专利名称：一种微生物体内合成生物柴油的方法
技术领域：
本发明属于可再生能源领域与生物质能源领域，具体地涉及一种在微生物体内从 头合成生物柴油的方法。
背景技术：
生物柴油，主要是以动植物油脂为原料油，通过化学法或酶法催化的酯交换工艺 来制备。这种生产方式面临的主要瓶颈问题是生产原料不足、甲醇的使用以及甘油副产物 的去除等问题，而其中最主要的问题还是生产原料供应不足。目前，在工业上用于制备生物 柴油的主要油脂资源(如大豆油、菜籽油等)同时也是人类生活所必须的，而大量种植油料 植物来提供原料又存在着耕地不足以及季节气候限制等问题。微藻油脂被认为是生产生物 柴油比较合适的生物质资源，但是目前仍然面临诸多技术瓶颈问题，未能实现大规模的利 用。农作物秸秆和木屑等纤维素生物质资源极为丰富，而且长期以来没有得到有效的 利用。近年来，国内外兴起了利用纤维素生物质制备生物乙醇的热潮，其主要的流程就是将 纤维素生物质水解成单糖类物质，然后再利用微生物发酵生产乙醇。所以，利用纤维素生物 质制备生物乙醇，能够在一定程度上解决生物乙醇生产领域原料供应的问题。如果能够实 现微生物发酵将糖转化为生物柴油，那么丰富的纤维素生物质资源就能先水解成糖，进而 转化为生物柴油，这就能够解决生物柴油生产中原料供应不足的问题。德国明斯特大学的Alexander Steinbuchel教授领导的课题组通过基因工程改 造，在大肠杆菌(Escherichia coli,E. coli)中构建了一条长链脂肪酸乙醇酯的合成途径， 第一次实现了由糖到生物柴油的生物转化，这项工作发表在“Microbiology "(Kalscheuer， R. , Τ.Stolting,et al. (2006). "Microdiesel !Escherichia coli engineered for fuel production. Microbiology 152 (Pt 9) :2529-2536.)。但是在 Alexander Steinbuchel 团 队的这项成果中，虽然首次实现了生物柴油的微生物合成，但是仍然需要给大肠杆菌提供 来自外源的长链脂肪酸；其得到的每分子脂肪酸乙醇酯中绝大部分的碳原子是外源脂肪酸 提供的，所以还未能实现真正的微生物体内从头合成生物柴油。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微生物体内合成生物柴油的方法，在微生物体内构建 一条由糖转化到生物柴油的代谢途径，实现生物柴油在微生物体内的从头合成。为实现上述目的，本发明提供的微生物体内合成生物柴油的方法，主要步骤为A)分别将不动杆菌蜡脂合成酶基因atfA、大肠杆菌脂酰辅酶A合成酶基因fadD、 运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因Pdc和乙醇脱氢酶基因adhB四个基因克隆到表达载 体pET28b上，基因的两端分别带上NdeI(5’端)和Spel(3’端)酶切位点，使上述四个基 因都置于T7启动子下游，由T7启动子驱动表达。B)通过SpeI和)(baI是同尾酶这一特点，将fadD基因插入到atfA基因片段后的SpeI位点得到质粒pXT9，将adhB基因插入到pdc基因片段后的SpeI位点得到质粒pXTIO ； 再将pdc+adhB基因片度插入到atfA+fadD基因片段后的SpeI位点得到四个基因共表达的 质粒PXT11 ；在质粒pXT 11上，atfA+fadD+pdc+adhB四个基因置于同一个T7启动子的下游。C)将pXTll转入到含有质粒pMSD8和pMSD15的大肠杆菌菌株得到大肠杆菌菌株 XT31 ；pMSD8和pMSD15两个质粒是分别用于在大肠杆菌中过量表达乙酰辅酶A脱羧酶和硫 酯酶的。D)大肠杆菌菌株XT31经过IPTG和阿拉伯糖诱导产生生物柴油，S卩脂肪酸乙醇酯。本发明的优点是在同一株大肠杆菌中既引入运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis ZM4)的乙醇合成途径，又大幅提高其脂肪酸的合成能力，还外源表达了不动杆菌 (Acinetobacter baylyi ADP1)的蜡脂合成酶，这样就直接在大肠杆菌体内合成了生物柴 油。利用这一技术来制备生物柴油既不需要通过酯化反应，也不需要外源添加长链脂肪酸， 能够大幅地削减生物柴油制备的成本。
图1为质粒pXTl的基本结构，pdc基因克隆于pGEMT-easy (ftOmega)载体，基因 片段两端带有NdeI和SpeI位点。图2为质粒pXT3的基本结构，fadD基因克隆于pET28b载体，基因片段两端带有 XbaI和SpeI位点。图3为质粒pXT4的基本结构，pdc基因克隆于pET28b载体，基因片段两端带有 XbaI和SpeI位点。图4为质粒pXT5的基本结构，adhB基因克隆于pET28b载体，基因片段两端带有 XbaI和SpeI位点。图5为质粒pXT9的基本结构，atfA和fadD基因串联克隆于pET28b载体，基因片 段两端带有)(bal和SpeI位点。图6为质粒pXTIO的基本结构，pdc和adhB基因串联克隆于pET28b载体，基因片 段两端带有)(bal和SpeI位点。图7为质粒pXTll的基本结构，atfA、fadD、pdc和adhB基因串联克隆于pET28b 载体，基因片段两端带有)(bal和SpeI位点。图8为大肠杆菌XT31经诱导后，其培养液中脂肪酸乙醇酯的生产情况；C12:0表 7j\ Dodecanoic acid, ethyl ester ;C14:0 表不 Tetradecanoic acid, ethyl ester ；C16:1 表 7j\ Ethyl 9-hexadecenoate ；C16:0 表 7j\ Hexadecanoic acid，ethyl ester ；C18:1 表 7j\ Ethyl Oleate ；C18:0 表不 Octadecanoic acid，ethylester ；C19 内标表不 Methyl Nonadecanoate0图9为大肠杆菌XT31经诱导后，其细胞内脂肪酸乙醇酯的生产情况；C12:0表 7j\ Dodecanoic acid，ethyl ester ;C14:0 表不 Tetradecanoic acid，ethylester ；C16:1 表 7j\ Ethyl 9-hexadecenoate ；C16:0 表 7j\ Hexadecanoic acid，ethylester ；C18:1 表 7j\ Ethyl Oleate ；C18:0 表不 Octadecanoic acid，ethyl ester ；C19 内标表不 Methyl Nonadecanoate0
具体实施例方式本发明的目的是通过如下措施来达到在微生物体内既引入乙醇合成途径，又大幅提高其自身脂肪酸的合成能力，还同 时外源表达蜡脂合成酶，从而在大肠杆菌体内实现直接从头合成生物柴油。引入乙醇合成途径，就是将来源于运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis ZM4)的 Pdc和adhB基因，在微生物体内共表达，实现生产乙醇。大幅提高其自身脂肪酸合成能力，是通过在微生物体内过量表达乙酰辅酶A脱羧 酶和硫酯酶来实现的。蜡脂合成酶基因，是来源于不动杆菌(AcinetcAacter baylyi ADP1)的atfA基 因。本发明的能生产生物柴油的大肠杆菌菌株XT31，其细胞生长迅速，能够利用培养 基中的糖为唯一碳源直接生产生物柴油。大肠杆菌宿主菌为 Escherichia coli BL21(DE3)。不动杆菌蜡脂合成酶基因atfA、大肠杆菌脂酰辅酶A合成酶基因fadD、运动发酵 单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因Pdc和乙醇脱氢酶基因adhB，是被串联于同一个质粒pXTll上， 它们是被同一个T7启动子驱动表达的。下面以具体实例来进一步说明本发明。实施例1A)分别将atfA、fadD、pdc和adhB基因克隆于pET28b载体上(1)质粒pXL67是atfA基因通过NdeI和SpeI克隆于pET28b载体的而得到的； 而质粒pXL72是fadD基因克隆于pCR-blunt载体上得到的；pYL6和pYL5则是pdc和adhB 基因分别克隆于PMD18-T载体上得到的。(2)质粒pYL6SpeI位点上游有一个^CbaI位点，会影响后续的DNA分子克隆操作， 需要消除。首先，以)(bal完全酶切pYL6，然后用T4DNAP0lymerase将粘性末端补平，最后让 DNA片段自连接，转化大肠杆菌。得到的克隆，提取质粒经测序确认^CbaI位点已经消除，这 个质粒为PXTl (图1)。(3)以 NdeI 和 SpeI 酶切质粒 pXL72、pXTl 和 pYL5，分别将 fadD、pdc 和 adhB 基因 片段切下回收。(4)而pXL67也以NdeI和SpeI酶切，回收pET载体片段。(5)分别将回收后的fadD、pdc和adhB基因片段与pET载体片段相连接，转化大 肠杆菌DH5 α，经过抗性筛选酶切鉴定就得到了质粒ρΧΤ3 (图2)，ρΧΤ4 (图3)和pXT5 (图 4)。B) atfA和fadD基因，pdc和adhB基因分别串联克隆于pET载体上(1)以SpeI酶切质粒pXL67，回收线性DNA片段，再以碱性磷酸酶!^astAP (MBI)处 理，回收PXL67载体片段；而质粒pXT3经^CbaI和SpeI酶切后，回收fadD基因片段；将fadD 基因片段和PXL67载体片度相连接，转化大肠杆菌，再通过提质粒酶切筛选鉴定fadD片段 正向插入的克隆，即得到质粒PXT9 (图5)。(2)按照上面同样的方法，以SpeI酶切质粒ρΧΤ4，回收线性DNA片段，再以碱性 磷酸酶!^astAP(MBI)处理，回收ρΧΤ4载体片段；而质粒ρΧΤ5经)(baI和SpeI酶切后，回收adhB基因片段；将adhB基因片段和pXT4载体片度相连接，转化大肠杆菌，再通过提质粒酶 切筛选鉴定adhB片段正向插入的克隆，即得到质粒pXTIO (图5)。C)atfA、fadD、pdc和adhB基因串联克隆于pET载体上首先，以SpeI和B10I酶切质粒pXT9，回收载体片段；然后，以^CbaI和BioI酶切 质粒ρΧΤΙΟ，回收pdc+adhB基因片段；最后，pdc+adhB基因片段和pXT9载体片段相连接，转 化大肠杆菌，就得到了四个基因串联于PET载体上的质粒，pXTll (图6)。质粒pXTll转化高产脂肪酸菌株，即含有PMSD8和pMDS15两个质粒的大肠杆菌 BL21(DE3)(Lu, X. , H. Vora, et al. (2008). “ Overproductionof free fatty acids in Ε. coli amplications for biodiesel production. " Metab EnglO (6) :333-339.),就得 到大肠杆菌菌株XT31。Dl)大肠杆菌XT31生产生物柴油(脂肪酸乙醇酯)的实验1(1)将37度过夜培养的大肠杆菌XT31种液，按体积比1 100的比例稀释到30mL LB培养基；(2)培养3小时后，大肠杆菌XT31细胞OD6tltl为0.4-0. 5，此时加入L-阿拉伯糖至 终浓度为0.4% ；(3)L-阿拉伯糖诱导1小时后，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓 度为0. 5mM ；(4)加入IPTG诱导17小时后，离心收集大肠杆菌细胞。(5)大肠杆菌细胞培养液以及经过冷冻干燥的细胞沉淀，分别经等体积的甲醇/ 氯仿(ν/ν = 2 1)抽提；有机相回收后再经氮气吹干，再用正己烷溶解。(6)样品经0.45μπι滤膜过滤后，就可以用GC-MS(气相色谱-质谱联用仪)检测 了。实验结果分别在大肠杆菌ΧΤ31细胞培养液(图8)以及细胞内(图9)都检测到 了各种脂肪酸乙醇酯；通过参照内标(C19内标，MethylNonadecanoate)，计算得到细胞内 以及培养液中脂肪酸乙醇酯的浓度分别为7. 74和15. llmg/L培养液，总产量为22. 86mg/ L培养液。这一结果显示，通过基因工程改造的大肠杆菌XT31能产生脂肪酸乙醇酯，而且还 有一大半的脂肪酸乙醇酯存在于培养液中。D2)大肠杆菌XT31生产生物柴油(脂肪酸乙醇酯)的实验2(1)将37度过夜培养的大肠杆菌XT31种液，按体积比1 200的比例稀释到30mL M9培养基，补加2%葡萄糖作为碳源；(2)培养6小时后，大肠杆菌XT31细胞OD6tltl为0.4-0. 5，此时加入L-阿拉伯糖至 终浓度为0.4% ；(3)L_阿拉伯糖诱导1小时后，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓 度为0. 5mM ；(4)加入IPTG诱导17小时后，离心收集大肠杆菌细胞。(5)大肠杆菌细胞培养液以及经过冷冻干燥的细胞沉淀，分别经等体积的甲醇/ 氯仿(ν/ν = 2 1)抽提；有机相回收后再经氮气吹干，再用正己烷溶解。(6)样品经0.45 μ m滤膜过滤后，用GC-MS (气相色谱-质谱联用仪)检测。
实验结果分别在大肠杆菌XT31细胞培养液以及细胞内都检测到了各种脂肪酸 乙醇酯；而且通过参照内标019内标)，计算得到细胞内以及培养液中脂肪酸乙醇酯的浓 度分别为25. 36和25. 80mg/L培养液，总产量为51. 16mg/L培养液。这一结果，证明了大肠杆菌XT31以葡萄糖作为唯一碳源，也能生产脂肪酸乙醇 酯，而且其产量还进一步提高到51. 16mg/L培养液。这也证明了本发明的微生物从头合成 生物柴油的技术是完全可行的。生物材料样品保藏信息本发明涉及的生物材料样品为所构建的1个质粒(图1-7)及相应的1株大肠埃希 氏菌株(Escherichia coli DH5 α )XT17 ；还有一株高产脂肪酸的大肠埃希氏菌株，即含有 质粒 pMSD8、pMSD15 和 pXTll 的大肠杆菌 ΧΤ31 (Escherichia coli XT31)。以上 2 个大肠埃 希氏菌株均保藏在中国科学院微生物研究所中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)， 地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。保藏日期2009年11月10日。保藏编号 CGMCC No. 3436，CGMCC No. 3437。保藏编号(以下格式为“CGMCC编号菌株号宿主菌拉丁文(质粒号)”)3437 XT17 Escherichia coli DH5α (pXTll)3436 XT31 Escherichia coli BL21(DE3)(pMSD8+pMSD 15+pXTll)。
权利要求
1.一种微生物体内合成生物柴油的方法，主要步骤为A)分别将不动杆菌蜡脂合成酶基因atfA、大肠杆菌脂酰辅酶A合成酶基因fadD、运 动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因Pdc和乙醇脱氢酶基因adhB四个基因克隆到表达载体 pET28b上，基因的两端分别带上NdeI和SpeI酶切位点，使上述四个基因都置于T7启动子 下游，由T7启动子驱动表达；B)通过SpeI和^CbaI是同尾酶这一特点，将fadD基因插入到atfA基因片段后的SpeI 位点得到质粒pXT9，将adhB基因插入到pdc基因片段后的SpeI位点得到质粒pXTIO ；再将 pdc+adhB基因片度插入到atfA+fadD基因片段后的SpeI位点得到四个基因共表达的质粒 pXTll ；C)将pXTll转入到含有质粒pMSD8和pMSD15的大肠杆菌菌株得到大肠杆菌菌株 XT31 ；D)大肠杆菌菌株XT31经过IPTG和阿拉伯糖诱导产生生物柴油。
2.根据权利要求1所述微生物体内合成生物柴油的方法，其中，质粒pXTll上， atfA+fadD+pdc+adhB四个基因置于同一个T7启动子的下游。
3.根据权利要求1所述微生物体内合成生物柴油的方法，其中，PMSD8和pMSD15两个 质粒是分别用于在大肠杆菌中过量表达乙酰辅酶A脱羧酶和硫酯酶的。
4.根据权利要求1所述的菌株，微生物体内合成生物柴油的方法，其中，产生的生物柴 油为脂肪酸乙醇酯。
全文摘要
一种微生物内合成生物柴油的方法，在大肠杆菌中实现，其步骤为分别将不动杆菌蜡脂合成酶基因atfA、大肠杆菌脂酰辅酶A合成酶基因fadD、运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因pdc和乙醇脱氢酶基因adhB四个基因串联克隆到pET表达载体上得到质粒pXT11；将pXT11转入到含有质粒pMSD8和pMSD15的大肠杆菌得到大肠杆菌菌株XT31；大肠杆菌XT31生产生物柴油。本发明实现了由糖到生物柴油的微生物转化，为木质纤维素生物质制备生物柴油奠定了基础，从根本上解决生物柴油制备中原料供应不足的问题；该技术也不需要经过甲醇酯化的步骤，所以大大降低了成本，也没有甘油副产物形成等问题。
文档编号C12N1/21GK102071228SQ200910241540
公开日2011年5月25日 申请日期2009年11月25日 优先权日2009年11月25日
发明者吕雪峰, 朱至, 段仰凯, 蔡轲, 谈晓明 申请人:青岛生物能源与过程研究所