鼠灰链霉菌amp脱氨酶基因的毕赤酵母真核表达方法
【专利摘要】本发明公开一种鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的毕赤酵母真核表达方法。该方法以鼠灰链霉菌基因组为模板，设计特异性引物扩增AMP脱氨酶基因序列，在其两端加入酶切位点和组氨酸标签，并亚克隆至组成型表达载体pGAP9K以构建重组质粒，酶切线性化后电转化毕赤酵母，筛选阳性克隆转化子，接种至发酵培养基进行液体发酵培养，取发酵液上清，即得AMP脱氨酶表达产物。本发明首次在毕赤酵母中成功表达了鼠灰链霉菌来源的AMP脱氨酶，实验结显示该重组酶具有较高的酶活，且酶活性稳定，易于纯化，可应用于食品、医药等领域，为AMP脱氨酶的工业化生产奠定了基础。
【专利说明】鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的毕赤酵母真核表达方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及AMP脱氨酶基因的真核表达，具体涉及一种鼠灰链霉菌来源的AMP脱氨酶基因的真核表达方法及其表达产物的应用，属于分子生物学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]AMP脱氨酶,英文名为AMP deaminase,简写为AMPD,是一种氨基水解酶,其可催化AMP使其脱去氨基生成肌苷酸(MP)和NH3, MP在食品以及制药等领域中有重要应用。另外，AMP脱氨酶是嘌呤核苷酸代谢循环中的三种主要酶类之一，对于维持机体免疫力和腺苷酸能荷具有重要作用。因此，AMP脱氨酶是工业生产中一种重要的酶。
[0003]AMP脱氨酶广泛存在于各种生物体内。其最早由鼠骨骼肌制备，随后又由人红血细胞制备，目前工业化生产中通常由酵母、霉菌等微生物发酵产AMP脱氨酶，但是在酶的提取纯化、酶活性以及稳定性等方面存在诸多问题。因此，利用DNA重组技术，将微生物来源的AMP脱氨酶基因在特定宿主中进行重组表达，可以有效改善上述问题。现在国内关于AMP脱氨酶基因重组表达的研究从未报道过，国外关于该酶的重组表达的研究较少，仅在申请号为CN200580013789.3的专利“放线菌来源的AMP脱氨酶及其应用”( 申请人::天野酶株式会社)中报道过一次。
【发明内容】
[0004]针对现有技术存在的不足，本 申请人:经过研究改进，提供一种鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的真核表达方法。本发明首次在毕赤酵母中成功表达了鼠灰链霉菌来源的AMP脱氨酶，实验结显示该重组酶具有较高的酶活，且酶活性稳定。
[0005]本发明的技术方案如下:
[0006]鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的毕赤酵母真核表达方法，其特征在于:以鼠灰链霉菌基因组为模板，设计特异性引物扩增AMP脱氨酶基因序列，在其两端加入酶切位点和组氨酸标签，并亚克隆至组成型表达载体PGAP9K以构建重组质粒，酶切线性化后电转化毕赤酵母，筛选阳性克隆转化子，接种至发酵培养基进行液体发酵培养，取发酵液上清，即得AMP脱氨酶表达产物。
[0007]具体地，所述方法步骤如下:
[0008]( 1)鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的克隆
[0009]以鼠灰链霉菌基因组为模板，以序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID Ν0:2的引物对通过PCR特异性扩增AMP脱氨酶基因，在其两端均加入EcoRI酶切位点和组氨酸标签，纯化回收PCR产物；
[0010](2)重组表达载体的构建
[0011 ] 将组成型表达载体pGAP9K和步骤(1)所得PCR产物分别用EcoRI酶切纯化，连接所得酶切产物并转化Ε.coli JM109，筛选阳性克隆菌株；
[0012](3)线性化重组质粒对毕赤酵母的电转以及阳性克隆转化子的筛选[0013]提取步骤(2)所得阳性克隆菌株质粒,经SacI线性化后电转化Pichia pastorisGS115，使用步骤(1)所述引物对筛选阳性克隆转化子；
[0014](4)重组菌的摇瓶发酵培养
[0015]将步骤(2)所得阳性克隆转化子接种至YPD培养基进行种子培养，取对数生长期24h的种子液以体积比3%的接种量接种至液体发酵培养基，于30°C、200r/min摇瓶发酵培养96h，取发酵液上清，即得AMP脱氨酶表达产物；所述液体发酵培养基成分如下:甘油2wt%，蛋白胨 2wt%、酵母膏 lwt%、KH2PO4 0.5wt%, MgSO4.7H20 0.05wt%, pH 值为 6.0。
[0016]优选地，步骤(1)所述鼠灰链霉菌选自鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)MCCCN0.1A01641。
[0017]本发明还提供了上述鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的毕赤酵母真核表达方法制备得到的AMP脱氨酶表达产物在食品及医药领域的应用。
[0018]本发明的有益技术效果在于:
[0019]本发明首次以鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因组为模板，通过重组表达载体PGAP9K-AMPD的构建、转化与阳性克隆转化子的筛选、重组菌瓶摇发酵培养条件(包括培养基碳源、氮源、种子液接种龄、接种量、培养基PH值、发酵时间)的精心优化和筛选，在毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)中成功表达了鼠灰链霉菌来源的AMP脱氨酶；试验结果显示:本发明制备的重组AMP脱氨酶表达产物具有较高的酶活，酶活性稳定，在培养基碳源添加量为2wt%、培养基pH为6.0，接种龄为24h，发酵时间96h的发酵条件下，重组菌GSl 15酶活可达到2230±60U/ml，且重组酶带组氨酸标签，易于纯化，可应用于食品、医药等领域，为AMP脱氨酶的工业化生产奠定了基础。`【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为实施例2重组表达质粒pGAP9K-AMPD酶切验证电泳图。
[0021]图2为实施例4不同碳源对GS115重组菌产酶影响的示意图。
[0022]图3为实施例4碳源添加量对GS115重组菌产酶影响的示意图。
[0023]图4为实施例4不同氮源对GS115重组菌产酶影响的示意图。
[0024]图5为实施例4接种龄对GS115重组菌产酶影响的示意图。
[0025]图6为实施例4接种量对GS115重组菌产酶影响的示意图。
[0026]图7为实施例4发酵培养基pH对GSl 15重组菌产酶影响的示意图。
[0027]图8为实施例4不同发酵时间对GS115重组菌产酶影响的示意图。
【具体实施方式】
[0028]以下结合附图，并通过实施例对本发明进行具体说明。
[0029]以下实施例所涉及实验材料如下:
[0030]菌株:鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)购自中国海洋微生物菌种保藏管理中心(MCCC)，保藏编号MCCC N0.1A01641,以下简称鼠灰链霉菌MCCC 1A01641 ；E.coliJM109购自大连宝生物工程有限公司；所述毕赤酵母Pichia pastoris GS115表达系统购自 Invitrogen 公司。
[0031 ] 所涉及其他试剂及试剂盒均为国产或进口商品。[0032]实施例1鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的克隆
[0033]以鼠灰链霉菌MCCC 1A01641基因组为模板，设计引物对AMPDF2/AMPDR2特异性扩增鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因，在其两端均加入EcoRI酶切位点(下划线表示)和组氨酸标签(双下划线表示)，引物对AMPDF2/AMPDR2序列如下:
[0034]AMPDF2:
[0035]5，-GCGGAATTC CATCATCATCATCATCAT GCGCCGCCGCCCCGGCAG-3，(SEQ IDNO:1)；
[0036]AMPDR2:
[0037]5，-GCCGAATTCTCA ATGATGATGATGATGATG CCCCCGGGCGTGCGCCC-3，(SEQID NO:2)；
[0038]用胶纯化试剂盒纯化所得PCR产物。
[0039]实施例2重组表达载体pGAP9K-AMPD的构建
[0040]将组成型表达载体pGAP9K和步骤(1)所得PCR产物分别用EcoRI酶切纯化，于16°C连接过夜，连接产物转化E.coli JM109，提取pGAP9K-AMPD-JM109菌株质粒，酶切验证，筛选出pGAP9K-AMPD-JM109阳性菌株。重组表达质粒pGAP9K_AMPD酶切验证电泳图如图1所示。
[0041]实施例3线性化重组质粒pGAP9K-AMPD对GS115的电转化以及转化子的筛选
`[0042]提取实施例2所得pGAP9K-AMPD-JM109阳性菌株质粒，经SacI线性化后电转化Pichia pastoris GSl 15,涂布MD平板,3~5天后挑取单菌落,通过蜗牛酶法提取重组质粒，使用实施例1所述特异性引物对AMPDF2/AMPDR2进行PCR验证，筛选得到阳性克隆转化子。将阳性克隆转化子接种至YPD培养基进行种子培养。
[0043]实施例4重组菌瓶摇发酵培养条件的优化
[0044]4.1考察不同碳源对重组菌产酶的影响
[0045]以2wt%蛋白胨为氮源，分别以2wt%甘油、乳糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉以及葡萄糖为碳源对重组菌进行摇瓶发酵，结果如图2所示。结果表明:各种碳源对重组菌的生长和酶活影响差别较大，其中以甘油为碳源时，不仅菌体量达到最高，而且AMP脱氨酶的酶活也最高；以葡萄糖作为碳源时，菌体量和酶活也较好，仅次于甘油；但分别以乳糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉为碳源时，不仅菌体生长不好，而且酶活很低，因此，选择甘油作为碳源。在以甘油为碳源时，继续考察甘油的添加量对重组菌生长和产酶的影响。分别配制含有0.5wt%、lwt%、2wt%、3wt%、4wt%、5wt%甘油的发酵培养基，对重组菌进行摇瓶培养，72h后取样测菌体浓度和酶活，如图3所示。结果表明，当甘油浓度< 20g/L时，菌体浓度和酶活随着甘油浓度的增加而不断上升；当甘油浓度>20g/L时，随着甘油浓度的不断上升菌体量不再增加，而酶活在逐渐降低，这可能是由于过高的甘油浓度对重组酶的表达有抑制作用。因此，选择2被％的甘油为碳源。
[0046]4.2考察不同氮源对重组菌产酶的影响
[0047]以2wt%甘油为碳源，分别以2wt%(NH4)2SO4 (A)、KNO3 (B)、麸皮(C)、棉籽粉(D)、玉米浆(E)、蛋白胨(F)、酵母膏(H)、牛肉膏(I)单一氮源以及蛋白胨+酵母膏(2:1) (J)、蛋白胨+牛肉膏(2:1) (K)复合氮源为氮源进行摇瓶发酵，72h后测菌体浓度和酶活，结果如图4所示。结果表明:无机氮源产酶能力较低且菌体生长相对较差；有机氮源更有利于促进产酶且有利于菌体的生长，其中，以蛋白胨+酵母膏(2:1)为氮源时酶活最大。因此，选取蛋白胨+酵母膏(2:1)作为氮源。
[0048]4.3考察接种龄对重组菌产酶的影响
[0049]分别取处于对数生长期12、16、20、24、28、32、36h的种子液以2%接种量转接至50ml发酵培养基(甘油2wt%，蛋白胨2wt%，酵母膏lwt%，KH2PO4 0.5wt%, MgSO4.7Η20
0.05wt%, pH 6.0。)中，摇瓶培养72h后，取样测菌体浓度和酶活，结果如图5所示。结果表明:对数期内，菌体浓度随着菌龄的增大而增加，而酶活在对数期20h达到最大，之后逐渐降低。因此，最适接种龄为20h。
[0050]4.4考察接种量对重组菌产酶的影响
[0051]将种龄为20h的种子液分别以体积比1%、2%、3%、4%、5%的接种量接到50ml
发酵培养基(同上)中，72h后取样测菌体浓度和酶活，结果如图6所示。结果显示:在1%~5%范围内，重组菌的菌体浓度与接种量成正相关。酶活测定结果显示在接种量为3%时酶活最大，高于或低于3%接种量时酶活均有所降低。因此，最佳接种量为3%。
[0052]4.5考察培养基pH对重组菌产酶的影响
[0053]配制pH 值分别为 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 的 50ml 发
酵培养基(同上)，按20h种龄、体积比3%接种量接入种子液，72h后测菌体浓度和酶活，结果如图7所示。结果显示:pH值为4.0~6.0时菌体量逐渐增大，pH值为6.0-7.5时菌体量变化不大；pH值为4.0时没有酶活，pH为6.0时重组酶活性最大，当pH大于6.0时，随着pH值增大酶活逐渐降低。因此,培养基最适pH确定为6.0。
[0054]4.6考察发酵时间对重组菌产酶的影响
[0055]配制pH值为6.0的50ml发酵培养基(同上)，按20h种龄、3%接种量接入种子液，30°C、200r/min 摇瓶培养，分别培养 48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h 后，取样测酶活，结果如图8所示。结果显示:培养96h时重组酶活性最大。
[0056]实施例5正交试验
[0057]根据正交设计原理以及实施例4发酵培养条件单因素试验结果，设计了四因素三水平正交试验方案，正交试验因素参见表1。
[0058]表1正交试验因素表
[0059]
【权利要求】
1.鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的毕赤酵母真核表达方法，其特征在于:以鼠灰链霉菌基因组为模板，设计特异性引物扩增AMP脱氨酶基因序列，在其两端加入酶切位点和组氨酸标签，并亚克隆至组成型表达载体PGAP9K以构建重组质粒，酶切线性化后电转化毕赤酵母，筛选阳性克隆转化子，接种至发酵培养基进行液体发酵培养，取发酵液上清，即得AMP脱氨酶表达产物。
2.根据权利要求1所述鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的毕赤酵母真核表达方法，其特征在于具体步骤如下: (1)鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的克隆 以鼠灰链霉菌基因组为模板，以序列为SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 2的引物对通过PCR特异性扩增AMP脱氨酶基因，在其两端均加入EcoRI酶切位点和组氨酸标签，纯化回收PCR产物； (2)重组表达载体的构建 将组成型表达载体PGAP9K和步骤(1)所得PCR产物分别用EcoRI酶切纯化，连接所得酶切产物并转化E.coli JM109，筛选阳性克隆菌株； (3)线性化重组质粒对毕赤酵母的电转化以及阳性克隆转化子的筛选 提取步骤(2)所得阳性克隆菌株质粒，经SacI线性化后电转化Pichia pastorisGS115，使用步骤(1)所述引物对筛选阳性克隆转化子； (4)重组菌的摇瓶发酵培养 将步骤(2)所得阳性 克隆转化子接种至YPD培养基进行种子培养，取对数生长期24h的种子液以体积比3%的接种量接种至液体发酵培养基，于30°C、200r/min摇瓶发酵培养96h，取发酵液上清，即得AMP脱氨酶表达产物；所述液体发酵培养基成分如下:甘油2wt%，蛋白胨 2wt%、酵母膏 lwt%、KH2PO40.5wt%, MgSO4.7H20 0.05wt%, pH 值为 6.0。
3.根据权利要求2所述鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的毕赤酵母真核表达方法，其特征在于:步骤(1)所述鼠灰链霉菌选自鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus) MCCCN0.1A01641。
4.权利要求1~3任一项所述鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的毕赤酵母真核表达方法制备得到的AMP脱氨酶表达产物在食品及医药领域的应用。
【文档编号】C12R1/84GK103805629SQ201410042060
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年1月28日 优先权日:2014年1月28日
【发明者】张梁, 石贵阳, 方炜, 丁重阳, 顾正华 申请人:江南大学