专利名称：一种植物耐低温胁迫相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物耐低温胁迫相关蛋白及其编码基因在改变植物耐冷胁迫能 力中的应用。
背景技术：
植物生长在自然环境中，会受到各种各样的不良因素的影响，主要包括生物胁迫 和非生物胁迫。前者主要是指各种病原微生物的入侵；后者则主要指盐，干旱，低温，高温 等渗透胁迫。春去冬来，四季更替，温度的变化不仅是影响植物生长发育的重要环境因子之 一，同时也是限制作物产量的主要非生物因素。很多农作物的大量减产是由于低温寒害造 成的，因此，研究植物响应低温胁迫的生理生化反应及其分子机制，能够为提高植物抵抗低 温寒害的能力创造条件。植物由于其生长的固定性，为了在一定范围的温度条件下能够正常的生长和发 育，当外界环境温度发生变化时，植物自身会对这一变化作出反应，包括Ca2+信号的传递， 一系列冷诱导基因的表达，还有各种新成代谢上的变化。近几年来，虽然有关植物如何响应 低温分子机制研究已经比较深入，但是我们仍然不清楚植物到底是如何感知低温信号并传 递低温信号到核内激活转录因子，进而调节基因转录或引起一系列生理生化反应。拟南芥是一种十字花科植物，由于其形态个体小，生长周期快，基因组小，重复序 列少，并且全部基因组测序已经完成，且容易被人工诱变产生大量不同基因位点遗传变异 突变植株，因此已成为一种典型的模式植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物 学的研究。
发明创造内容本发明的目的是提供植物耐低温胁迫相关蛋白及其编码基因在改变植物耐冷胁 迫能力中的应用。本发明通过一个冷敏感突变体，发现导致该突变体冷敏感的基因，我们发现它的 编码蛋白的新功能，就是能够调控冷胁迫引起的细胞死亡，即可以改变植物对冷胁迫的耐 受能力。本发明的植物耐低温胁迫相关蛋白，即调控植物低温细胞死亡相关蛋白AtLSDl， 来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中SEQ ID No 2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中SEQ ID No 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取 代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID N2 :2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID Na 2 衍生的蛋白质。其中，序列表中SEQ ID N2 :2是由183个氨基酸残基组成。本发明提供的植物耐低温胁迫相关基因，是调控温度诱导的细胞死亡相 关基因，是在冷信号途径上起作用的基因，名称为AtLSDl (Arabidopsis thaliana lesionsimulating disease resistance〗)，该基因在拟南芥基因组数据库中的编号为At4g20380)，来源于哥伦比亚生态型的拟南芥，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID Na 1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID Na 2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID Na 1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功 能蛋白质的DNA序列。序列表中序列1的DNA序列由2272个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第1 位到第1880位碱基，含有7个内含子，分别为自5’端第199位到第318位碱基；自5’端第 381位到第505位碱基；自5，端第635位到第723位碱基；自5，端第拟9位到第1317位 碱基；自5’端第1458位到第1557位碱基；自5’端第1630位到第1721位碱基；自5’端 第1794位到第1880位碱基。含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌及扩增AtLSDl中任 一片段的引物对均属于本发明的保护范围。其中，上游引物和下游引物之间的距离 在50到2000个碱基之间；该引物对其中的每一个引物的长度为15到25个碱基，如 引物 1:lsdl-R :5，-TCCGTTGATGAAAGCGGAAAGTCG-3，(SEQ ID Na 3)引物 2 :lsdl_F 5， -GGAATAGAGGAAGAATTTGGA-3， (SEQ ID Ns :4)。本发明还提供一种构建低温敏感型拟南芥的方法，是将拟南芥中的植物耐低温胁 迫相关蛋白灭活；所述植物耐低温胁迫相关蛋白为权利要求1所述的蛋白；所述灭活为点 突变、缺失或插入突变拟南芥中的植物耐低温胁迫相关蛋白的编码基因。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明的AtLSDl基因 敲除(或沉默)后，植物表现为低温敏感。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及 筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物。 被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。本发明的基因为培育耐低 温植物新品种提供了基因资源，具有潜在的应用价值。下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
图1为冷敏感突变体lsdl-3的表型分析和图位克隆图2为ATLSDl调控温度依赖的细胞死亡验证
具体实施例方式我们通过筛选拟南芥EMS突变体库，发现了一个冷敏感突变体，克隆得到了这个 在冷信号途径上起作用的基因。我们分析了该基因的生理生化功能，进一步了解了植物感 知及应答环境温度的分子机制。以下述实施例说明其获得方法及其功能。实施例1、AtLSDl的图位克隆(1)突变体chs4的获得和表型分析我们通过筛选拟南芥EMS突变体库，发现了 2个冷敏感突变体，原来命名为chs4_l 和chs4-3。这两个突变体是同一个等位基因。我们发现突变体在低温条件下出现细胞死 亡，叶片萎蔫的表型(图1A，图2A)。(2)突变体的图位克隆
为了克隆得到基因，我们将突变体与另一生态型Ler杂交后得到F2代，挑选低温 敏感植株构建图位克隆的群体。利用BSA，初步将该突变基因定位第四条染色体的中部，经 过SSLP和CAP或者dCAP标记进一步定位分析，把突变基因精细定位于F18F4与T7J7之 间(图1B)，利用测序分析发现，在chs4-l中，突变碱基位于at4g20380(以前报道过的基 因ATLSD1)最后一个外显子和内含子的交接处，由G-A，造成了剪切错误，致使在chs4-l中， mRNA多出将近90bp (图1C)。在chs4_3中，突变碱基发生在第七个外显子上，由C-T。这些 突变造成了 at4g20380蛋白的不稳定，在突变体里，ATLSDl蛋白含量表达很低(图1D)。为 了进一步证实是由于at4g20380的突变造成了 chs4_l的冷敏感表型，我们做了互补实验， 将野生型基因转入突变体植株，能够互补突变体的表型，因此进一步确定了该突变体确实 是由于ATLSDl发生突变所致。因此我们将chs4-l重新命名为lsdl-3(图1 E)。上述突变 体的鉴定，鉴定chs4-l突变位点所用引物为Isdl-R TCCGTTGATGAAAGCGGAAAGTCG(Taql)； Isdl-F :GGAATAGAGGAAGAATTTGGA。实施例2、ATLSDl调控温度依赖的细胞死亡在低温条件下突变体体内有大量细胞死亡，同时诱导表达了抗病基因PRl和冊2， 并且积累了高水平的SA。(1)用台盼蓝染色液染色，在体视镜下观察发现，低温处理之后，lsdl-3的叶片有 大量细胞死亡(图2A)；(2)Northern blot 用1Trizol提取正常条件下和低温条件下野生型和突变体的 RNA。以IX MOPS为电泳缓冲液，12%甲醛变性胶进行电泳分离。用10XSSC将RNA转移到尼 龙膜上，紫外交连后用于杂交。杂交过程选用Church Buffer, PCR扩增探针之后用同位素 α -32P-dCTP进行标记，杂交16 h之后，洗膜三次，分别用2 X SSC, 0. 1 % SDS, 15min ； 1 X SSC, 0. SDS，65°C下 15min，0. 5 X SSC, 0. SDS，65°C下 15min ；最后用 X 光片显影，结果显示 Chs4-1体内的rai，PR2大量诱导表达(图2B)。报告基因I3Rl:⑶S染色也证明在lsdl_3 体内确实PRl表达高于WT (图2C)。(3)甲醇提取WT和lsdl-3体内水杨酸，环己烷和乙酸乙酯萃取之后风干，乙腈溶 解之后用HPLC测定，结果显示在lsdl-3中，不论是游离SA还是SAG，都高于WT (图2D)。(4) lsdl-3在低温条件下也表现出细胞死亡。综上所述，我们得出结论=ATLSDl调 控温度依赖的细胞死亡。序列表<160>4<210>1<211>2272<212>DNA<213> 拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaiiana(L.)HEYNH.)<400>1cttacgcgtc atgtaaaaaa aaaagaagcg taaattacga aaaacagaga gataaatccg60ggcattgaga ttttggagat agagagagag aaaaatcgaa atctattgtc tatctcctca120atttggattg gattttctgc atatcatcgc tctagctttc gcgggttttg gattcgattc180cttacccttc tccaatcggt aagaacaagc tccaaagttt gttccttttt ttcaattttc240
gccaattctgtaatctcatcattgtccttg
gttttgatttggatgcagaagtttttggct
cagctctttttgttaatcaggtgagttttt
aatgactaagtattgtgaaatgtttagggt
tttgtgtgtgtttggatgaaagtagcagat
aggaatttattgatgtatcctagaggagca
atcaacatggttcctcctcctcctccacct
ttgaggatgaggttaatatgctctgcaatt
cagacatggcacacattatatgtggtggtt
ctagtagcgtaagatgctcttgctgtcaaa
tatcgtgacatccatatcaatccttttaaa
tttagtcctttagaatcttctttcacactt
tgcttacgtaacgtatttccacttttccca
atctgggatttgtaaagcagctgaaagtac
gactaggtaactacttgttagagctagtag
tagattcttatctttaattagcgtctaagc
atccatgactgcttaagaacattgctgatt
ctagcattaacattgcttgttttctgaatc
actccaatcaggttgcccatgctccttcca
gtcggacgaccctcatgtatccttacggtg
tcgtaactaacgttaatgtgattattccta
aagtatagagatctttctgttggaaatttt
agcaatggaagggtacctctcccaactaac
acatcaactgtgagttatcaaattatgaat
tggtacttactctgttcatcgatttttcat
cccaaaccgttgttgtagaaaaccccatgt
tttctatcacctgtgttcttcttcttattt
ctgaaacacacaaattgcaggtgagcaatg
aatcaagaatgagtgagatcttaaagatca
ggtttgtgcatattacatacgcggaaaaac
aacccaagagaaaaagcttatcagaatctc
gttgaagacacaaggtttttgctcgaataa
ccttctcttctgtttgttgacttctaaaac
tgtatgaatataatctgataC3.CC3.3.CC3.3.
<210>2
<211>183
<212>PRT
〈213〉拟南芥属拟南芥(Arabidopsi
<400>2
tttgtttgtttgattcaacacacaattctt300ttgaattggatttgggtttcgttccaaaat360aggtatttgaatctccaattgcttccttgc420ttcatctgtgtgggtcttgttttgaagcaa480atgcaggaccagctggtgtgtcatggttgt540tctaatgtgcgttgtgcgttatgtaacact600cacggtatcgatttctttgttgaatttgaa660gtattataacttgggttctgattctgaata720gtagaacaatgcttatgtatacgcgtgggg780ctacgaaccttgtgccaggt￡Ι ￡Ι ￡1￡Ι ￡1￡1840gaccatgtattatattgctttataaggtct900ttgtttgataacattgttctgtggagatga960aagatgtatatgaatctgaattctgaaaat1020tt 333HC3<3<3<gcttttagatggtcccggtg1080ggtttattattgttttgtttgatctaccat1140tgttgtcatttagctgtatgattatcattt1200acttcgttcattagtatttcttggattttt1260tgtgcgtgtcttttttgaaatcgacagcgc1320gtcaggttgcgcagatcaattgtgggcatt1380catcatccgtcaaatgcgctgtttgtcaat1440tctattaagccacctctgcatggttgagtt1500catttctgattcattttgcatccttagatg1560cggccaaatggaacagcttgtcccccctct1620ttgtaatagttctgtatattcttatggaac1680tttaccaacagtcaacaccaccctctcaga1740ccgttgatgaaagcggaaagttggtgagta1800accacattagaggaagatatgacaaagtga1860ttgttgttggagtgacaactgacaaaaagt19203-3- c caaat cttcctctattcctgcgttt1980tgtatgttatatatctcttgactccttttt2040ttgttactgcattattggggtttattcaaa2100tttggcattcttttgctccatggaacttga2160tccatcggcccttgtggcattgttaatgta2220tcattaagatttgggtttgaaa2272
thaliana(L. )HEYNH.)0083]Met Gln AspGlnLeuValHisGlyCysArg AsnLeuLeuMetTyr Pro0084]1510150085]Arg Gly AlaSerAsnValArgCysAlaLeuCysAsnThrlieAsnMet0086]2025300087]Val Pro ProProProProProHisAspMetAlaHislielieCysGly0088]3540450089]Gly Cys ArgThrMetLeuMetTyrThrArgGlyAlaSerSerValArg0090]5055600091]Cys Ser CysCysGlnThrThrAsnLeuValProAlaHisSerAsnGln0092]657075800093]Val Ala HisAlaProSerSerGlnValAlaGlnlieAsnCysGlyHis0094]8590950095]Cys Arg ThrThrLeuMetTyrProTyrGlyAlaSerSerValLysCys0096]1001051100097]Ala Val CysGlnPheValThrAsnValAsnMetSerAsnGlyArgVal0098]1151201250099]Pro Leu ProThrAsnArgProAsnGly ThrAlaCysProProSerThr0100]1301351400101]Ser Thr SerThrProProSerGlnThrGlnThrValValValGluAsn0102]1451501551600103]Pro Met SerValAspGluSerGlyLysLeuValSerAsnValValVal0104]1651701750105]Gly Val ThrThrAspLysLys0106]1800107]<210>30108]<211>240109]<212>DNA0110]<213>人工序列0111]<220>0112]<223>0113]<400>30114]TCCGTTGATGAAAGCGGAAAGTCG200115]<210>40116]<211>210117]<212>DNA0118]<213>人工序列0119]<220>0120]<223>0121]<400>4
GGAATAGAGGAAGAATTTGGA权利要求
1.植物耐低温胁迫相关蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQID No . 2的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQID N2 . 2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 /或缺失和/或添加且具有SEQ ID No 2的氨基酸残基序列相同活性的蛋白质。
2.权利要求1所述的植物耐低温胁迫相关蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的植物耐低温胁迫相关蛋白的编码基因，其核苷酸序列是下列 核苷酸序列之一1)序列表中SEQID Na 1的DNA序列；2)编码序列表中SEQID No 2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQID N2 :1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋 白质的DNA序列。
4.含有权利要求2或3所述基因的表达载体
5.含有权利要求2或3所述基因的宿主菌。
6.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系。
7.扩增权利要求2或3所述基因任一片段的引物对。
8.根据权利要求7所述的引物对，其特征在于所述引物对为序列表中SEQID No 3 和 SEQ ID Na :4。
9.权利要求2或3所述基因在改变植物耐低温胁迫能力中的应用。
10.一种构建低温敏感型拟南芥的方法，是将拟南芥中的植物耐低温胁迫相关蛋白灭 活；所述植物耐低温胁迫相关蛋白为权利要求1所述的蛋白；所述灭活为点突变、缺失或插 入突变拟南芥中的植物耐低温胁迫相关蛋白的编码基因。
全文摘要
本发明公开了一种植物耐低温胁迫相关蛋白及其编码基因与应用。该蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQ ID №.2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有SEQ ID №2的氨基酸残基序列相同活性的蛋白质。本发明的基因为培育耐低温植物新品种提供了基因资源，具有潜在的应用价值。
文档编号C12N15/63GK102101882SQ200910241990
公开日2011年6月22日 申请日期2009年12月18日 优先权日2009年12月18日
发明者杨淑华, 黄小贞 申请人:中国农业大学