专利名称：小麦千粒重性状相关基因、基因的单倍型及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种小麦千粒重性状相关基因、基因的单倍型及其应用。
背景技术：
蔗糖是高等植物光合作用的主要产物，是碳运输的主要形式，即大多数植物 叶片中的最初光合产物-葡萄糖在酶的作用下转化成蔗糖后(源)才能转运到植物 的其他各器官(库)(Fisher D B, Wang N. Sucrose Concentration Gradients along thePost-Phloem Transport Pathway in the Maternal Tissues of Developing Wheat Grains. Plant Physiol, 1995,109 :587-592. ；Wang H L, Lee P D, Chen W L, et al. Osmoticstress—induced changes of sucrose metabolism in cultured sweet potato cells. J Exp Bot，2000，51 :1991-1999.)。蔗糖由源器官运转到库器官后，只有转化为己 糖或磷酸己糖后才能进入细胞内的其他代谢过程，否则将出现蔗糖积累。而蔗糖转化为 己糖或磷酸己糖是通过一些酶的作用实现的。目前研究认为与蔗糖代谢有关的酶主要有 三类，即转化酶或 β -呋喃果糖苷酶 Gnvertase，β -fructofuranosidase, EC3. 2. 1. 26， hv)，蔗糖合成酶(Sucrose Synthase, EC2. 4. 1. 13，SS)和蔗糖磷酸合成酶(Sucrose PhosphateSynthase, EC2. 3. 1. 14, SPS)(Fisher D B, Wang N. Sucrose Concentration Gradientsalong the Post-Phloem Transport Pathway in the Maternal Tissues of Developing WheatGrains. Plant Physiol, 1995,109 :587-592. ；Wang H L, Lee P D, Chen W L, et al. Osmotic stress-induced changes of sucrose metabolism in cultured sweet potato cells. JExp Bot，2000，51 :1991-1999.)。其中 SS 对于调节“源”与“库” 的关系具有重要的意义，在马铃薯中反义表达SS的研究中发现，SS是决定马铃薯块茎 库强(sink strength)白勺(Rita Ζ, Marcel S, Lothar W, Uwe S. Evidence of the crucial role of sucrosesynthase for sink strength using transgenic potato plants (Solanum tuberosum L.) ThePlan Journal, 1995，7 :97-107)。在大多数植物中，它 已经被确认有2种不同的存在形式sstl和sst2。小麦品种的籽粒性状如饱满度，千粒重等都存在很大的差异，所有的育种家都 希望找到最优异的变异类型。SNP(Single-NuCleotide Polymorphisms)最大限度地代 表了不同个体之间的遗传差异，这种在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA 序列多态性，更有助于解释个体间的表型差异，因而成为研究复杂性状的重要遗传标记 (Collins F SiGuyer M S，Chakravarti A. Variations on a theme :cataloginghuman DNA sequence variation. Science, 1997, 279 :1580-1581. ；Kim M Y，Ha B K，Jun T H，Hwang E Y，Van K，Kuk Y I, Lee S K. Single nucleotide polymorphismdiscovery and linkage mapping of lipoxygenase-2 gene (Lx2)in soybean. Euphytica,2004,135 :169-177.)。 研究发现，位于同一条染色体上的SWs之间不是孤立的，相邻的等位基因往往倾向于同 时出现。如果相邻的等位基因同时出现的频率超过随机发生的概率，则称为连锁不平衡 (Linkage Disequilibrium，LD)(Smith A V，ThomasD J，Munro H I Μ, et al. Sequence
4features in regions of weak and strong linkagedisequilibrium. Genome Res,2005, 15:1519-1534.)。位于一条染色体特定区域、相互关联、倾向于以整体模式遗传给后代 的 SNI3S 组合称为单倍型(Wail J D, Pritchard J K. Haplotype blocks and linkage disequilibrium in the human genome. NatRev Genet，2003，4 :587-597.)，利用单倍型信 息进行与表型性状间的关联研究分析自然是优于利用单个SNP标记。如今，单倍型多样性 被越来越广泛地应用于群体遗传学研究，首先选择少量样本寻找和鉴定个体单倍型，然后 开发SNP marker，在较大数量的样本中进行单倍型分型，最后用所有分型样本进行单倍型 和表型的关联分析，希望找到具有功能的优异单倍型，从而服务于育种实践或进化等理论 方面的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种小麦千粒重性状相关基因、基因的单倍型及其应用。本发明提供了一种辅助检测小麦千粒重性状的方法，包括如下1)-3)中任一技术 方案1)检测待测小麦的基因组中的序列1所示基因自5’末端第114位核苷酸为T还 是为C，确定待测小麦的基因型是TT还是CC，TT基因型的待测小麦的千粒重低于CC基因 型的待测小麦；所述TT基因型为序列1所示基因自5’末端第114位核苷酸为T的纯合体； 所述CC基因型为序列1所示基因自5’末端第114位核苷酸为C的纯合体；2)检测待测小麦的基因组中的序列1所示基因自5’末端第566位核苷酸为T还 是为C，确定待测小麦的基因型是TT还是CC，TT基因型的待测小麦的千粒重低于CC基因 型的待测小麦；所述TT基因型为序列1所示基因自5’末端第566位核苷酸为T的纯合体； 所述CC基因型为序列1所示基因自5’末端第566位核苷酸为C的纯合体；3)检测待测小麦的基因组中的序列1所示基因自5’末端第沈45位核苷酸为A还 是为G，确定待测小麦的基因型是AA还是GG，AA基因型的待测小麦的千粒重低于GG基因型 的待测小麦；所述AA基因型为序列1所示基因自5’末端第沈45位核苷酸为A的纯合体； 所述GG基因型为序列1所示基因自5’末端第沈45位核苷酸为G的纯合体。所述确定待测小麦的基因型的方法可包括如下步骤(1)提取待测小麦的基因组DNA ；(2)以待测小麦的基因组DNA为模板进行PCR扩增，根据PCR产物确定待测小麦的
基因型。所述步骤⑵具体可为以待测小麦的基因组DNA为模板，分别用引物对甲和引物 对乙进行PCR扩增；如果采用引物对乙没有得到扩增产物，采用引物对甲得到42!3bp的扩增 产物，针对序列1所示基因自5’末端第566位核苷酸，待测小麦的基因型为CC ；如果采用 引物对甲没有得到扩增产物，采用引物对乙得到381bp的扩增产物，针对序列1所示基因自 5’末端第566位核苷酸，待测小麦的基因型为TT ；所述引物对甲为序列表的序列2和序列 表的序列3所示核苷酸组成的引物对；所述引物对乙为序列表的序列4和序列表的序列5 所示核苷酸组成的引物对。本发明还保护用于辅助检测小麦千粒重性状的专用引物，由引物对甲和引物对乙 组成；所述引物对甲为序列表的序列2和序列表的序列3所示核苷酸组成的引物对；所述引物对乙为序列表的序列4和序列表的序列5所示核苷酸组成的引物对。所述专用引物在制备辅助检测小麦千粒重性状的试剂盒中的应用也属于本发明 的保护范围。本发明同时保护一种辅助检测小麦千粒重性状的试剂盒，包所述专用引物。所述专用引物或所述试剂盒均可应用于辅助检测小麦千粒重性状。本发明还保护小麦千粒重性状相关基因，是如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且与小麦千粒重性状相关的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且与小麦千粒重性状相关的 DNA分子。扩增所述基因及其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围，如序列表的序列 6和序列表的序列7组成的引物对。所述方法、试剂盒或所述基因均可应用于小麦育种。本发明得到了与小麦千粒重相关的基因，并基于该基因在不同品种的小麦中发现 了 3个SNP位点，该三个SNP位点紧密连锁，呈现两个单倍型。将单倍型与千粒重性状进行 关联分析，发现两种单倍型与千粒重显著相关，两种单倍型的千粒重平均相差3克以上。本 发明提供的基因、方法和试剂盒在小麦产量育种中将具有广阔的应用前景。
图1为Tasst2B序列SNP位点。图2为基于AS-PCR原理开发SNP marker示意图。图3为应用引物对甲和引物对乙进行PCR扩增，扩增产物的电泳结果；(a) 1. 5%琼脂糖凝胶电泳；1 原冬822 ；2 骊英5号；3 苏麦3号；4 恩麦4号； 5 京红5号；6 鄂麦6号；7 安徽3号；8 晋麦2148 ；9 丰产3号；10 内麦11 ；11 百农 3217 ；12 西农6028 ；13 冀麦2号；14 小偃6号；15 陕农7859 ；16 晋春3号；17 温麦6 号；18 莱州953 ；19 甘麦8号；20 金麦4号；M =Marker ；(b)6%聚丙烯酰胺变性凝胶电泳；A 原冬822 ；2 丽英5号；3 苏麦3号；4 恩麦 4号；5 鄂麦6号；6 农大311 ；7 农大311 ；8 京红5号；9 内麦11 ；10 晋春3号；11 北 京8号；CS 中国春。图 4 为不同育成年代(40s :1940-1949 ；50s :1950-1959 ；60s :1960-1969 ；70s 1970-1979 ；80s :1980-1989 ；90s :1990-1999)育成的品种中Tasst2B的两种单倍型所占的 比例。图5为不同省份的品种中Tasst2B的两种单倍型所占的比例。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的“ ％ ”，如无特殊说明，均为质量百分含量。 以下实施例中的所有小麦样本均获自国家种质库(http://icRr. caas. net. cn/cRris国家种质库.html),表1和表4中的编号均为种质咨源数据库统一编号，其中没有列,屮,编号的， 为种质库中的新增品种，尚无编号。实施例1、单倍型的发现1、根据小麦II型蔗糖合成酶基因iTasstZ的cDNA序列(GENBANK ACCESS 10NNUMBER AJ000153)设计引物(sst2-167，sst2_168)获得Tasst2的基因组序列Tasst2B，全长 4344bp (见序列表的序列1)。引物对丙sst2-167 :5’ -CGCCCTGAGCCGCATCCACA-3’ ；sst2-168 :5， -CGCTCGCCCGCCATTTATTTCTCT-3，。2、选择微核心种质黄淮麦区的65份小麦品种，扩增并分析Tasst2的基因组序 列Tasst2B，发现Tasst2B序列在品种间具有单核苷酸多态性(SNP :single-nucleotide polymorphisms)(见图 1)。在序列1所示I~aSSt2的基因组序列Tasst2B中，存在3个SNP位点自5’末端第 114位核苷酸为T或C，自5’末端第566位核苷酸为T或C，自5’末端第沈45位核苷酸为 A或G。3个SNP位点紧密连锁出现当自5’末端第114位核苷酸为T时，自5’末端第566 位核苷酸一定为T，自5’末端第沈45位核苷酸一定为A ；当自5’末端第114位核苷酸为C 时，自5’末端第566位核苷酸一定为C，自5’末端第沈45位核苷酸一定为G。所以该基因 呈现两个单倍型(Hyplotype)单倍型TTA(在序列1所示Tasst2的基因组序列Tasst2B 中，自5’末端第114位核苷酸为T，第566位核苷酸为1\第沈45位核苷酸为A)和单倍型 CCG(在序列1所示Tasst2的基因组序列Tasst2B中，自5’末端第114位核苷酸为C，第 566位核苷酸为C，第沈45位核苷酸为G)。将单倍型CCG命名为Tasst2B-M，将单倍型TTA 命名为 Tasst2B-F。3个SNP位点临近序列如下所示第114 位(T/C) :5，-TTGATCTTTTGCAGGCTARACTGGCTGCCGGTTTGTAG-3，；第566 位(T/C) :5，-CAATGCCGCGATCCCAGAGGCCGAGCGRGAGAAGCTC-3，；第2645 位(A/G) :5，-CTATCCCCTTTTGCTCARTACAAGATGTATTCT-3，。3、根据等位基因特异性 PCR(allele_specific PCR, AS-PCR)的原理，据 566bp 处 的SNP开发基因组特异的SNP marker (两个特异性引物对由162和566M组成的引物对甲 和由204和566F组成的引物对乙；见图2)。并用已测序列验证此marker的准确性。引物对甲162(上游引物)5，-TAAGCGATGAATTATGGC-3，；566M (下游引物)5，-GGTGTCCTTGAGCTTCTgA-3，。引物对乙2O4 (上游引物)5，-ctataGTATGAGCTGGATCAATGGC-3‘；566F (下游引物)5，-GGTGTCCTTGAGCTTCTgG-3，。566M、566F引物在3，端除了包含SNP位点一个碱基差异外，人为地在3，端第二个 碱基处引入了一个与已知序列不同的错配碱基。162和204引物是基因组特异引物，根据小 麦A，B，D基因组sst2序列差异设计。实施例2、单倍型与千粒重的关联分析
微核心种质材料的所有育成品种共89份，提取基因组DNA作为模板，分别用引物 对甲(由162和566M组成的弓I物对)和引物对乙(由204和566F组成的弓|物对)进行PCR， 通过PCR产物的大小获得单倍型数据，将得到的单倍型数据与千粒重(2002，2005，2006三 年的调查数据)进行相关分析(采用SPSS12. 0软件，选择Pearson相关系数)。提取基因组DNA的具体步骤如下1)取2_3g新鲜叶片，加入液氮迅速研磨，然后将粉末装入到1. 5mL离心管中(约 占 1/3 管)，加入 900 μ 1 65°C预热的缓冲液 S(pH8. 5Tris · Cl IOOmM, NaCllOOmM, pH8. 0 EDTA 50mM, SDS 2% )，充分混勻。2)将离心管置于65°C水浴中温浴1. 5-浊，其间轻轻摇晃数次。3) IOOOOrpm离心IOmin,取上清液入另一个1. 5mL离心管，加入700 μ L的酚-氯 仿，轻摇IOmin以上，室温下IOOOOrpm离心IOmin04)将上清液转移到另一个1. 5mL离心管中，加入等体积氯仿，轻摇IOmin左右， IOOOOrpm 离心 IOmin05)将上清液转移至另一个1.5mL离心管内，加入0.6倍体积的异丙醇，摇勻 后-20°C静置30分钟，勾出絮状DNA沉淀，转入另一离心管中，用70% (体积百分比)的乙 醇浸洗2-3次(或10000rpm离心IOmin)，小心倒掉溶液，最后将DNA转移到一新管中。6)将DNA置于通风厨中通风干燥，干燥后，先加入80 μ LXTE，加入5 μ L RNaseA (20mg/ml)，37°C消化2小时，纯化前再加入620 μ L IX TE,再纯化。7)加入等体积的酚-氯仿(1:1)，轻摇IOmin以上，于IOOOOrpm下离心lOmin。8)取上清液，加入等体积氯仿，轻轻摇勻后，于IOOOOrpm下离心lOmin。9)取上清液，加入1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH5. 2)，混勻后加入2倍体积冰冷 的无水乙醇。10)轻轻摇勻后置于 _20°C下 15-20min、IOOOOrpm离心 lOmin，弃上清，DNA 用 70% 乙醇漂洗2-3次，充分干燥后加入适量的IXTE溶解，用作DNA原液。11)用0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，在Smart SpecTM3000 (BIO-RAD)上测 定浓度后，取适量的DNA原液用1 X TE稀释为SO-IOOng/ μ L，置于4°C备用，并将剩下的DNA 原液保存于_20°C。PCR 在 PTC-225 (MJ. Research, Inc)型热循环仪上运行。将采用引物对甲得到的PCR产物和采用引物对乙得到的PCR产物混合，然后在 1.5%的琼脂糖凝胶上(部分结果见图3a)或者6%聚丙烯酰胺变性凝胶上检测(部分结果 见图3b)。如果采用引物对甲得到的PCR产物和采用引物对乙得到的PCR产物的混合物中， 只有42!3bp的条带，待测样本中为单倍型Tasst2B-M的纯合体；如果采用引物对甲得到的 PCR产物和采用引物对乙得到的PCR产物的混合物中，只有381bp的条带，待测样本中为单 倍型Tasst2B-F的纯合体；如果采用引物对甲得到的PCR产物和采用引物对乙得到的PCR 产物的混合物中，同时具有423bp和381bp的条带，待测样本中为单倍型Tasst2B-M和单倍 型Tasst2B-F的杂合体。将PCR产物进行测序，验证电泳结果，结果表明，电泳结果与测序 结果一致。89个样本的单倍型和千粒重性状(2002，2005，2006三年的调查数据)见表1。
表1 89个样本的单倍型和千粒重性状
权利要求
1.辅助检测小麦千粒重性状的方法，包括如下1)-3)中任一技术方案1)检测待测小麦的基因组中的序列1所示基因自5’末端第114位核苷酸为T还是为 C，确定待测小麦的基因型是TT还是CC，TT基因型的待测小麦的千粒重低于CC基因型的待 测小麦；所述TT基因型为序列1所示基因自5’末端第114位核苷酸为T的纯合体；所述 CC基因型为序列1所示基因自5’末端第114位核苷酸为C的纯合体；2)检测待测小麦的基因组中的序列1所示基因自5’末端第566位核苷酸为T还是为 C，确定待测小麦的基因型是TT还是CC，TT基因型的待测小麦的千粒重低于CC基因型的待 测小麦；所述TT基因型为序列1所示基因自5’末端第566位核苷酸为T的纯合体；所述 CC基因型为序列1所示基因自5’末端第566位核苷酸为C的纯合体；3)检测待测小麦的基因组中的序列1所示基因自5’末端第沈45位核苷酸为A还是为 G，确定待测小麦的基因型是AA还是GG，AA基因型的待测小麦的千粒重低于GG基因型的待 测小麦；所述AA基因型为序列1所示基因自5’末端第沈45位核苷酸为A的纯合体；所述 GG基因型为序列1所示基因自5’末端第沈45位核苷酸为G的纯合体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述确定待测小麦的基因型的方法包括如 下步骤(1)提取待测小麦的基因组DNA；(2)以待测小麦的基因组DNA为模板进行PCR扩增，根据PCR产物确定待测小麦的基因型。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤O)中，以待测小麦的基因组DNA为模 板，分别用引物对甲和引物对乙进行PCR扩增；如果采用引物对乙没有得到扩增产物，采用 引物对甲得到42!3bp的扩增产物，针对序列1所示基因自5’末端第566位核苷酸，待测小 麦的基因型为CC ；如果采用引物对甲没有得到扩增产物，采用引物对乙得到381bp的扩增 产物，针对序列1所示基因自5’末端第566位核苷酸，待测小麦的基因型为TT ；所述引物 对甲为序列表的序列2和序列表的序列3所示核苷酸组成的引物对；所述引物对乙为序列 表的序列4和序列表的序列5所示核苷酸组成的引物对。
4.用于辅助检测小麦千粒重性状的专用引物，由引物对甲和引物对乙组成；所述引物 对甲为序列表的序列2和序列表的序列3所示核苷酸组成的引物对；所述引物对乙为序列 表的序列4和序列表的序列5所示核苷酸组成的引物对。
5.权利要求4所述专用引物在制备辅助检测小麦千粒重性状的试剂盒中的应用。
6.一种辅助检测小麦千粒重性状的试剂盒，包括权利要求4所述专用引物。
7.权利要求4所述专用引物或权利要求6所述试剂盒在辅助检测小麦千粒重性状中的 应用。
8.小麦千粒重性状相关基因，是如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且与小麦千粒重性状相关的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且与小麦千粒重性状相关的DNA 分子。
9.扩增权利要求8所述基因的引物对，是序列表的序列6和序列表的序列7组成的引 物对。
10.权利要求1至3中任一所述方法、权利要求4所述专用引物、权利要求6所述试剂 盒或权利要求8所述基因在小麦育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种小麦千粒重性状相关基因、基因的单倍型及其应用。本发明提供了辅助检测小麦千粒重性状的方法，包括如下1)-3)中任一技术方案1)检测待测小麦的基因组中的序列1所示基因自5’末端第114位核苷酸为T还是为C，TT基因型的待测小麦的千粒重低于CC基因型的待测小麦；2)检测待测小麦的基因组中的序列1所示基因自5’末端第566位核苷酸为T还是为C，TT基因型的待测小麦的千粒重低于CC基因型的待测小麦；3)检测待测小麦的基因组中的序列1所示基因自5’末端第2645位核苷酸为A还是为G，AA基因型的待测小麦的千粒重低于GG基因型的待测小麦。以上单核苷酸多态的发现基于本发明提供的小麦千粒重性状相关基因。本发明提供的基因和方法在小麦产量育种中将具有广阔的应用前景。
文档编号C12N15/11GK102086472SQ20091024170
公开日2011年6月8日 申请日期2009年12月8日 优先权日2009年12月8日
发明者侯健, 姜奇彦, 张学勇, 王兰芬, 盖红梅, 郝晨阳 申请人:中国农业科学院作物科学研究所