一种用于检测I型和IV型马疱疹病毒的双重Eva Green实时荧光定量PCR检测试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测I型和IV型马疱疹病毒的双重Eva?Green实时荧光定量PCR检测试剂盒及其应用。本发明的试剂盒以Eva?Green作为荧光染料，同时还含有用于检测I型和IV型马疱疹病毒的双重反应液。利用获得的阳性克隆质粒和提取的病毒基因组DNA作为模板，对使用本发明的试剂盒的双重Eva?Green荧光定量PCR的敏感性，特异性等进行了评价。结果表明使用本发明的试剂盒对I型马疱疹病毒（EHV-1）和IV型马疱疹病毒（EHV-4）进行双重Eva?Green荧光定量PCR检测，具有快速、可靠、敏感性高等特点，并且可在单一反应中同时检测EHV-1和EHV-4，对隐性感染马具有较高的阳性检出率，可实现对马鼻肺炎的早期诊断与防治。
【专利说明】—种用于检测丨型和j V型马疱痠病毒的双重Eva Green实时荧光定量PCR检测试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于检测I型和IV型马疱疹病毒的PCR检测试剂盒及其应用，尤其涉及一种用于检测I型和IV型马疱疹病毒的双重Eva Green实时荧光定量PCR检测试剂盒及其应用，属于病毒的诊断及检测领域。
【背景技术】
[0002]马鼻肺炎(Equine rhinopneumonitis, ER)是由马鼻肺炎病毒(ERV)引起的马属动物的一种以发热和出现呼吸道卡他为特征的高度接触性传染病。国际兽疫局(OIE)把马鼻肺炎列为B类疾病，被《国际动物卫生法典》(1999)列入法定报告疾病名录。我国农业部把它列为三类动物疫病，国家质量监督检验检疫局与其他国家签订的检疫条款中也将其列为出入境马属动物检验检疫的疫病之一。马鼻肺炎于20世纪30年代初发现与美国，后在亚洲和欧洲一些国家均有报道，目前本病在世界各地广泛发生，马鼻肺炎已发现于40多个国家或地区，给世界养马业带来很大危害。
[0003]根据致病性的不同将马鼻肺炎病毒分为马疱疫病毒I型(Equineherpesvirus-1, EHV-1)和 IV 型(Equine herpesvirus-4, EHV-4)。EHV-1 又称马流产病毒(Equine abortion virus),主要引起母马流产，EHV-4又称呼吸道感染病毒(Respiratoryinfection virus),引起幼驹鼻肺炎,很少发生流产。从致病性上看，区分EHV-1、EHV-4型是十分必要的。
[0004]病毒中和试验为国际贸易替代诊断方法，补体结合试验为常用的血清抗体调查和回顾性诊断方法，由于 者之间存在严重的血清交叉反应，目前我国还没有从血清学角度区分EHV-1、EHV-4型马疱疹病毒的标准方法。聚合酶联反应(PCR)以其敏感、特异、快速、操作简便、高通量等特点成为了备受关注的检测技术。国内外的研究学者建立了各种普通PCR, SYBR Green荧光定量PCR、TaqMan荧光定量PCR方法检测EHV-1和EHV-4，但都无法达到即快速检测，同时又能够保证结果准确可靠的目的。
[0005]本发明使用了一种最新型的荧光染料Eva Green，该荧光染料具有对PCR的抑制性远小于SYBR Green 1、扩增信号更强、可消除“染料重分布”的缺陷、可用于高分辨率溶解曲线分析、稳定性极强等特性，可以大大提高扩增反应的稳定性、可靠性和敏感性。EvaGreen的试剂成本也低于SYBR Green I，具有广泛普遍应用的价值。本文所建立的EHV-1/4双重Eva Green real_timePCR具有良好的特异性，敏感性也高于以往国内外发表文章中的最低检出限，利用溶解曲线峰的Tm值鉴定EHV-1/4混合感染重复性良好。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题之一是建立一种用于检测I型马疱疹病毒(EHV-1)和IV型马抱疫病毒(EHV-4)的双重Eva Green实时突光定量PCR(Eva Green real-time PCR)检测方法。[0007]本发明所要解决的技术问题之二是提供一种用于检测I型和IV型马疱疹病毒的双重Eva Green实时荧光定量PCR (Eva Green real-time PCR)检测引物组及含有该引物组的试剂盒。
[0008]为了达到上述目的，本发明采用了以及技术手段:
[0009]本发明发明人根据GenBank上发表的所有EHV-1和EHV-4毒株的序列，应用序列分析软件设计血清型特异性引物，在此基础上根据多年研究经验的积累，并结合实际的实验验证，对设计得到的引物序列进行进一步的优化，最终得到了分别用于I型和IV型马疱疹病毒检测的引物组，同时通过对Eva Green荧光定量PCR的扩增条件和引物浓度进行优化，获得较好的特异性和扩增效率。
[0010]本发明的一种用于同时检测I型和IV型马疱疹病毒的引物组，其特征在于含有用于检测马疱疹病毒I型的引物对以及用于检测马疱疹病毒IV型的引物对，其中，用于检测马疱疹病毒I型的引物对的核苷酸序列如SEQ ID N0.1及SEQ ID N0.2所示，用于检测马疱疹病毒IV型的引物对的核苷酸序列如SEQ ID N0.3及SEQ ID N0.4所示。
[0011]利用获得的阳性克隆质粒和提取的病毒基因组DNA作为模板，对本发明所建立的单重或双重Eva Green荧光定量PCR的敏感性进行了评价。通过分析检测结果的溶解峰，评价了双重Eva Green荧光定量PCR方法的重复性。并应用所建立的单重和双重定量分析方法检测了 11份无特征性临床表现的马的鼻拭子和2份无临床表现的驴的鼻拭子样本。结果表明:单重和双重荧光定量分析方法对EHV-1或/和EHV-4的检测均具有较好的特异性，敏感性均为50个拷贝/ul的EHV-1和5个拷贝/ul的EHV-4阳性克隆质粒，0.15pg/ul的EHV-1和0.0025pg/ul的EHV-4基因组DNA。EHV-1和EHV-4两个血清型之间没有交叉反应，NCBI BLAST分析特异性引物均有良好的特异性。该方法利用溶解曲线鉴定EHV-1/4的重复性良好，组内和组间实验Tm值的标准偏差均低于0.6%，实验数据稳定、可靠。
[0012]应用该方法检测临床鼻拭子样本，单重定量分析EHV-1的阳性检出率为53.8%(7/13)，EHV-4的阳性检出率为76.9%(10/13);双重定量分析EHV-1的阳性检出率为46.2%(6/13)，EHV-4的阳性检出率仍为76.9% (10/13);单重与双重定量分析的符合率分别为92.3% (EHV-1，12/13)和 100% (EHV-4，13/13)。阳性样本的 Eva Green 荧光定量 PCR 产物经测序分析，均与目的基因一致，进一步验证该方法具有较好的特异性。
[0013]在上述研究的基础上，本发明还提出了一种用于检测I型和IV型马疱疹病毒的双重Eva Green实时荧光定量PCR检测试剂盒。
[0014]本发明的一种用于检测I型和IV型马疱疹病毒的双重Eva Green实时荧光定量PCR检测试剂盒，含有Eva Green作为荧光染料，其特征在于所述的试剂盒中还含有用于检测I型和IV型马疱疹病毒的双重反应液，其中所述的双重反应液中含有用于检测马疱疹病毒I型的引物对以及用于检测马疱疹病毒IV型的引物对，用于检测马疱疹病毒I型的引物对的核苷酸序列如SEQ ID N0.1及SEQ ID N0.2所示，用于检测马疱疹病毒IV型的引物对的核苷酸序列如SEQ ID N0.3及SEQ ID N0.4所示。
[0015]在本发明中，优选的，所述的双重反应液中各引物的浓度分别为50nM-250nM。
[0016]更优选的，所述的双重反应液中各引物的浓度分别为50nM。
[0017]在本发明中，优选的，用于检测I型和IV型马疱疹病毒的PCR反应条件为:95°C下变性3分钟，然后在95°C下复性25秒，58°C退火延伸30秒，共进行40个循环。[0018]进一步的，本发明还提出了所述的试剂盒及引物组在制备用于同时检测I型和IV型马疱疹病毒的试剂中的应用。
[0019]本发明建立了一种快速、可靠、高敏感性的双重Eva Green荧光定量PCR检测方法及试剂盒，可在单一反应中同时检测EHV-1和EHV-4，对隐性感染马具有较高的阳性检出率，可实现对马鼻肺炎的早期诊断与防治。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为单重Eva Green real-time PCR的特异性检测结果；
[0021]图1A为使用单重Eva Green real-time PCR对EHV-1进行扩增的扩增曲线及对应的溶解曲线；图1B为使用单重Eva Green real-time PCR对EHV-4进行扩增的扩增曲线及对应的溶解曲线；
[0022]图2为双重Eva Green real-time PCR的特异性检测结果；
[0023]图3为双重Eva Green real-time PCR混合引物浓度的优化；
[0024]图4为EHV-1 (A)和EHV-4 (B)的标准曲线和对应的溶解曲线；
[0025]图5为Eva Green real-time PCR检测阳性克隆质粒的敏感性检测结果；
[0026]图5A为单重Eva Green real-time PCR检测EHV-1或EHV-4阳性克隆质粒的敏感性；图5B为双重Eva Green real-time PCR检测EHV-1或EHV-4阳性克隆质粒的敏感性；图5C为双重Eva Green real-time PCR检测EHV-1和EHV-4阳性克隆质粒混合物的敏感性；
`[0027]图6为Eva Green real-time PCR检测基因组DNA的敏感性检测结果；
[0028]图6A 为单重 Eva Green real-time PCR 检测 EHV-1 或 EHV-4 基因组 DNA 的敏感性；图6B为双重Eva Green real-time PCR检测EHV-1或EHV-4基因组DNA的敏感性；图6C为双重Eva Green real-time PCR检测EHV-1和EHV-4基因组DNA混合物的敏感性。
【具体实施方式】
[0029]下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0030]实施例1双重Eva Green实时荧光定量PCR检测方法的建立及在检测I型和IV型马疱疹病毒中的应用
[0031]1、材料与方法
[0032]1.1 材料
[0033]1.1.1病毒参考株马疱疹病毒I型(EHV-1)病毒株(ATCC438/77)、马疱疹病毒IV型(EHV-4)病毒株(ATCC405/76)。RK13细胞为中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室马病研究室保存。
[0034]1.1.2临床样本2013年采集11匹无特征性临床表现的马的鼻拭子和2匹无临床表现的驴的鼻拭子。
[0035]1.1.3 主要试剂和仪器 Viral DNA Kit (Omega 公司)；2X SsoFastTM EvaGreensupermix (Bio-Rad 公司)；突光定量 PCR 八连管(Axygen 公司)。Sratagene Mx3005P 突光定量PCR仪(Sratagene公司)。
[0036]1.1.4引物设计与合成从GenBank上下载所有发表的EHV-1和EHV-4核苷酸序列。利用SeqMan、MagAlign对序列进行比对和分析；利用Primer Premier5.0 (PrimerBiosoft international, palo Alto, CA, USA)软件设计 EHV-1 或 EHV-4 型特异性引物用于Eva Green荧光定量PCR的检测。
[0037]其中用于检测马疱疹病毒I型的引物序列如SEQ ID N0.1 (EHV-1.F，上游)及SEQ ID N0.2所示(EHV-1.R，下游)，用于检测马疱疹病毒IV型的引物序列如SEQ ID N0.3(EHV-4.F，上游)及 SEQ ID N0.4 所示(EHV-4.R，下游)。
[0038]1.2 方法
[0039]1.2.1病毒的繁殖和DNA的提取在长成单层的RK13细胞融合度达到90%以上时，接种 50ul 的 EHV-1 (ATCC438/77)、EHV-4 (ATCC405/76)病毒液，置于 37°C CO2 培养箱中培养，待细胞病变(CPE)达到85%以上时收毒，分装后冻存于_80°C冰箱中。
[0040]取250ul收取的病毒上清液，按Viral DNA Kit说明书提取病毒DNA，DNA洗脱于50ul 的 Elution buffer 中。应用 NanoDrop2000 紫外分光光度计(Thermo Fisher 公司)测定病毒DNA的浓度。分装后冻存于_80°C冰箱中用于后续的实验。
[0041]1.2.2 单重 Eva Green real-time PCR 单重 Eva Green real-time PCR 反应体系为:10ul2X SsoFastTM EvaGreen supermix、250nM EHV-1 或 EHV-4 上、下游引物的混合物和2ul的模板DNA，然后加RNase-free水补足至20ul。扩增反应在STRATEGENM3005pReal time PCR仪上进行。经优化、筛选的反应条件为:95°C 3min，然后95°C 25sec、58°C退火30sec共进行40个循环。溶解`曲线分析采用95°C 15sec、60°C 20sec和95°C 15sec。每个模板至少做2个重复，并设阴性对照(NTC)。用MxPio软件分析扩增结果，采用软件自动分析程序获得阈值(threshold)和阈值循环数(Ct)，分析EHV-1和EHV-4的溶解曲线是否可产生特异性的溶解峰。
[0042]1.2.3 双重 Eva Green real-time PCR 反应双重 Eva Green real-time PCR 反应体系含有EHV-1和EHV-4特异性引物的混合物，模板为EHV-1和EHV-4基因组DNA的混合物，其他成分和浓度均与单重反应的一致。为了提高双重荧光定量PCR检测的特异性，首先优化反应体系，以同时获得两个特异性的熔解峰。选择不同浓度范围的EHV-1和EHV-4上游、下游引物的等摩尔混合物，各引物浓度为250nM、200nM、150nM、IOOnM或50nM，表1所示，分别对同一模板DNA进行定量分析，每个稀释度做3个重复，并设阴性对照。用MxPro软件分析溶解曲线。反应条件为:95°C 3min，然后95°C 25sec、58°C退火30sec共进行40个循环。溶解曲线分析采用95°C 15sec、60°C 20sec和95°C 15sec。
[0043]表1引物浓度优化
[0044]
【权利要求】
1.一种用于检测I型和IV型马疱疹病毒的双重Eva Green实时荧光定量PCR检测试剂盒，含有Eva Green作为荧光染料，其特征在于所述的试剂盒中还含有用于检测I型和IV型马疱疹病毒的双重反应液，其中所述的双重反应液中含有用于检测马疱疹病毒I型的引物对以及用于检测马疱疹病毒IV型的引物对，用于检测马疱疹病毒I型的引物对的核苷酸序列如SEQ ID N0.1及SEQ ID N0.2所示，用于检测马疱疹病毒IV型的引物对的核苷酸序列如 SEQ ID N0.3 及 SEQ ID N0.4 所示。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的双重反应液中各引物的浓度分别为50nM-250nMo
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的双重反应液中各引物的浓度分别为50nMo
4.如权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于用于检测I型和IV型马疱疹病毒的PCR反应条件为:95°C下变性3分钟，然后在95°C下复性25秒，58°C退火延伸30秒，共进行40个循环。
5.权利要求1-4任一项所述的试剂盒在制备用于同时检测I型和IV型马疱疫病毒的试剂中的应用。
6.一种用于同时检测I型和IV型马疱疹病毒的引物组，其特征在于含有用于检测马疱疹病毒I型的引物对以及用于检测马疱疹病毒IV型的引物对，其中，用于检测马疱疹病毒I型的引物对的核苷酸序列如SEQ ID N0.1及SEQ ID N0.2所示，用于检测马疱疹病毒IV型的引物对的核苷酸序列如SEQ ID N0.3及SEQ ID N0.4所示。
7.权利要求6所述的引物组在制备用于同时检测I型和IV型马疱疹病毒的试剂中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK103805717SQ201410042034
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年1月28日 优先权日:2014年1月28日
【发明者】王晓钧, 胡哲 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所