羊草胁迫相关蛋白基因LcSAP及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了羊草胁迫相关蛋白基因LcSAP及其应用，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。实验结果表明，在正常情况下，对照酵母和转基因酵母长势基本一致。但是，在1.4mol/L?NaCl胁迫下，转LcSAP基因酵母的长势明显好于对照(图4B)。说明LcSAP基因明显提高了转基因酵母的耐盐能力。
【专利说明】羊草胁迫相关蛋白基因LcSAP及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及的是羊草胁迫相关蛋白基因LcSAP及其应用。
【背景技术】
[0002]羊草(Leymus chinensis (Trin.) Tzvel.)又名碱草,它是欧亚大陆草原区东部草甸草原及干旱草原上的重要建群种之一。我国东北部松嫩平原及内蒙古东部为其分布中心，在河北、山西、河南、陕西、宁夏、甘肃、青海、新疆等省(自治区)均有分布。羊草抗寒、抗旱、耐盐碱、耐土壤瘠薄，适应范围广。羊草在漫长的进化过程中积累了丰富的抗逆基因，形成了一套完善的抗逆机制。
[0003]锌指蛋白是转录因子的一种，与真核生物的生长发育及逆境胁迫的耐受能力都有着重要关系。胁迫相关蛋白(stress associated protein, SAP)是一类含有ANl和A20结构域的锌指蛋白。SAP包含的两个锌指结构ANl和A20都不是植物所特有的。ANl最初在一种动物的类泛素蛋白中发现，在植物中的研究并不多见。在动物中，含A20的锌指蛋白可控制NF-kB的激活和调节，核因子NF-kB是研究得最为广泛的转录因子之一，具有如下特征:对外界信号的刺激反应迅速，控制广泛的基因表达(Vij et al, 2006)。水稻中0SISAP1是第一个被克隆出来的AN1/A20型锌指蛋白基因，0SISAP1受到冷、盐、干旱、重金属、伤害、脱落酸诱导表达，转基因烟草证明该基因可以提高植物的对冷害、干旱和高盐的抗逆性(Mukhopadhyay et al, 2004)。全基因组分析表明，水稻、拟南芥、番爺中分别有18、14、13个SAP家族成员。水稻和番茄中所有SAP基因家族成员基因都受到一种或多种非生物胁迫诱导表达(Vij et al, 2006; Solanke et al, 2009)。过表达水稻0siSAP8基因提高了转基因烟草和水稻的抗寒、抗旱和耐盐能力(Kanneganti et al, 2008)。过表达水稻SAP基因家族的ZFP177基因提高了转基因烟草耐受低温和氧化胁迫的能力(Huang et al，2008)。过表达獐毛AlSAP基因提高了转基因烟草对 干旱、高盐、高温和冰冻的抗性(Ben Saad et al, 2010) 0目前还从苜蓿、甘蔗和毛竹中也克隆得到AN1/A20型锌指蛋白基因(Gimeno-Gilles etal, 2011;刘金仙等，2009 ;刘志伟等，2010)。上述研究表明SAP基因家族基因是一类与非生物胁迫密切相关的基因。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供羊草胁迫相关蛋白基因LcSAP及其应用。
[0005]本发明的技术方案如下:
[0006]羊草胁迫相关蛋白基因LcSAP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0007]所述的羊草胁迫相关蛋白基因LcSAP在培育耐盐胁迫转基因植物品种中的应用。
[0008]实验结果表明，在正常情况下，对照酵母和转基因酵母长势基本一致。但是，在1.4mol/L NaCl胁迫下，转LcSAP基因酵母的长势明显好于对照(图4B)。说明LcSAP基因明显提高了转基因酵母的耐盐能力。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1为LcSAP的核苷酸序列以及编码的氨基酸序列；
[0010]图2LcSAP和其它植物AN1/A20型锌指蛋白构建的进化树；A1SAP，獐毛(Aeluropus littoralis), ABK90631 ；MtSAP,苜猜(Medicago truncatula),ABN08135 ；0sSAPl,水稻(Oryza sativa Japonica), BAG97589;PeSAP,毛竹(Phyllostachys edulis), ACLOl 101; PpSAP,小立碗藓(Physcomitrella patens subsp.patens), XP_001771457;PsSAP,美国西加云杉(Picea sitchensis), ADE76549;PtSAP,毛果杨(Populus trichocarpa), XP_002297783;S1SAP5,番爺(Solanum Iycopersicum),ACM68442 ；SoSAP,甘鹿(Saccharum officinarum), ACT53874;VvSAP,葡萄(Vitisvinifera), XP_002283057; ZmSAP,玉米(Zeamays)，ΝΡ_001106260。
[0011]图3LcSAP基因的表达情况；A，LcSAP的组织表达情况:L，叶；R，根。B，LcSAP受胁迫诱导表达情况:Actin基因为内参。
[0012]图4转LcSAP基因酵母耐盐性鉴定；
【具体实施方式】
[0013]以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0014]一、羊草LcSAP基因的克隆及生物信息学分析
[0015]1.1材料处理
[0016]羊草种子在蛭石中萌发，室温光照16小时，温度25°C培养。用1/2MS浇灌至三叶期，每隔三天浇一次。用IOOmm0VLNa2CO3胁迫处理24小时后，取羊草叶片至于液氮中冷冻保存。
[0017]L2RNA 提取
[0018]应用TaKaRa公司的RNAiso?Plus试剂盒提取羊草叶片总RNA，根据试剂盒说明书步骤进行。用甲醛变性凝胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
[0019]1.35’ RACE
[0020]用于5’RACE 的 cDNA 合成采用 Clontech 公司的 SMART?RACEcDNA AmplificationKit试剂盒,具体步骤如下:在0.2ml离心管中加入Iyg RNA, I μ 15’ -Q)S primerA, I μ ISMART IIA oligo，然后加入RNase-free水补足5μ 1，混合离心；72°C水浴2分钟，再冰浴2分钟，瞬时离心；加入提前混合好的5 μ I混合物,包括2 μ 15 X First-Strand Buffer, I μ IDDT (20mmol/L), I μ I dNTP Mix (10mmol/L), I μ I M-MLV Reverse Transcriptase ;轻吸混合物使之均匀，瞬时离心；42°C水浴1.5小时；加入Tricine-EDTA BufferlOOy I ;72°C水浴7分钟，分装后_20°C冰箱中保存备用。
[0021]根据羊草LcSAP基因EST(CD808976)设计5’ RACE特异性引物GSP(5，-TTTGGCTGAGGCAGACGCT-3，)。以 cDNA 为模板，以 GSP 和 IOXUniversalPrimer A Mix(5，-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ )为引物，50 μ IPCR 反应体系:34.5μ IPCR-Grade Water,5 μ 110XAdvantage2PCR Buffer,I μ I dNTP Mix(lOmmol/L),I μ 150XAdvantage2Polymerase Mix,I μ I GSP (10 μ mol/L),5 μ IlOX Universal PrimerA Mix (2 μ mol/L)，2.5 μ I cDNA。PCR 反应条件:94°C 2 分钟；94°C 30 秒，55°C 40 秒，72°C I分钟，35个循环；72°C 10分钟。用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，回收目的片段，与PMD18-T载体连接，转化大肠杆菌ToplO感受态细胞，选取阳性克隆，由上海生工生物工程有限公司测序。
[0022]1.4RT-PCR克隆羊草LcSAP全长基因
[0023]用于RT-PCR 的 cDNA 合成米用 Promage 公司的 Reverse Transcription System反转录试剂盒，具体步骤:将lug RNA于70°C孵育10分钟，瞬时离心，置于冰上；4μ IMgCl2 (25mmol/L),2 μ I Reverse TranscriptionlOX Buffer,2 μ IdNTP Mixture(1Ommol/L) , 0.5 μ I Ribonuclease inhibitor,15U AMV Reverse Transcriptase, 0.5 μ gOligo (dT) 15Primer,加入去离子水至 20 μ I。
[0024]根据5 ’ RACE的测序结果与EST (⑶808976)序列拼接后得到的序列设计引物Fl (5，-CCACCCAAAAGGAAAGGAC-3’ )和 Rl (5，-GAAGTAAACCTGACGGACCAAG-3’)。以 cDNA为模板，以 Fl 和 Rl 为引物，50μ IPCR 反应体系:1μ I cDNA，I μ I Fl (10 μ mol/L)，I μ IRl (10 μ mol/L)，25 μ I Premix Taq?, 22 μ I 去离子水。PCR 反应条件:94°C 2 分钟；94°C 30秒，55°C 40秒，72°C I分钟，35个循环；72°C 10分钟。用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，回收目的片段，与PMD18-T载体连接，构建重组载体pMD18-T-LcSAP，转化大肠杆菌ToplO感受态细胞，选取阳性克隆，由上海生工生物工程有限公司测序。
[0025]1.5生物信息学分析
[0026]通过ORFfinder 程序(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析LcSAP基因开放阅读框。LcSAP基因全长889bp，包括211bp的5’非编码区和192bp的3’非编码区，开放阅读框为486bp，编码161个氨基酸残基(图1)。
[0027]利用NCBI 的 CDD (Conserved Domain Database)数据库(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析LcSAP的保守结构域，结果表明在LcSAP的N末端具有四个保守的半光氨酸残基，这种结构与抑制细胞凋亡的锌指蛋白A20类似；在蛋白的C端具有ANl类型的典型锌指结构域:Cx2-4Cx9-12Cx2Cx4Cx2Hx5HxC(x代表任意的氨基酸)，其中保守的半胱氨酸和组氨酸残基可以参与形成锌指结构。
[0028]利用Mega4.1将羊草LcSAP与其他物种的SAP基因的氨基酸序列进行聚类分析，构建LcSAP的进化树。从进化树可以看出，羊草LcSAP与獐毛AlSAP同源性最高，同源性为57.1% ;与苜蓿、水稻、毛竹、小立碗藓、美国西加云杉、毛果杨、番茄、甘蔗、葡萄、玉米序列同源性为 40.8%-45.1%(图 2)。
[0029]二、半定量RT-PCR分析羊草LcSAP基因的组织表达模式
[0030]将羊草培养至三叶期，取羊草叶和根至于液氮中冷冻保存。应用TaKaRa公司的RNAiso?Plus试剂盒提取羊草叶和根总RNA。应用Promage公司的Reverse TranscriptionSystem反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。根据羊草Actin基因序列(AB181991)设计引物 F2 (5，-GGACCTTGCTGGTCGTGACC-3’)和 R2 (5，-CCTCAGGGCACCTGAACCTTT-3 ’)。以羊草叶和根cDNA为模板，以Fl和Rl (或F2和R2)为引物，50 μ I PCR反应体系:1 μ I cDNA, I μ IFl (或 F2) (10ymol/L)，ly I Rl (或 R2) (10 μ mol/L)，25 μ I Premix Taq?，22 μ I 去离子水。PCR反应条件:94°C 2分钟；94°C 30秒，55°C 30秒，72°C I分钟，30个循环；72°C 10分钟。用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。[0031]半定量RT-PCR结果表明羊草LcSAP基因在羊草的叶和根中均有表达，在叶中表达量相对较高(图3A)。
[0032]三、半定量RT-PCR分析羊草LcSAP基因的胁迫诱导表达模式
[0033]将羊草培养至三叶期，用400mmol/L NaCl，IOOmmoI/LNa2CO3 和 20%PEG6000 处理三叶期羊草，胁迫处理后O小时、6小时、12小时、24小时后，提取羊草叶片RNA。应用Promage公司的Reverse Transcription System反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。以羊草cDNA为模板，以Fl和Rl(或F2和R2)为引物，50μ I PCR反应体系:1μ1 cDNA，I μ I Fl(或F2)(10 μ mol/L), I μ I Rl (或 R2) (10 μ mol/L)，25 μ I PremixTaq?, 22 μ I 去离子水。PCR 反应条件:94°C 2分钟；94°C 30秒，55°C 30秒，72°C I分钟，30个循环；72°C 10分钟。用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。
[0034]半定量RT-PCR结果表明LcSAP受到 400mM NaClUOOmM Na2CO3>20%PEG6000 的胁迫诱导表达，但是表达形式有所不同。在NaCl胁迫下LcSAP mRNA表达量逐渐升高；在Na2CO3胁迫下LcSAP mRNA表达量先升高再降低，在胁迫后6小时的表达量最高；在PEG6000胁迫下LcSAP mRNA表达量先降低再升高，在胁迫后12小时的表达量最低，在24小时的表达量最高。说明LcSAP受到中性盐、碱性盐和干旱的胁迫诱导表达(图3B)。
[0035]四、转基因酵母验证LcSAP基因功能
[0036]4.lpYES2/CT-LcSAP 载体构建
[0037]根据LcSAP 基因序列设计引物 F3 (5，-AATTAAGCTTATGGCGCAAGAGAGTTGGA-3，)和R3 (5，-GACTGAATTCTCAGAATCTGGTGACCTTATCAG-3’ )。以 pMD18-T_LcSAP 为模板，以 F3 和R3 为引物，50 μ I PCR 反应体系:1 μ I cDNA, I μ I Fl (10 μ mol/L)，I μ I Rl (10 μ mol/L)，25 μ I Premix Taq?, 22 μ I 去离子水。PCR 反应条件:94°C 2 分钟；94°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C I分钟，30个循环；72°C 10分钟。用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，回收目的片段。提取pYES2/CT质粒。将LcSAP基因PCR产物和pYES2/CT质粒分别用Hind III和EcoR I限制性内切酶进行双酶切。酶切反应体系如下:1μ I Hind ΙΙΙ，1μ1 EcoR I,2μ 110ΧΜBuffer,5y I PCR产物(或pYES2/CT质粒)，11 μ I去离子水。37°C I小时，电泳用后回收目的基因和线性化载体。将回收的目的基因和线性化载体在T4DNA连接酶的作用下16°C连接I小时。连接产物转化大肠杆菌ToplO感受态细胞，挑取单克隆菌落提取质粒，Hind III和EcoR I双酶切鉴定，阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序。鉴定为阳性的重组载体命名为 pYES2/CT-LcSAP。
[0038]4.2转化酿酒酵母菌株INVScl
[0039]酿酒酵母转化采用LiAc方法，具体步骤:挑取酿酒酵母菌株INVScl单克隆放入10ml Yro液体培养基中，30°C培养过夜；菌液稀释成50ml 0D600=0.4，在培养3小时；1500g离心收集细胞，用40ml I X TE重悬沉淀；1500g离心收集细胞，用2mllXLiAc/0.5 X TE重悬沉淀；室温放置10分钟；混合I μ g pYES2/CT-LcSA`P质粒(或pYES2/CT质粒)，100 μ g变性的硅精DNA，100 μ I酵母菌悬液和700μ llXLiAc/40%PEG3350/lXTE，充分混合，3(rC培养30分钟；加入88 μ 1DMS0混均，42°C热激7分钟，离心10秒钟去除上清；用ImllXTE重悬沉淀，再次离心收集细胞；用100 μ 11 X TE重选沉淀，涂布在含有Amp抗性的YH)平板上，筛选转化子。
[0040]4.3Northern 杂交[0041 ] 提取含有pYES2/CT和pYES2/CT_LcSAP的酿酒酵母RNA，步骤如下:用Iml预冷AE缓冲液(50mmol/L乙酸钠，pH5.2 ；IOmmoI/LEDTA, pH8.2)重悬离收集的酵母细胞，16000g,4°C，离心10秒钟；弃上清，重复以上步骤；用400 μ I预冷的AE缓冲溶液重悬酵母细胞，加Λ 40 μ 110%SDS充分混均，再加入440 μ I预先用AE缓冲液平衡的苯酚溶液(ρΗ5.2)充分混均；用液氮快速冷冻细胞5分钟，转移细胞至65°C水浴5分钟；重复用AE，10%SDS和苯酚溶液混均，再用液氮快速冷冻细胞5分钟，16000g，室温离心7分钟；转移上清至另一个新的1.5mlEP管里，加入600μ1酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)震荡;16000g，4°C，离心5分钟，转移上清至另一个新的1.5mlEP管里；加入50 μ 13mol/L乙酸钠(pH5.2)和Iml预冷的无水乙醇，_20°C放置20分钟;16000g，4°C，离心15分钟，弃上清，加入Iml预冷的80%乙醇；16000g,4°C,离心15分钟,弃上清,干燥沉淀,用100 μ I RNase-free水溶解沉淀。
[0042]Northern 杂交米用 Roche 公司的 DIG-High Prime DNA Labeling and DetectionStarter Kit I试剂盒。探针制备步骤如下:LcSAP基因全长PCR产物作为探针，取16 μ I探针沸水浴10分钟变性，立即放入冰水混合物中，加入4μ I DIG-High Prime到变性后的模版中，混匀后离心，37°C孵育20小时。
[0043]Northern杂交步骤如下:RNA样品在1.2%甲醛变性胶中50V下电泳3小时，将RNA转移到Hybong-N+尼龙膜上，用2X SSC溶液洗膜5分钟。50°C预杂交30分钟。探针于100°C煮沸10分钟，迅速放于冰中。含有探针的杂交液50°C杂交过夜。洗液I室温洗2X 10分钟。洗液 II68°C洗 2X 15 分钟。Washing buffer 室温洗膜 5 分钟。40ml Blocking buffer室温洗膜 30 分钟。20ml Antibody Solution 室温洗膜 30 分。50ml Washing buffer 室温洗膜2X 15分钟。20ml Detecting buffer室温洗膜5分钟。加入IOml显色液(IOmlDetecting buffer 和 200 μ I NBT/BCIP)，黑暗放置 I 小时。
[0044]通过Northern杂交表明LcSAP基因在转基因酿酒酵母中得到了表达(图4A)。
[0045]4.4转LcSAP基因酵母的诱导培养及耐盐性实验
[0046]转LcSAP基因酵母诱导培养具体步骤如下:挑取对照酵母(转PYES2/CT空载体的酵母)和转基因酵母(转pYES2/CT-LcSAP重组载体的酵母)单菌落，接种与SC-U液体培养基中(加入终浓度为2%的葡萄糖)中，30°C振荡培养24小时；调整5ml的培养液0D600为0.3 ；6000rpm离心I分钟；用Iml诱导培养基(SC-U含有2%半乳糖和2%面子糖)重悬菌体，接种于50ml的诱导培养基中30°C振荡培养24小时。
[0047]转LcSAP基因酵母耐盐性实验具体步骤如下:从对照酵母和转基因酵母中各取?μ 1，按照10'10_2、10_3倍数进行稀释；从各稀释的酵母液中去5μ I在Yro培养基和含有
1.4mol/LNaCl的YPD培养基上点板；30°C培养72小时，拍照记录。
[0048]结果表明，在正常情况下，对照酵母和转基因酵母长势基本一致。但是，在1.4mol/LNaCl胁迫下，转LcSAP基因酵母的长势明显好于对照(图4B)。说明LcSAP基因明显提高了转基因酵母的耐盐能力。
[0049]应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
[0050]序列表
[0051]SEQUENCELISTING
[0052]<110> 申请人:西北农林科技大学[0053]<120>羊草胁迫相关蛋白基因LcSAP及其应用
[0054]〈130〉
[0055]〈160〉10
[0056]<170> PatentInversion3.5
[0057]〈210〉I
[0058]〈211〉889
[0059]〈212〉DNA
[0060]〈213〉LcSAP的核苷酸序列
[0061]<400> I
[0062]
ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtggtatcaacgc agagtacgcg gggggacgcc60
acccaaaagg aaaggacaca ggcataaaagaacgccaaca aaataacaag aacagaattc120
tatxccccgg aagaacaggc ggaagagaggagccgatccc cgtgccgtxt cctccgtgt.t180`tccgatcgac ccaccggcta tccggctagaaatggcgcaa gagagttgga aagaggcaga 240
ggagactggt atccacgcac ccgaggctccgat.aatgtgc a.tcaacaact gtggcttctt300
cggcaaccgg atgacagaga acatgtgctcaaagtgttac cgagacactg tcaaggccaa360
gaggat.ggcc actctagt.cg agaacaaaact.gcggctgct gttgcat.cgt cacccacacc420
gttggtggca gagatcaagg atgaagcgtctgcctcagcc aaagaaggga agcaagtagc480
cgaagaagat gcgccgaagc cacccagcaaccgctgcctg tcgtgccgga agaaggtcgg540
gctgacaggg ttcaagtgcc gctgcggagacaccttctgc tcaacgcacc gctacgccga 600
tgcgcacaat tgcaagtt.cg acta.caagcaggccggcagg gagcagatxg cccagcagaa660
ccccgtcgtc aaggctgaca aggtcaccagattctgatga tggattggtg gttctgcagg720
agtcctccag ctcgtttatt tcctcatgatgatgatgctt cttggtccgt caggtttact780
tcagaattgt gtgtctacca tcctcctggaatgtactttg ccgatgaacc cgccttcgac840
aaacaccacc atccgatgcc cgtccaacgaccatcaacgg gccat.tgca889
[0063]〈210〉2
[0064]〈211〉161
[0065]〈212〉PRT
[0066]〈213〉LcSAP编码的氨基酸序列
[0067]<400>2
[0068]
【权利要求】
1.羊草胁迫相关蛋白基因LcSAP，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的羊草胁迫相关蛋白基因LcSAP在培育耐盐胁迫转基因植物品 种中的应用。
【文档编号】A01H5/00GK103757029SQ201410016123
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月14日 优先权日:2014年1月14日
【发明者】麻鹏达, 刘晶莹, 郭梦雪, 杨睎喆, 李莹莹, 王爱芹 申请人:西北农林科技大学