利附图】
【附图说明】:
[0018]图1，不同方法产品所提取的质粒DNA图谱
[0019](M为标准分子量，1、2为promega纯化试剂盒，3、4为使用碧云天柱式纯化盒所提取的相应质粒DNA，5、6为使用本发明方法所提取的质粒DNA)
【具体实施方式】
[0020]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
[0021]实施例1
[0022]本发明所述的提取质粒DNA的试剂包括四种试剂，分别为菌体裂解试剂Rl ;蛋白抽提试剂R2 ;质粒DNA沉淀试剂R3 ;质粒DNA溶解试剂R4。
[0023]所述菌体裂解试剂Rl:
[0024]组分:IOmMTris-HCl(pH 7.8)；
[0025]1mM EDTA ；
[0026]150mM 氯化钠；
[0027]5mg/ml 溶菌酶。
[0028]按如下方法配制100mL的试剂Rl:
[0029]
【权利要求】
1.一种提取质粒DNA的试剂，其特征在于它包括菌体裂解试剂、蛋白质抽提试剂、质粒DNA沉淀试剂和质粒DNA溶解试剂；所述菌体裂解试剂的组分为:10mM Tris-HClUmMEDTA, 150mM氯化钠和5mg/ml溶菌酶，以超纯水为溶剂，所述Tris-HCl的PH值为7.5-7.8 ；所述蛋白质抽提试剂的组分为酚和氯仿的体积比为1:1的混合物；所述质粒DNA沉淀试剂的组分是PH为7.5的5.5M醋酸钠溶液和无水乙醇，其中醋酸钠溶液和无水乙醇体积比为1: 4 ;所述质粒DNA溶解试剂的组分为含有0.15mg/ml RNase的超纯水。
2.一种根据权利要求1所述的试剂提取质粒DNA的方法，其特征在于它包括以下步骤: (1)摇菌扩增质粒；将携带质粒的大肠杆菌接种于LB固体培养基中，挑选单克隆菌落接种于LB液体培养基扩增培养，置于在30-37.5°C恒温摇床上培养，摇床转速为200-250转/分钟； (2)取培养12-15小时OD6tltl达到0.5~0.6之间的生长状态良好的细菌菌液1.5ml于，1.5ml离心管，室温下以12000g离心30秒，弃上清； (3)沉淀中加入100μ I所述菌体裂解试剂，充分振荡混匀； (4)加入100μ I所述蛋白抽提试剂，置于涡旋振荡仪上混匀5秒钟； (5)室温下以12000g离心5分钟以释放质粒DNA； (6)收集上清，切勿触动蛋白质界面； (7)加入20μ I质粒 DNA沉淀试剂和200 μ I的无水乙醇，颠倒混匀； (8)室温下以12000g离心I分钟以沉淀质粒DNA； (9)弃上清，并干燥质粒DNA； (10)用50μ I质粒DNA 溶解试剂溶解质粒DNA，_20°C保存备用。
【文档编号】C12R1/19GK103882007SQ201210563585
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月24日 优先权日:2012年12月24日
【发明者】杨艳菊, 何胜祥 申请人:苏州中同生物科技有限公司