一种慢病毒重组穿梭载体的构建的制作方法

一种慢病毒重组穿梭载体的构建的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种慢病毒重组穿梭载体的构建方法。根据Gene?Bank中mRNA序列，寻找特征靶序列。pLKO.1scramble?shRNA载体线性化及回收：将pLKO.1scramble?shRNA用AgeI和EcoR?I双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收，测定线性化载体浓度。载体与siRNA模板链连接、连接产物的转化、阳性重组克隆的筛选并送测序。成功构建了靶向慢性病毒的shRNA干扰载体，并筛选出最佳抑制效率的干扰载体，为进一步研究JAK/STAT-OPN信号通路参与调控血管再狭窄过程中细胞增殖迁移的分子机制以及为血管再狭窄的分子靶向治疗奠定了基础。
【专利说明】一种慢病毒重组穿梭载体的构建
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，尤其一种慢病毒重组穿梭载体的构建。
【背景技术】
[0002]信号转导是细胞生命活动的一种最基本和最重要的方式，细胞因子受体介导的JAK-STAT-OPN(janus kinase/signal transducer and activator of transcription)信号传导途径是目前心血管分子生物学研究领域的热点，它把细胞膜上感受的信号直接传递到核内一启动基因转录，环节少而简洁；近来研究表明，JAK-STAT途径是人体内生理和病理反应的共同通路之一，与多种疾病发病及防治密切相关，广泛参与细胞应激、生长、增殖、分化和凋亡等多种生物学效应，是多种细胞因子和生长因子信号转导的重要途径。国内目前有文献对正常及低氧等损害情况下血管平滑肌细胞(VSMC)及微血管内皮细胞中全部JAK和OPN的基因和蛋白表达和变化情况进行了初步的研究。显然深入研究JAK-OPN及其它信号转导系统对探讨疾病发病机制和防治具有重要意义。
[0003]近年来，RNA干扰(RNA interference, RNAi)这一新兴的生物工程技术在疾病的发生、发展及治疗研究领域发挥越来越重要的作用，为人们针对某种基因突变或过表达所引起的疾病治疗提供了新的策略。本研究通过构建慢性病毒重组穿梭载体，并筛选出最佳抑制效率的干扰载体，为进一步研究JAK-STAT-0PN信号通路参与调控血管再狭窄过程中细胞增殖迁移的分子机制及为血管再狭窄的分子靶向治疗奠定了基础。

【发明内容】

[0004]本发明提供一种慢病毒重组穿梭载体的构建方法。
[0005]慢病毒重组穿梭载体的构建，其步骤为: [0006]I)根据Gene Bank中mRNA序列，参考shRNA设计原贝丨」，选择cDNA序列上的四个部位作为目标序列，同时将选中的shRNA中的碱基序列随机打乱设计为阴性对照，对照序列经BLAST检测证实与mRNA及其他基因编码序列无同源性；
[0007]2)设计shRNA模板、正义链模板、反义链模板三条序列，并将设计好的序列送上海生工生物技术有限公司合成；
[0008]3) pLK0.1scramble shRNA 载体线性化及回收:将 pLK0.1scramble shRNA 用 AgeI和EcoR I双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收，测定线性化载体浓度；
[0009]4)载体与SiRNA模板链连接、连接产物的转化、阳性重组克隆的筛选并送测序；
[0010]5)进行干扰效率检测，发现PLK0.1-0PN2干扰效率效果最好，将干扰效率最高的穿梭质粒PLK0.1-0PN2与psPAX2和pMD2.G质粒一起共转293T细胞，转染后48小时后出毒效率最闻。
[0011]本发明的优点:
[0012]I)根据 GeneBank 目的基因 mRNA 的已知序列，在 http: //www.ambion.com/techlib/misc/siRNA finder, html, 戈胃&牛寺IiE白勺革巴歹[J。[0013]2)针对目的基因我们设计三对shRNA序列，构建了三个重组慢病毒表达载体，并将这些重组载体包装病毒后感染大鼠血管平滑肌细胞，采用Western blot法验证重组慢病毒对靶基因的抑制效率。实验结果显示PLK0.1-0PN2干扰效率效果最好。
[0014]3)我们选择干扰效率高的PLK0.1-0PN2进行后续研究，为进一步研究JAK-STAT3信号通路在血管平滑肌细胞增殖、凋亡等作用奠定了基础，为抑制血管平滑肌细胞增殖的基因治疗提供了新的思路。
【具体实施方式】
[0015]下面结合具体具体实施实例，对本发明进一步说明，但发明的保护范围并不限于此。
[0016]雄性SD大鼠，体重150_250g，由南京医科大学实验动物中心提供。U6启动子质粒(如PavU6+27)由北京本元正阳基因技术公司构建，克隆用大肠杆菌DH5 α株(Gibco/BRL公司)，限制性内切酶Age1、EcoRI，T4DNA连接酶，RT-PCR试剂盒均为大连Ta Kara生物公司产品；RNA提取试剂Tripure、DEPC购自美国Roche公司；DMEM培养基、胰蛋白酶、Trizol试剂(Gibcobrl公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO) ,AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Roche公司)；Omniscript RT Kit (Qiagen公司)，反转录随机引物(Toyobo公司)，SYBR Premix Ex Taq(大连Takara公司)。试验中所用的核酸标准分子量Marker以及蛋白预染Marker均为美国Fermentas MBI公司产品。去内毒素质粒大量提取试剂盒为德国Qiagen公司产品。质粒转染试剂LipofectamineTM 2000购置美国invitrogen公司。兔抗鼠STAT3单克隆抗体以及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购自美国Santa Cruz公司。用于Western blot检测的增强化学发光试剂ECL为美国CellSignal 公司产品。PV DF 转印膜购自美国 Schleicher&Schuell Bioscience 公司。
[0017]1、干扰序列，设计及合成
[0018]根据 GeneBank 目的基因 mRNA 的已知序列，在 http: //www.ambion.com/techlib/misc/siRNA finder, html,寻找符合特征的祀序列。
【权利要求】
1.一种重组病毒质粒载体，其特征是该载体含有大鼠的OPN的基因干扰片段。
2.按照权利要求1所述的载体，其特征是该载体为大肠杆菌表达载体。
3.按照权利要求2所述的载体，其特征是该载体为PLK0.1-0PN-2。
4.按照权利要求3所述的载体，其特征是该载体的al序列为:

5.按照权利要求4所述的载体以及psPAX2和pMD2.G质粒一起共转293T细胞，转染后48小时后收集病毒。
6.按照权利要求5所述 的 病毒转染到大鼠体内后，降低OPN蛋白表达。
【文档编号】C12N15/113GK103882058SQ201210563553
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月24日 优先权日:2012年12月24日
【发明者】刘代新, 彭高松 申请人:苏州中同生物科技有限公司