专利名称：用于鉴定美澳型核果褐腐病菌的引物、方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及农作物病害诊断、病原鉴定等领域，更具体涉及一种美澳型核果褐腐 病菌鉴定的引物及其应用。
背景技术：
褐腐病(Brown Rot)是核果类李属植物桃、李、杏、樱桃等果树及仁果类苹果、梨 属植物的重要病害。褐腐病从核果仁果植物开花期便开始发生，造成花腐、枝腐；最严重的 是造成产中产后的果实腐烂。2001年，美国南部的乔治亚州褐腐病大面积发生，给桃产业 带来直接经济损失达430万美元，购买杀菌剂带来间接经济损失为150万美元(Phillips， 2002)。褐腐病主要是由子囊菌门(Ascomycete)，盘菌纲(Discomycete)，柔膜菌目 (Helotiales)，核盘菌科(Sclerotiniaceae)，链核盘菌属(Monilinia)(阿历索保罗等， 1996)的三种病原菌一Monilinia fructicola、M. fructigena、M. laxa 及 2002 年新命名 的Monilia polystroma引起的。褐腐病菌在世界各地分布不同(Byrde& ffilletts, 1977 ； Batra, 1991)。美澳型核果褐腐病菌，即M. fructicola主要分布在美洲、澳大利亚、新西兰、 日本(Batra，1991) ；M. fructigena主要分布在欧洲、日本及亚洲其它地区；M. laxa分布最 为广泛，几乎存在于所有核果和仁果的种植区，Molinia polystroma则主要发生在日本。根 据文献报道，我国1998年以前的褐腐菌有M. laxa和M. fructigena两种(戴芳澜，1979 ；庄 文颖，1998 ；王英祥等，1998)。2005年(Zhu, et al)首次报道在中国北京地区的桃和油桃 上发现了 M. fructicola。在检疫中，M. fructicola是欧盟的A2类检疫对象(0EPP/EPP0， 2005)，也是我国对外检疫对象。四种褐腐病菌的的形态特征非常相似，缺少经验时很难准确判断。近年发展起 来的分子生物学技术也在褐腐病菌的种类鉴定中得到了广泛应用(loos et al. ,2000； Hughes, et al. 2000 ；Ma et al. ,2003 ；Cote et al. ,2004 ；Gell et al. ,2007) 但是由 于褐腐病菌不同种间的序列差异很小，利用ITS序列差异、微卫星引物等扩增片段差异设 计种类特异性引物时没有充分考虑相近种的差异(如图2所示)；同时，用于测试的菌株有 限，缺乏来自世界多个地区的褐腐病菌株，所设计的种类特异性引物的特异性往往较差。因 此，针对来自世界多个国家和地区的褐腐病菌株，开发具有稳定特异性的鉴定美澳型核果 褐腐病菌的引物是非常必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于鉴定美澳型核果褐腐病菌的引物、试剂盒，以及一 种利用该引物和试剂盒快速鉴定美澳型核果褐腐病菌的方法。实现本发明的目的包括下列步骤1.根据美澳型核果褐腐病菌laCCaSe2(lCC2)基因序列的特异性，设计了对美澳 型核果褐腐病菌具有特异性的一对PCR引物，PCR引物的序列为
ClaF 5' -GGTAAGCGACATCGCATTCTCAC-3，ClaR 5，-GAGGTAAATGTGGTAAATATGCAG-3，。2.美澳型核果褐腐病菌鉴定的方法(1)提取待测菌的基因组DNA。(2)以待测菌的DNA作为模版，以所述引物作为扩增引物，进行PCR扩增。(3)将5iU PCR产物用重量体积比为1.4%的琼脂糖凝胶电泳分离后用EB染色， 若凝胶上显现386bp的DNA条带，则待测菌为美澳型核果褐腐病菌。上述方法第⑵步中PCR反应体系组成如下PCR反应体系25 iil，包括2. 5 ill 10 XPCR Buffer, 200 umol/L dNTPs，引物 ClaF 和 ClaR 各 0. 2 ii mol/L，1U Taq DNA 聚合 酶，10ng模板DNA，ddH20补足25 u 1 ；PCR反应条件为94_95°C预变性3分钟，94_95°C变性 30秒，60-64°C退火30秒，72°C延伸1-1. 5分钟，共30个循环；72°C延伸10分钟。3.鉴定美澳型核果褐腐病菌的试剂盒试剂盒包含10XPCR BufferU0mmol/L dNTPs、5U/iil Taq DNA 聚合酶、ddH20、引 物ClaF和ClaR，引物浓度为10 P mol/L，所述引物序列为ClaF 5，-GGTAAGCGACATCGCATTCTCAC-3，ClaR 5，-GAGGTAAATGTGGTAAATATGCAG-3，。本发明有益效果本发明提供的引物和方法能快速、准确鉴定美澳型核果褐腐病菌。本发明与现有 技术相比，具有以下的技术优势和积极效果①引物特异性强本发明的鉴定方法是利用核果及仁果上褐腐病菌的漆酶基因 lcc2具有种内保守、种间变异的特点，根据序列差异较大的区段设计引物进行鉴定。已经对 来自中国、美国、法国、新西兰、英国、意大利、日本等多个国家已知的4种仁果及核果褐腐 病菌艮口 Monilinia fructicola、M. fructigena、M. laxa、Monilia polystroma 及其近似禾中 进行了验证，结果显示该引物具有很强的特异性。②操作简便快速应用本发明，提取褐腐病菌的DNA作为模板进行PCR扩增，用常 规的琼脂糖凝胶电泳，整个过程可在6小时内完成。因此，本发明的引物和鉴定方法可用于 快速、准确鉴定美澳型核果褐腐病菌。
图1A、B为用本发明的引物、试剂盒及鉴定方法鉴定美澳型核果褐腐病菌及近似 种各菌株的PCR扩增产物凝胶电泳图谱。Monilinia fructicola为美澳型核果褐腐病菌， 分别来自美国、法国、新西兰、中国；Monilinia laxa为来自英国、意大利和中国的核果褐腐 病菌；Monilinia fructigena为来自法国、英国、意大利和中国的仁果褐腐病菌；其余为果 实褐腐病菌近似种及其它植物病原真菌。所有M. fructicola菌株都产生一条大小为386bp 的片段，而阴性对照及其它菌株均无扩增产物，说明是特异性扩增。图2为用文献报道(loos等，2000)的引物鉴定我国褐腐病菌种类的PCR扩增 产物的凝胶电泳图谱。CK为空白对照，Monilinia fructicola为美澳型核果褐腐病菌， Monilinia laxa为核果褐腐病菌；Moniliniafructigena为仁果褐腐病菌；其中，Ft、 P3、P1为来自法国的标准菌株，其它菌株均来自中国。所有M. fructicola菌株及1株
4M. fructigena菌株都产生了 1条扩增条带，说明该引物不能准确鉴定美澳型核果褐腐病 菌。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述实施例一1.选用菌株美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola)、核果褐腐病菌(M. laxa)、仁 果褐腐病菌(M. fructigena)、串珠霉(Monilia polystroma, Monilia mumecola)、灰 葡萄孢(Botrytis cinerea)、菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、苹果炭疽病菌 (Colletotrichum gloeosporioides)、链格孢菌(Alternaria spp.)、苹果腐烂病菌(Valsa mali)、苹果疫霉(Phytophthora cactorum)、番爺叶霉(Cladosporium fulvum)。上述菌株保存于中国农业大学植物病理学系，也可通过常规的植物病原分离纯化 得到。2. DNA 提取从培养基表面刮菌丝，约50-100mg，放到2ml冻存管中，加入500 u 1抽提缓冲 液，置于DNA提取仪FastPr印-24中，设置速度为5，时间为40秒；取出混合液，加入50 yl 10% SDS，37°C水浴lh ；加入75 u 15M NaCl，将混合液轻轻混勻；加入65 u 1 CTAB/NaCl溶 液，充分混勻后于65°C水浴10-20min ；加入等体积的苯酚氯仿异戊醇(25 24 1)， 充分混勻后，10, OOOrpm离心12min ；将上清转移至另一印pendorf管中，加0. 6倍体积的 冷异丙醇，颠倒混勻，然后10，OOOrpm离心12min，去上清；加入500 u 1 70%乙醇，颠倒数 次；10，OOOrpm离心12min，去上清；用冷冻浓缩仪将沉淀抽干，沉淀溶于100 yl TE中(含 100 u g/mlRNase)，_20°C保存备用。3.引物合成根据美澳型核果褐腐病菌laCCaSe2(lCC2)基因序列的特异性，设计了对美澳型 核果褐腐病菌具有特异性的一对PCR引物，PCR引物的序列为ClaF 5' -GGTAAGCGACATCGCATTCTCAC-3，ClaR 5' -GAGGTAAATGTGGTAAATATGCAG-3，上述序列由赛百盛合成，也可经常规的引物合成方法合成。4.菌株鉴定以上述所有菌株的DNA为模板，用ClaF/ClaR引物进行PCR反应，每次反应均包括 一个阴性对照(用ddH20代替DNA模板)。PCR反应体系组成总体积25iU，包括2. 5iU 10 X PCR Buffer (北京盛旭百川公 司生产)，200iimol/L dNTPs，引物 ClaF 和 ClaR 各 0. 2iimol/L，lU Taq DNA 聚合酶，10ng 模板 DNA，ddH20 补足 25 yl。PCR反应条件为95°C预变性3分钟，95°C变性30秒，64°C退火30秒，72°C延伸1 分钟，共30个循环；72°C延伸10分钟。将5iU PCR产物用重量体积比为1.4%的琼脂糖凝胶电泳分离后用溴化乙锭 (EB)染色后拍照。
5
从电泳图片上看(如图1所示)，美澳型核果褐腐病菌的PCR产物经琼脂糖凝胶电 泳显色后，凝胶上显现大小为386bp的DNA条带，其它菌的PCR扩增产物经电泳显色后凝胶 上不显现DNA条带，即说明本发明的引物可以特异性的扩增美澳型核果褐腐病菌的DNA。实施例二仅PCR反应条件不同，其余鉴定过程同实施例1。具体的PCR反应条件为94°C预 变性3分钟，94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸1. 5分钟，共30个循环；72°C延伸10 分钟。SEQUENCE LISTING<110>中国农业大学<120>用于鉴定美澳型核果褐腐病菌的引物、方法及试剂盒<160>2<170>PatentIn version 3. 5<210>1<211>23<212>DNA<213>Monilinia fructicola<400>1ggtaagcgac atcgcattct cac23<210>2<211>24<212>DNA<213>Monilinia fructicola<400>2gaggtaaatg tggtaaatat gcag2权利要求
用于鉴定美澳型核果褐腐病菌的引物，其特征在于，所述引物序列为ClaF5’-GGTAAGCGACATCGCATTCTCAC-3’ClaR5’-GAGGTAAATGTGGTAAATATGCAG-3’。
2.一种鉴定美澳型核果褐腐病菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤(1)提取待测菌的基因组DNA;(2)以待测菌的DNA作为模版，以ClaF和ClaR引物作为扩增引物，进行PCR扩增；(3)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后用EB染色，若电泳结果出现大小为386bp的DNA条 带，则待测菌为美澳型核果褐腐病菌。
3.如权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于所述PCR反应体系组成如下PCR反 应体系 25ii 1，包括 2. 5ii 1 10XPCR Buffer, 200 umol/L dNTPs，引物 ClaF 禾口 ClaR 各 0. 2umol/L, 1U Taq DNA 聚合酶，lOng 模板 DNA，ddH20 补足 25 ii 1 ；PCR 反应条件为 94-95°C 预变性3分钟，94-95°C变性30秒，60_64°C退火30秒，72°C延伸1-1. 5分钟，共30-40个循 环；72°C延伸10分钟。
4.一种采用如权利要求1、2、3所述的引物鉴定美澳型核果褐腐病菌的试剂盒，其特征 在于，所述试剂盒包含 10 XPCR BufferU0mmol/L dNTPs,5U/u 1 Taq DNA 聚合酶、ddH20、 引物ClaF和ClaR，引物浓度为10 u mol/L。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述引物ClaF和ClaR序列为ClaF :5’ -GGTAAGCGACATCGCATTCTCAC-3，ClaR :5’ -GAGGTAAATGTGGTAAATATGCAG-3’。
全文摘要
本发明提供了一种用于鉴定美澳型核果褐腐病菌的引物、方法及试剂盒。本发明涉及农作物病害诊断、病原鉴定等领域。本发明所述引物序列为上游引物ClaF5’-GGTAAGCGACATCGCATTCTCAC-3’；下游引物ClaR5’-GAGGTAAATGTGGTAAATATGCAG-3’。经过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，可以特异性地从美澳型核果褐腐病菌的DNA中扩增出大小为386bp的片段。本发明引物序列特异性强，应用本发明的引物、方法及试剂盒能够准确、快速的鉴定美澳型核果褐腐病菌。
文档编号C12N15/11GK101831492SQ20091024228
公开日2010年9月15日 申请日期2009年12月11日 优先权日2009年12月11日
发明者国立耘, 朱小琼 申请人:中国农业大学