富勒烯作为调节微生物生长或代谢的调节剂的用途

富勒烯作为调节微生物生长或代谢的调节剂的用途
【专利摘要】本发明公开了一种富勒烯作为调节微生物生长或代谢的调节剂的用途；本发明通过对富勒烯生物学效应的研究，确定了富勒烯具有调节微生物生长和代谢的作用，发现了富勒烯材料的新用途，将推动富勒烯在微生物及其相关领域的应用；本发明发现富勒烯能够实现如下具体的用途：1、抑制致病菌或有害菌的生长；2、促进功能菌的生长与代谢活性、提高胞内总蛋白量的表达；3、调节微生物群落结构，从而改善群落的功能；4、提高土壤肥力；5、改善发酵产品的理化性质和风味；6、促进污水处理等环境修复的效率。
【专利说明】富勒烯作为调节微生物生长或代谢的调节剂的用途
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物【技术领域】，具体涉及一种富勒烯作为调节微生物生长或代谢的调节剂的用途。
【背景技术】
[0002]纳米材料是指三维空间中一维及以上具备纳米级标准尺度，或由纳米级的颗粒物质为单元构成的天然或人造材料的总称。纳米材料按材料的组成又可以化分为金属纳米材料和非金属纳米材料。其中碳纳米材料是一类研究和应用较为广泛的非金属纳米材料。富勒烯作为一种典型的碳纳米材料，在实际中有较为广泛的应用。
[0003]富勒烯(Fullerene)是一种完全由碳组成的中空分子，形状呈球型、椭球型、柱型或管状。已发现有 C44、C50、C60、C76、C80、C84、C90、C94、C120、C180、C540 等纯碳组成的分子，它们均属于富勒烯概念下的物质，其中C6tl的度丰约为50%。因为C6tl是富勒烯家庭中相对最容易得到、最容易提纯和最廉价的一类，因此C6tl及其衍生物是被研究和应用最多的富勒烯。由于特殊的结构和性质，C60在超导、磁性、光学、催化、材料及生物等方面表现出优异的性能，得到广泛的应用。富勒烯的超强的润滑效果使其被制成润滑剂；富勒烯也可以作为药物载体，对药物起到一种缓释的作用；含有金属离子的富勒烯还能作为超导体，对于本领域技术人员而言，富勒烯是本领域内公知的技术术语；上述富勒烯的应用都是利用了碳纳米材料的理化性质。
[0004]微生物是包括细 菌、病毒、真菌以及小型原生动物、显微藻类等在内的一大类生物群体。微生物的生长代谢和人类生活密切相关。一方面，一些微生物可致病，能够造成食品、布匹、皮革等发霉腐烂。在微生物引起的疾病方面，大量的广谱抗生素的滥用已经造成了耐药性的产生，因此，寻找新的控制微生物生长的方法迫切成为人们的需要。另一方面，一些微生物被广泛应用于工业发酵，生产乙醇、食品及各种酶制剂等，部分微生物能够降解塑料、处理废水废气等对环境修复工作。
[0005]与此同时，人们也不断寻找新的方法调控这些功能菌的生长和代谢使其以更高的效率执行这些功能。近几年，富勒烯的很多生物学功能被人们发现，这些作用包括，神经保护，抗癌细胞，抗病毒，抑制蛋白酶的活性，光切割DNA等。也有报道富勒烯对微生物的作用，这种作用主要表现为对细菌的抑制作用，但是这种抑制作用与抗生素等高效细菌抑制剂相比效果较差，因此，并无实际应用。
[0006]部分研究公开了富勒烯并不抑制细菌的生长报道，研究表明富勒烯可改变发酵产物的形成。然而，这些研究都没有报道富勒烯对混合微生物或纯种微生物发酵的有益调节作用。即没有公开碳纳米材料富勒烯在调节混合微生物群落的群落结构与功能，以及调节微生物的生长及其代谢活动的新用途及其使用方法。

【发明内容】

[0007]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种富勒烯作为调节微生物生长或代谢的调节剂的用途。
[0008]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0009]本发明涉及一种碳纳米材料富勒烯作为调节微生物生长或代谢的调节剂的用途。
[0010]优选地，所述调节具体为调节微生物的生长能力。
[0011]优选地，所述调节具体为调节微生物的代谢活性。
[0012]优选地，所述调节具体为抑制细菌的生长。
[0013]优选地，所述调节具体为促进细菌的生长和促进细菌的代谢活动。
[0014]优选地，所述调节具体为调节混合微生物菌群的细菌群落结构，抑制部分细菌生长，同时能够促进另外部分细菌的生长。
[0015]优选地，所述调节具体为调节微生物菌群结构，进而调整菌群功能，提高利用菌群进行工农业生产的生产效率。
[0016]优选地，所述调节具体为促进细菌的反硝化活性。
[0017]优选地，所述调节具体为促进细菌降解有机物的能力。
[0018]优选地，所述调节具体为调节微生物菌群结构，进而促进微生物的生长和活性，促进利用微生物进行污染物的环境修复。
[0019]优选地，所述富勒烯具有由碳原子构成的中空的多面体结构。
[0020]优选地，所述用途具体为，制备富勒烯的胶体溶液，之后将所述胶体溶液添加到微生物的生长环境中，进而实现调节微生物生长或代谢的目的。
[0021]优选地，所述富勒烯的胶体溶液中，富勒烯分子聚集体的粒径为20~550纳米。
[0022]与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果:
[0023]本发明通过对富勒烯生物学效应的研究，确定了富勒烯具有调节微生物生长和代谢的作用，发现了富勒烯材料的新用途，将推动富勒烯在微生物及其相关领域的应用；本发明发现富勒烯能够实现如下具体的用途:1、抑制致病菌或有害菌的生长；2、促进功能菌的生长和代谢、提高胞内总蛋白量的表达；3、调节微生物群落结构，从而改善群落的功能；4、提高土壤肥力；5、改善发酵产品的理化性质和风味；6、促进污水处理等环境修复的效率。
【专利附图】

【附图说明】
[0024]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
[0025]图1:富勒烯胶体溶液纳米颗粒物的透射电镜(TEM)照片。
[0026]图2:富勒烯胶体溶液粒径分布及其与动态光散射强度。
[0027]图3:富勒烯(nC6(l)对大肠杆菌(E.coli)的生长曲线的影响，富勒烯可抑制E.coli的生长。
[0028]图4:富勒烯(nC6Q)对腊样芽胞杆菌(Bacillus cereus)的生长的影响，富勒烯可促进Bacillus cereus的生长。
[0029]图5:富勒烯(nC6Q)的浓度对腊样芽胞杆菌(Bacillus cereus)的生长促进效果的影响。富勒烯对Bac illus cereus的生长促进作用的发挥有其最适浓度范围:3mg/L~9mg/L。
[0030]图6:pH值对富勒烯(nC6Q)促进腊样芽胞杆菌(Bacillus cereus)效果的影响(a)pH=6; (b)pH=7; (c)pH=8。富勒烯中性和偏酸性的条件下能显著促进腊样芽胞杆菌(Bacillus cereus)的生长。
[0031]图7:异抗坏血酸钠和富勒烯(nC6(l)联合作用效果。异抗坏血酸钠能帮助富勒烯促进Bacillus cereus生长作用的发挥。
[0032]图8:富勒烯(nC6(l)对细菌胞内总蛋白的影响。富勒烯显著提高了蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)的总蛋白量。
[0033]图9:富勒烯(nC6Q)对腊样芽胞杆菌(Bacillus cereus)反硝化能力的影响(a)硝酸盐的去除率(b)亚硝酸盐的积累量。富勒烯促进了 Bacillus cereus的反硝化能力，表现在对硝酸盐去除率的增加和对亚硝酸盐积累量的减少。
[0034]图10:富勒烯(nC6(l)对短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)生长的影响。富勒烯可促进 Bacillus pumilus 的生长。
[0035]图11:富勒烯(nC6Q)对食酸代尔夫特菌(Delftia tsuruhatensis)生长的影响。富勒烯可促进Delftia tsuruhatensis的生长。
[0036]图12:富勒烯(nC6(l)对菌群结构的调节作用(a)有氧条件且pH为6.5(b)无氧条件且pH为6.5 (c)有氧条件且pH为7.5 (d)无氧条件且pH为7.5。
【具体实施方式】
[0037]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0038]对于本领域的技术人员而言，通过本发明记载的实施例，很显然可知本发明的方法能够适用于本领域的诸多微生物或各类由微生物组成的群落，而不限于本发明实施记载的微生物。当然，本发明的方法很显然地适用于与实施例记载微生物相类似的微生物，富勒烯可以促进的微生物包括:芽孢杆菌属(Bacillus)、代尔夫特菌属(Delftia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、气单胞菌属(Aeromonas)、无色杆菌属(Achromobacter)、产喊杆菌属(Alcaligenes)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、棒杆菌属(Coryhebacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、微球菌属(Micrococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、诺卡氏菌属(Nocardia)链霉菌属(Streptomyces)、节细菌属(Arthrobacter)、布鲁氏菌属(Brucella)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、红球菌属(Rhodococcus)、微杆菌属(Microbacterium)、陶厄氏菌属(Thauera)、丛毛单胞菌(Comamonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、短杆菌属(Curtobacterium)、亚硝酸球菌属(Nitrosoccus)、红螺菌属(Rhodospirillum)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、动胶菌属(Zoogloea)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、亚硝化螺菌属(Nitrosospira)、硝化螺菌属(Nitrospira)硝化菌属(Nitrobacter);富勒烯可以抑制的微生物包括:沙門氏菌属(Salmonella)、志賀菌属(Shigella)、大肠埃希氏菌属(Escherichia)、弧菌属(Vibrio)等属的细菌。
[0039]实施例1
[0040]本实施例涉及碳纳米材料富勒烯水溶液的制备。[0041]试剂和仪器:纯度为99.9%的富勒烯粉末(Mer Corporation，美国)，色谱纯甲苯(Merck KGaA，德国)，超纯水系统(美国Millipore纯水装置，Milli Q)，旋转蒸发仪(瑞士Buchi, Buchi RotavaporX
[0042]方法:称取40mg的富勒烯(C6tl)粉末溶于IOOmL的甲苯中，将容器置于摇床上震荡溶解2小时，待富勒烯完全溶入甲苯中，再加入400mL的去离子水。甲苯的密度小于水，浮在上层颜色呈紫红色。用封口膜将瓶口封紧以防止甲苯挥发。将容器置于超声波清洗仪上超声96小时，甲苯中的富勒烯通过超声形成的空穴转移进入水相中。超声结束后用旋转蒸发仪除去混合溶液中的甲苯，余下的富勒烯的水溶液通过0.22 μ m的滤膜，除去残余的饱和析出的富勒烯固体粉末，即可得到碳纳米材料富勒烯水溶液。
[0043]结果:如图1所示，富勒烯纳米颗粒物的粒径分布不均一且形状各异。利用纳米粒度分析仪(美国Beckman Coulter, Delsa Nano)对制备的富勒烯溶液的颗粒的粒径测定结果如图2所示,粒径分布图谱显示粒径分布范围在20纳米到550纳米之间，在约220nm处出现了一个峰值，制备出的C6tl纳米颗粒物分布在这一尺寸左右的相对较多。
[0044]实施例2
[0045]本实施例涉及碳纳米材料富勒烯对大肠杆菌(E.coli)的生长抑制作用。
[0046]试剂和仪器:MinimalDavis (MD)培养基(IL) -J.0g K2HP04,3.0g KH2P04,1.0g(NH4)2S04，0.5g 三水合柠檬酸钠，0.1g MgS04.7Η20，0.02g 精氨酸，0.02g 色氨酸，2g葡萄糖。lmg/L nC60, 5mg/L nC6(l,全自动微生物生长曲线测定仪(芬兰Bioscreen C, MBR),配套多孔板。
[0047]方法:按1%接种量将对数期的E.coli接种到1000 μ L含lmg/L和5mg/L的MD培养基中，体系做好标记，以方便点样。涡旋振荡充分混匀后，将每个样品接种的微体系转移到微孔板，每个加样口 300 μ L,每个样品设三个重复。Bioscreen全自动生长曲线测定仪自检结束后，将点样完毕的多孔板置于仪器中多孔板架。打开程序设置软件，设定培养温度37°C，并伴随中等强度的连续振荡，培养时间设为96小时，每隔I小时测定OD值。测量的数据自动保存到一个包含所有OD值数据的Excel表格中。利用绘图软件0rigin8.0，绘制不同条件下E.coli的生长曲线。
[0048]结果:E.coli的生长速率相对较快，在培养的20小时以内，加入富勒烯的实验组和不加富勒烯的对照组的E.coli均达到了平台期。如图3所示，E.coli在不加nC6(l的对照组中对数期持续的时间较长，在培养的20小时达到平台期，且平台期的生物量要高于加入不同浓度nC6(l的实验组。加入5mg/L的nC6(l的实验组中，E.coli在培养10小时后到达平台期，且平台期的生物量远小于对照组。lmg/L nC60组中，E.coli培养约12小时达到平台期。lmg/L组平台期的生物量和对照相比有较大程度的降低，但高于5mg/L组平台的生物量。E.coli生长曲线结果表明nC6(l的对其生长有明显的抑制作用。具体表现在，一方面nC6(l的加入减少了 E.coli的对数期持续时间，使其提前到达平台期，另一方面加入nC6(l之后E.coli平台期的生物量要远远低于对照组。5mg/L的nC6(l相比lmg/L更能显著抑制E.coli的生长。这表明nC6(l对E.coli的生长抑制作用随着浓度的增大而增大。
[0049]实施例3
[0050]本实施例涉及富勒烯对腊样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的生长促进作用。
[0051]试剂和仪器:Minimal Davis培养基(配方同实施例二)，lmg/L nC60, 5mg/L nC6。生，全自动微生物生长曲线测定仪(芬兰Bioscreen C, MBR),配套多孔板。
[0052]方法:按1%接种量将对数期的Bacillus cereus接种到1000 μ L含lmg/L和5mg/L的MD培养基中，体系做好标记，以方便点样。涡旋振荡充分混匀后，将每个样品接种的微体系转移到微孔板，每个加样口 300 μ L，每个样品设三个重复。Bioscreen全自动生长曲线测定仪自检结束后，将点样完毕的多孔板置于仪器中多孔板架。打开程序设置软件，设定培养温度37°C，并伴随中等强度的连续振荡，培养时间设为96小时，每隔I小时测其OD值。测量的数据自动保存到一个包含所有OD值数据的Excel表格中。利用绘图软件Origins.0,绘制不同条件下Bacillus cereus的生长曲线。
[0053]结果:如图4所示，Bacillus cereus在培养的10小时以内实验组和对照组均达到了平台期。nC6(l的加入显著提高了 Bacillus cereus平台期的生物量且加入5mg/L C6tl的实验组平台期生物量的增大最为显著。实验结果表明nC6(l对Bacillus cereus的生长可能具有一定的促进作用，且这种促进作用可随浓度的增加而增大。
[0054]实施例4
[0055]本实施例涉及不同浓度富勒烯水溶液对腊样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的生长促进作用。
[0056]试剂和仪器:Minimal Davis培养基(配方同实施例二),0.lmg/L nC60,0.5mg/LnC60, lmg/L nC60, 3mg/L nC60, 5mg/L nC60, 7mg/L nC60,9mg/L nC6(l,全自动微生物生长曲线测定仪(芬兰Bioscreen C, MBR),配套多孔板。
[0057]方法:将已活化的Bacillus cereus 接种到分别含有 0.lmg/L,0.5mg/L, lmg/L,3mg/L, 5mg/L, 7mg/L, 9mg/L以及不含nC6(l的MD培养基中，体系做好标记，以方便点样。祸旋振荡充分混匀后，将每个样品接种的微体系转移到微孔板，每个加样口 300 μ L，每个样品设三个重复。Bioscreen全自动生长曲线测定仪自检结束后，将点样完毕的多孔板置于仪器中多孔板架。打开程序设置软件，设定培养温度37°C，并伴随中等强度的连续振荡，培养时间设为96小时，每隔I小时测其OD值。测量的数据自动保存到一个包含所有OD值数据的Excel表格中。利用绘图软件0rigin8.0,绘制不同条件下Bacillus cereus的生长曲线。
[0058]结果:不同浓度的nC6(l对Bacillus cereus的生长促进效果不同,这组实验一共设计了 8个浓度梯度,从0.lmg/L到9mg/L不等。如图5所示,添加了不同浓度的nC6(l之后，Bacillus cereus在平台期的生物量均高于对照组。以“B”表示平台期的生物量，不同nCM浓度下，Bacillus cereus在平台期的生物量的关系为:B
nC60free〈B〇.lmg/L〈B〇.5mg/L^'^9mg/L^'^lmg/
在浓度小于3mg/L的条件下，nC6(|的促进生长的作用会随着浓度的增加而增加，存在剂量效应。当浓度增加到3mg/L后，这种剂量效应将不再存在。当浓度继续增大，nC60这种促进生长的作用反而降低。
[0059]实施例5
[0060]本实施例涉及不同pH值的条件下富勒烯水溶液对蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)的生长促进作用。
[0061]试剂和仪器:Minimal Davis培养基(配方同实施例二)，lmg/L nC60, 5mg/L nC6(l生，全自动微生物生长曲线测定仪(芬兰Bioscreen C, MBR),配套多孔板。
[0062]方法:BaciIIus cereus培养在含有不同浓度nC6(l且pH值不同的MD培养基中，利用Bioscreen法测定Bacillus cereus生长过程中的OD值的变化。具体操作为，nC6(l终浓度为lmg/L和5mg/L且接种前培养体系的pH值分别为6，7，8。1%接种对数期的Bacilluscereus于100孔的微孔板中，置于Bioscreen全自动微生物生长曲线测定仪中进
行培养。
[0063]结果:实验中三个pH条件下的培养结果如图6所示。pH=6的条件下，nC60能很好的重现出对Bacillus cereus的生长促进作用。而在pH=7的条件下,加入nC60后,对数期的(5小时之前)Bacillus cereus的生长速率不变，随着对照组逐渐进入平台期，对照组的生长速率有下降的趋势，但加入5mg/L nC60的实验组中的Bacillus cereus仍持续增长。实验组和对照组均达到平台期时，5mg/L nC6(l这一组的生物量要远高于其余两组。在pH=8的条件下，Bacillus cereus的生长在加入lmg/L之后,达到平台期后的生物量比对照组要大。5mg/L这组在生长到IOh的时候生物量达到最大，其后的I小时之内OD值迅速下降到一个较低的水平。
[0064]实施例6
[0065]本实施例涉及不同氧化条件下富勒烯水溶液对腊样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的生长促进作用。
[0066]试剂和仪器:Minimal Davis培养基(配方同实施例二), 2mg/L异抗坏血酸钠，5mg/L nC6(l生，全自动微生物生长曲线测定仪(芬兰Bioscreen C，MBR)，配套多孔板。
[0067]方法:称取0.05g的抗坏血酸钠,溶于ImL的去离子水中，充分混匀，制备成50mg/mL异抗坏血酸钠母液。取4 μ L的50mg/mL的异抗坏血酸钠母液加入到待接菌的MD培养基中。异抗坏血酸钠在培养基的终浓度为2 μ g/mL。nC6(l终浓度调整为5mg/L。将对数期的Bacillus cereus接种到1 00孔的微孔板中，置于Bioscreen全自动微生物生长曲线测定仪中进行培养。
[0068]结果:如图7所示,添加了抗氧化剂D-异抗坏血酸钠后，Bacillus cereus在平台期的生物量高于对照组。各组平台期生物量的关系为:Β ηα；Μ_〈Β异抗坏血酸钠〈BWlnc6o<B5fflg/L ?。6(1+异抗坏血.酸钠。还原性物质异抗坏血.酸钠的添加有助于富勒烯发挥其促进微生物生长的作用。
[0069]实施例7
[0070]本实施例涉及粒径为20~550nm的富勒烯纳米颗粒物对腊样芽孢杆菌(Bacilluscereus)胞内总蛋白量的提高。
[0071]试剂和仪器:Minimal Davis培养基(配方同实施例二)，lmg/L及5mg/L的nC6(l, BCA法蛋白定量试剂盒(南京建成生物技术公司)，0.9%NaCl溶液(w/v)，台式冷冻离心机(上海离心机研究所，GL-21M、LC-6M)，超声波细胞破碎仪(宁波心之，JY92-2D)。
[0072]方法:1%的接种量将活化的Bacillus cereus分别接种到不含nC6(l和分别含lmg/L和5mg/L的nC6Q的300mL MD培养基中。180r/min，37°C培养12小时后收集菌体。用10000r/min转速离心菌体30min,弃去上清,置于冰上,收集的菌体将用于蛋白提取。向收集菌体的离心管中加入40mL生理盐水,润旋振荡悬浮菌体。10000r/min离心20min后弃上清，保留沉淀。此步骤重复两遍。并加入IOmL的生理盐水,加入溶菌酶至30 μ g/mL,在4°C冷室里低转速混匀摇荡30min。作用结束后用超声破碎法破碎细胞，破碎条件为:工作时间3s,间歇时间5s,总时间20min,保护温度16°C。把破碎好的细胞在4°C下16000r/min离心30min。取上清，上清中含有所有的非包涵体表达的蛋白，即可用来测活性。蛋白浓度的测定使用BCA法蛋白定量试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
[0073]结果:如图8所示，加入nC6(l之后，提取出的总蛋白量显著升高。对照组的总蛋白浓度约为450mg/mL,含lmg/L nC60的实验组中的总蛋白的含量约为800mg/mL,而5mg/L组的蛋白总量最高，约850mg/mL。结果表明加入nC6(l的培养组,Bacillus cereus的总蛋白量有明显增加。
[0074]实施例8
[0075]本实施例涉及粒径为20~550nm的富勒烯纳米颗粒物对腊样芽孢杆菌(Bacilluscereus)反硝化能力的影响。
[0076]试剂和仪器:反硝化能力测试培养基(MMN) (IL):3.275g K2HPO4.3H20,1.146gNaH2PO4.2H20,0.1g MgSO4.7H20,0.0425g NaNO3,0.018g CaCl2,0.560mg MnSO4.H20,0.5mgFeCl3,0.782mg CuSO4.5H20，3mg (NH4) 6Mo7024.4H20，0.1g 酵母提取物，0.06g 葡萄糖。紫外光分光光度计(美国Aligent, Cary60)。
[0077]方法:将平板上生长的Bacillus cereus单菌落接种到5mL LB液体培养基中37°C,180r/min振荡扩培8小时，富集菌体。培养得到的菌液进行离心处理，4000g离心5min,弃上清。向沉淀的菌体中加入5mL的0.9%NaCl溶液，涡旋振荡充分混匀后4000g离心5min，弃去上清，此步骤需重复两次。加入3mL的0.9%NaCl后，涡旋振荡混匀。置于冰上，准备接种。配制终浓度为lmg/L或5mg/L nC60的MMN培养基,对照不加nC6(l,用无菌去离子水代替。每个血清瓶为IOmL的培养体系，每组设五个重复。按1%接菌量接入到血清瓶中IOmL的体系中。给血清瓶加上胶塞和铝套，密封后充入氮气(0.3MPa20s)。28°C, 160°C r/min摇培96小时。对培养液进行离心处理，9000g离心5min，对上清中的硝酸盐及亚硝酸的含量使用分光光度法进行测量。
[0078]结果:如图9所示lmg/L nC6(l的加入不改变Bacillus cereus对硝酸盐的去除率，而5mg/L nC6(l能显著降低培养基中硝酸盐的浓度。结果表明此时Bacillus cereus利用硝酸盐的效率因高浓度的nC6(l的加入而大大提高。硝酸盐的利用率从35%升高到55%。硝酸盐利用率的提高会增加亚硝酸盐的生成量，而高浓度nC6(l组中可以检测到的亚硝酸盐的含量和其它两组相比显著降低。对照组中培养液中亚硝酸盐的含量为33μ g/mL，而加入高浓度nC60实验组中亚硝酸盐的含量为25 μ g/mL，表明Bacillus cereus对亚硝酸盐的利用率亦大大增高。硝酸盐去除率的升高和亚硝酸盐积累量的降低说明，C6tl可以显著提高Bacilluscereus的反硝化能力。
[0079]实施例9
[0080]本实施例涉及富勒烯对短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的生长促进作用。
[0081]试剂和仪器:Minimal Davis培养基(配方同实施例二)，lmg/L nC60, 5mg/L nC6(l生，全自动微生物生长曲线测定仪(芬兰Bioscreen C，MBR)，配套100孔板。
[0082]方法:按1%接种量将对数期的Bacillus pumilus接种到1000 μ L含lmg/L和5mg/L的MD培养基中，体系做好标记，以方便点样。涡旋振荡充分混匀后，将每个样品接种的微体系转移到微孔板，每个加样口 300 μ L，每个样品设三个重复。Bioscreen全自动生长曲线测定仪自检结束后， 将点样完毕的100孔板置于仪器中的凹槽里。打开程序设置软件，设定培养温度37°C，并伴随中等强度的连续振荡，培养时间设为96h，每隔Ih测其OD值。测量的数据自动保存到一个包含所有OD值数据的Excel表格中。利用绘图软件0rigin8.0，绘制不同条件下Bacillus pumilus的生长曲线。
[0083]结果:如图10所示,Bacillus pumilus在培养的IOh以内实验组和对照组均达到了平台期。nC6(l的加入显著提高了 Bacillus pumilus平台期的生物量且加入5mg/L C6。的实验组平台期生物量的增大最为显著。实验结果表明nC6(l对Bacillus pumilus的生长可能具有一定的促进作用，且这种促进作用可随浓度的增加而增大。
[0084]实施例10
[0085]本实施例涉及富勒烯对食酸代尔夫特菌(Delftia tsuruhatensis)的生长促进作用。
[0086]试剂和仪器:Minimal Davis培养基(配方同实施例二)，lmg/L nC60, 5mg/L nC6。生，全自动微生物生长曲线测定仪(芬兰Bioscreen C，MBR)，配套100孔板。
[0087]方法:按1%接种量将对数期的Delftia tsuruhatensis接种到1000 μ L含Img/L和5mg/L的MD培养基中，体系做好标记，以方便点样。涡旋振荡充分混匀后，将每个样品接种的微体系转移到微孔板，每个加样口 300 μ L,每个样品设三个重复。Bioscreen全自动生长曲线测定仪自检结束后，将点样完毕的100孔板置于仪器中的凹槽里。打开程序设置软件，设定培养温度37°C，并伴随中等强度的连续振荡，培养时间设为96h，每隔Ih测其OD值。测量的数据自动保存到一个包含所有OD值数据的Excel表格中。利用绘图软件0rigin8.0,绘制不同条件下Delftia tsuruhatensis的生长曲线。
[0088]结果:如图11所示,对照组中的Delftia tsuruhatensis在培养过程中生长缓慢，nC6。的加入显著提高了 Delftia tsuruhatensis的生长速率。5mg/L C6tl加入显著提高了的其在平台期的生物量。实验结果表明nC6(l对Delftia tsuruhatensis的生长可能具有一定的促进作用，且这种促进作用可随浓度的增加而增大。
[0089]实施例11
[0090]本实施例涉及粒径为20~550nm的富勒烯纳米颗粒物对反硝化菌群结构的影响。
[0091]试剂和仪器:培养所需试剂和仪器。Minimal Davis培养基(配方见实施例二)，5mg/LnC60, 50mL血清瓶，玻璃珠，PCR仪(美国ABI，Veriti )。变性梯度凝胶电泳电泳仪(美国Bio-Rad,Dcode),凝胶成像系统(上海天能，Tanon3500)。实验室从某焦化废水处理厂的二沉池采集种子污泥，建立了以喹啉为唯一碳源的反硝化反应器。
[0092]方法:从反应器中采集反硝化菌群样品。从反应器中不同位置吸取约40mL的反应器中的培养液(包括生物膜)于离心管中，离心管中包含已灭菌的玻璃珠。涡旋振荡5min冰浴5min，交替进行3次，目的是将膜组分充分打碎，将样品中的各类微生物充分混匀。由于生物膜可能会对nC6(l有一定的吸附作用，从而接种的样品若含有生物膜势必会影响nC6Q在培养基中的浓度。选择离心的方式将样品中已打碎的生物膜部分和液体部分分开，离心2000g，5min，将生物膜碎片沉降下去，取上清液为接种材料。将准备好的用于接种的菌液接种到含有5mg/L nC6(l的MD培养基中。每个血清瓶的体系为30mL，按3%的接种量进行接菌。血清瓶按PH6.5和pH7.5分成两批，每批又分成有氧培养组和无氧培养组。有氧组的瓶口用无菌的锡箔纸封口。厌氧培养组的瓶口用橡胶塞和铝盖密封，充入氮气(0.3MPa，20s)。将接种的血清瓶置于37°C摇床进行培养，180r/min，培养7天。在培养开始后的I天，2天，3天，7天进行取样，加入甘油将样品保存，待取样工作结束后，将样品进行统一处理，提取其DNA。提取的DNA用于模板对16S rDNA的V3区进行PCR扩增。通过变性梯度凝胶电泳分析菌群结构的改变情况。
[0093]结果:如图12所示，富勒烯对菌群结构具有较为显著的调节作用。富勒烯在偏酸性的条件下会显著影响菌群的结构，而在偏碱性的条件下则不如偏酸条件显著。且在有氧气存在的条件下，富勒烯可有效的调节菌群结构。富勒烯对菌群中的微生物的生长起着双向调节作用，一部分菌的生长在加入富勒烯之后生长情况变好，在群落中丰度提高，而另一些菌在加入富勒烯之后，生长受到抑制，在群落中的丰度下降。由此，富勒烯的加入导致了群落内细菌的组成结构的改变。
[0094]综上所述，与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果:本发明通过对富勒烯生物学效应的研究，确定了富勒烯具有调节微生物生长和代谢的作用，发现了富勒烯材料的新用途，将推动富勒烯在微生物及其相关领域的应用；本发明发现富勒烯能够实现如下具体的用途:1、抑制致病菌和有害菌的生长；2、促进功能菌的生长和代谢；3、调节微生物群落结构与功能；4、提高土壤肥力；5、改善发酵产品的理化性质和风味；6、促进污水处理等环境修复的效率。
[0095]以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
【权利要求】
1.一种碳纳米材料富勒烯作为调节微生物生长或代谢的调节剂的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述调节具体为调节微生物的生长能力。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述调节具体为调节微生物的代谢活性。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述调节具体为抑制细菌的生长。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述调节具体为促进细菌的生长和促进细菌的代谢活动。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述调节具体为调节混合微生物菌群的细菌群落结构，抑制部分细菌生长，同时能够促进另外部分细菌的生长。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述调节具体为调节微生物菌群结构，进而调整菌群功能，提高利用菌群进行工农业生产的生产效率。
8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述调节具体为促进细菌的反硝化活性。
9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述调节具体为促进细菌降解有机物的能力。
10.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述调节具体为调节微生物菌群结构，进而促进微生物的生长和活性，促进利用微生物进行污染物的环境修复。
11.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述富勒烯具有由碳原子构成的中空的多面体结构。
12.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途具体为，制备富勒烯的胶体溶液，之后将所述胶体溶液添加到微生物的生长环境中，进而实现调节微生物生长或代谢的目的。
13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述富勒烯的胶体溶液中，富勒烯分子聚集体的粒径为20~ 550纳米。
【文档编号】C12N1/38GK103789251SQ201410041933
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月28日 优先权日:2014年1月28日
【发明者】张晓君, 黄飞, 葛玲, 赵立平, 张波, 何义亮 申请人:上海交通大学