LEGreen混合染料及其应用的制作方法

专利名称：LE Green混合染料及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及双链核苷酸检测技术，具体涉及一种LE Green混合染料，本发明还涉 及采用LE Green染料Mix定量检测DNA的方法。
背景技术：
目前定量检测DNA的方法有分光光度法，检测260nm处的吸光值，DNA含量二 0D260 X 50 g/ml ，但此方法操作比较复杂，而且误差较大；另一种常用方法是利用溴化乙 锭结合DNA分子，在紫外光激发下产生红色荧光，荧光强度与DNA量成正比，利用标准曲线， 可对进行DNA定量分析，由于溴化乙锭是致癌物质，不宜推广。 目前人们改用SYBR Green I和SYBR Gold为染料的荧光定量检测DNA。由于这两 种荧光染料只与DNA双链结合，在与DNA双链结合后发出荧光，荧光强度与DNA双链产物量 成正比，可根据标准曲线，进行DNA定量分析。但由于一般染料不稳定，高温降解，见光易分 解，发射光的光谱宽，光稳定性差，检测本底高，准确度较低，也不宜推广。为此必须寻找一 种能快速、高效、安全的定量检测DNA的方法。 LC Green是绿色荧光核酸染料，激发波长为440 470nm，发射波长为470520nm， LC Green荧光染料特异性的与DNA双链结合后，在激发波长作用下能够产生强烈的 荧光，这种特性使它特别适合于常规的DNA浓度确定。在实验过程中，需要加入的浓度很 少，可以降低实验成本。同时，LC Green染料与DNA结合后对PCR反应无任何抑制作用，但 其它染料，如SYBR Green I对PCR有抑制作用，所以对后续实验有一定的影响。LC Green 在高温条件下不易分解，热稳定性良好，且与DNA结合稳定，为常规操作提供了便利。
Eva Green也是一种绿色荧光核酸染料，当染料和DNA结合后，其激发和发射光谱 与荧光素以及LC Green相似。这使得这两种染料可以直接采用配置了 488nm氩离子激光 器或者此光谱区域内任何可见光激发装置的仪器检测。Eva Green有良好的热稳定性和水 解稳定性；其本身没有荧光，但和双链DNA结合后能发出高亮度的荧光，这种特性使它非常 适合于常规DNA浓度的确定。Litron独立实验室(Litron Laboratories, Rochester, NY) 进行的艾姆斯氏测试结果表明，Eva Green没有诱变性和细胞毒性。实验显示，Eva Green 完全没有细胞膜透性，这可能是观察到低毒性的关键因素。然而将Eva Green染料用于双 链核酸的检测手段仍不健全，在实际应用中难以取得好的染色效果。为此必须寻找一种能 快速、高效、安全的定量检测双链核酸如基因组DNA的方法。

发明内容
本发明的目的在于针对上述不足提供一种简单、快速、特异性强、灵敏度高的核酸 染料，以及采用该染料定量检测双链核酸如基因组DNA的方法。 本发明将LC Green和Eva Green按比例稀释成LE Green染料Mix利用LE Green 与双链DNA结合产生荧光，且荧光的强度与DNA的量成正相关性来定量检测双链核酸如基 因组DNA，通过将LEGreen染料Mix与待测双链核苷酸溶液混合避光室温孵育，检测其荧光
3强度，通过与标准曲线进行比对，得到待测双链核苷酸溶液的浓度。 其中，LE Green染料溶液Mix的配制方案是 Na2HP040 . 01 0. 03mol/L NaH2P040 . 01 0. 03mol/LNaCl 0. 15 0. 25mol/L EDTA 2Na 1. 5 3. 5,1/L PVP 0.05-0. 20%TritonX-100 0.05-0.15% Eva Green 2. 0 4. 0 u mol/L LC Green 1. 0 3. 0 u mol/L 甘油 3 8% 最后用磷酸调pH至7.0 7. 5 其余为双蒸水。 所述LE Green染料溶液Mix的配制优选方案为 Na2HP040 . 02mol/L NaH2P040 . 02mol/L NaCl 0. 20mol/L EDTA 2Na 2. 5,1/L PVP 0. 1 % TritonX-1000. 1% Eva Green 3. On mol/L LC Green 2. On mol/L 甘油 5% 最后用磷酸调pH至7. 3 其余为双蒸水。 可采用Modulus多功能光度计、荧光酶标仪或实时定量PCR仪检测荧光信号。
本发明所述的双链核苷酸包括基因组DNA或其片断、质粒DNA或其片断以及人工 双链序列。 以Modulus多功能光度计为例，利用LE Green混合染料对双链核酸进行精确定 量，具体可包括如下步骤 1)将DNA标准品和未知样品配制成系列浓度的50 L溶液，在每个溶液中加入 50iiL LE Green Mix，充分混合。 2)在Modulus多功能光度计上选择蓝色模块，先测DNA标准物质的荧光值，建立标 准曲线。 3)然后对未知样品DNA进行检测，Modulus直接得出浓度值。
将LC Green和Eva Green按比例混合稀释为LE Green混合染料可以在Modulus 的蓝色模块中定量双链核酸的浓度，两种染料可以优势互补，应用LE Green染料Mix能对 至少100 ii 1样品的双链DNA直接定量。Modulus多功能光度计的检测灵敏度为100 样 品中50pg的DNA。即使在核酸制备过程中引入了盐、尿素、乙醇、氯仿、去污剂、蛋白或琼脂等常见的几种污染物，这种检测结果的线性仍能获得。实验检测中的RNA和单链DNA产生 的荧光量极小，当用LEGreen染料Mix和Modulus多功能光度计进行实验时发现相同克分 子数的单链DNA和RNA对定量结果几乎没有什么影响。
本发明所述方法的优点 1)采用LE Green染料Mix定量检测DNA的方法操作简单，快速。它对所有样品的 DNA定量具有广泛的适应性。 2)采用LE Green染料Mix定量检测DNA的方法具有较高的灵敏度，可以检测出 pg级的DNA模板。 3)采用LE Green染料Mix定量检测DNA的方法操作对所有样品的DNA定量具有 广泛的适应性。即使在核酸制备过程中引入了盐、尿素、乙醇、氯仿、去污剂、蛋白或琼脂等 常见的几种污染物，这种检测结果的线性仍能获得。


图1小牛胸腺DNA浓度与荧光值标准曲线图。
图2小牛胸腺双链核酸浓度灵敏度曲线图。
具体实施方案 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件， 例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1基因组DNA的制备 以植物为例，采用CTAB法提取基因组DNA，称取200mg经预处理的试样，在液氮中 充分研磨后装入液氮预冷的1. 5mL或2mL离心管中(不需研磨的试样直接加入)。加入lmL 预冷至4°C的抽提液，剧烈摇动混匀后，在冰上静置5min， fC条件下10000g离心15min，弃 上清液。加入600 ii L预热到65°C的裂解液，充分重悬沉淀，在65t:恒温保持40min，期间颠 倒混匀5次。室温条件下，10000g离心10min，取上清液转至另一新离心管中。加入L RNaseA，37。C恒温保持30min。分别用等体积酚氯仿异戊醇(25 : 24 : 1)，反复抽提 两次，再用氯仿/异戊醇(24 : l)抽提一次。室温条件下，10000g离心10min，取上清液转 至另一离心管中。加入2/3体积异戊醇，1/10体积3mol/L乙酸钠溶液(pH5. 6) ，-20。C放置 2-3h。在4t:条件下，10000g离心15min，弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀一次，倒出乙醇， 晾干沉淀。加入50 ii L TE (pH8. 0)溶解沉淀，所得溶液即为样品DNA溶液。
实施例2LE Green染料Mix制备与使用方法 LE Green染料Mix溶液的配方1如下Na2HP04 0 . 02mol/L ;NaH2P04 0 . 02mol/ L;NaCl 0.20mol/L ;EDTA 2Na 2.5mmol/L ;PVPO. 1 % ;TritonX-lOO 0. 1 % ;Eva Green 3. 0 ii mol/L ;LC Green 2. 0 y mol/L ;甘油5% ;最后用磷酸调pH至7. 3 ;其余为双蒸水。
LE Green染料Mix溶液的配方2如下:Na2HP04 0. Olmol/L ;NaH2P04 0. Olmol/L ; NaCl 0.15mol/L ;EDTA 2Na 1.5mmol/L ;PVP 0. 05 % ;TritonX-lOO 0. 05 % ;Eva Green 2. 0 ii mol/L ;LC Green 1. 0 y mol/L ;甘油3% ;最后用磷酸调pH至7. 0 ;其余为双蒸水。
LE Green染料Mix溶液的配方3如下Na2HP04 0 . 03mol/L ;NaH2P04 0 . 03mol/ L ;NaCl 0.25mol/L ;EDTA 2Na 3. 5mmol/L;PVPO. 2 % ;TritonX-lOO 0. 15 % ;Eva Green 4. 0 ii mol/L ;LC Green 3. 0 y mol/L ;甘油8% ;最后用磷酸调pH至7. 5 ;其余为双蒸水。
LE Green浓縮染料是LC Green和Eva Green染料混合后的Mix溶液。溶液制备 需用塑料器皿不能用玻璃器皿，因为试剂中某些成分会吸附到玻璃器皿表面。用箔金纸包 裹或放置黑暗处避光保存。 注溶液在制备后数小时内使用检测结果会比较好。实施例3DNA标准溶液、空白 对照液和样品DNA溶液的制备 标准溶液的制备。小牛胸腺DNA常用来做标准曲线，制备浓度为400ng/mL的溶液。 将等体积的小牛胸腺DNA储存液加入到的LEGreen Mix工作液中，充分混合，标准液最终浓 度200ng/ml。 空白对照液的准备。加入相同体积的样品缓冲液到LE Green Mix工作液中，充分 混合。 样品DNA溶液的准备。加入相同体积的样品到LE Green Mix工作液中，充分混合。
实施例4基因组DNA样品测定
1)建立标准曲线将终浓度浓度为12. 5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、 100ng/mL、200ng/mL的标准DNA溶
液转到100 ill微量检测皿中，避光室温孵育2-5min，注意转移过程中不要引入气泡。点击
"MeasureFluorescence"，样品最终结果会显示在功能机显示屏上，图1为小牛胸腺DNA浓
度与荧光值标准曲线图。 2)校准Modulus多功能光度计 以Modulus多功能光度计为例，采用用150ng/ml标准DNA进行校准。 注单点校准精确度会更高，用一个和检测样品浓度相同或相近的标准样优化系
统，例如，若检测样品浓度在100ng/ml，要用一个50 150ng/ml标准DNA样。保存这次校
准以供将来使用。 3)样品分析 样品加入100 ii 1微量检测皿中，点击"Measure Fluorescence",样品最终结果会 显示在功能机显示屏上，采用LE Green染料Mix溶液的配方1、配方2、配方3，测得基因组 DNA的浓度分别为155ng/ml， 163ng/ml， 159ng/ml。
实施例5准确度测定 制备小牛胸腺DNA浓度为300ng/ml的溶液。将等体积的小牛胸腺DNA储存液加 入到的LE Green Mix工作液中，充分混合，标准液最终浓度150ng/ml。采用上述方法测定， 最终测得浓度(三次平均值)为149.8ng/ml。
实施例6灵敏度测定 制备小牛胸腺DNA浓度为6. 4ng/ml的溶液。梯度稀释成浓度为3. 2ng/ml、l. 6ng/ ml、0. 8ng/ml、0. 4ng/ml的溶液，将等体积的小牛胸腺DNA储存液加入到的LE Green Mix 工作液中，充分混合，终浓度为3. 2ng/ml、l. 6ng/ml、0. 8ng/ml、0. 4ng/ml、0. 2ng/ml。经 Modulus多功能光度计测定，得到图2小牛胸腺双链核酸浓度灵敏度曲线图，灵敏度可达到 0. 4ng/ml (低于0. 4ng/ml，读数接近于0)。
权利要求
一种LE Green染料溶液Mix，其含有下列组分Na2HPO4 0.01～0.03mol/LNaH2PO4 0.01～0.03mol/LNaCl0.15～0.25mol/LEDTA·2Na 1.5～3.5mmol/LPVP 0.05-0.20％TritonX-100 0.05-0.15％Eva Green 2.0～4.0μmol/LLC Green1.0～3.0μmol/L甘油3～8％最后用磷酸调pH至7.0～7.5其余为双蒸水。
2. 如权利要求1所述的LE Green染料溶液Mix,其含有下列组分 Na2HP04 0 . 02mol/LNaH2P04 0 . 02mol/LNaCl 0. 20mol/LEDTA 2Na2. 5,1/L PVP 0. 1 %TritonX-100 0.1% Eva Green3. Oumol/L LC Green 2. O践ol/L甘油 5% 最后用磷酸调pH至7.3 其余为双蒸水。
3. 权利要求1或2所述LE Green染料溶液Mix在双链核苷酸定量检测中的应用。
4. 一种双链核苷酸定量检测的方法，其包括步骤用权利要求1或2所述的采用LE Green染料Mix与待测双链核苷酸溶液混合避光室温孵育，检测其荧光强度，通过与标准曲 线进行比对，得到待测双链核苷酸溶液的浓度。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，孵育时间为2 5min。
6. 如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，还包括将所述待测双链核苷酸溶液配制 成系列浓度的样品，然后分别与LE Green染料溶液Mix混合孵育。
7. 如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述标准曲线是以小牛胸腺DNA为标准 物建立。
8. 如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，采用Modulus多功能光度计、荧光酶标 仪或实时定量PCR仪检测荧光信号。
9. 如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述双链核苷酸为基因组DNA或其片 断、质粒DNA或其片断或人工双链序列。
全文摘要
本发明提供了LE Green混合染料及其在双链核酸检测中的应用。本发明核酸染料是由LC Green和Eva Green与适当的稀释液配置而成。将双链核酸模板(基因组DNA，质粒DNA等)与合适浓度的荧光染料LE Green Mix混合，利用Modulus分光光度计、荧光酶标仪、实时定量PCR仪等荧光检测仪器对染料与纯化的双链核酸结合后所产生的荧光强度进行定量检测。本发明和传统的双链核酸紫外测定法相比更快速、准确、稳定。且较一般的双链核酸荧光测定方法特异性强，灵敏度高，能够快速对双链核酸如基因组DNA进行定量检测。
文档编号C12Q1/68GK101724295SQ20091024148
公开日2010年6月9日 申请日期2009年12月3日 优先权日2009年12月3日
发明者商颖, 张南, 白卫滨, 石慧, 罗云波, 许文涛, 黄昆仑 申请人:中国农业大学