专利名称：苏云金芽孢杆菌cry1Ai在抗虫中的用途、改造的mcry1Ai基因及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别是涉及苏云金芽孢杆菌crylAi的用途，以及改造 的mcrylAi基因及应用。
背景技术：
虫害是造成农作物减产的重要原因之一，减少虫害的损失是增加粮食与饲料作物 产量的重要途径。据统计全球粮食与饲料作物总产量每年因虫害造成的损失达14%，直接 给农业生产造成的经济损失高达数千亿美元。我国每年因虫害造成的损失水稻减产10%、 小麦减产20%、棉花减产30%以上[夏启中，张明菊，抗植物虫害基因及其应用，鄂州大学 学报，2005，(5) :56-60.]。采用喷施化学农药和生物杀虫剂等防治手段固然可以减轻害 虫对农作物的为害，但化学农药造成环境污染，生物杀虫剂成本较高。长期以来，大量喷施 化学杀虫剂，不仅会增强害虫的抗药性，使益虫及其它生态区系遭受破坏，而且严重污染环 境，提高生产成本，破坏生态平衡。因此，减少杀虫剂使用量，发展现代植物保护技术，已成 为可持续发展农业中必须正视的课题之一。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布广泛的革兰氏 阳性细菌，是一种对害虫毒力强且对天敌无毒性的昆虫病原微生物，对高等动物和人无毒 性。它是目前研究最为深入、使用最为广泛的微生物杀虫剂，对16个目3000多种害虫有 活性。Bt在芽孢形成期可形成杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProteins, ICPs)， 也称δ-内毒素(delta-endotoxin)，它的形状、结构和大小均与其毒力有着密切关系 [Schnepf. E, Crickmore. N, Van Rie. J. , Lereclus. D, Baum. J, Feitelson. J, Zeigler. D. R., Dean. D. H. Bacillus thuringiensisand its pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev, 1998,62(3) :775_806.]。自 1981 年 Schn印f 等克隆了 Bt 的第一个 ICPs 基 因，并于1985年发表了它的DNA碱基序列及其编码蛋白的氨基酸序列起，截止2008年6月 已发现和克隆了 412种ICPs基因。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白因其杀虫效果好、安全、 高效等优点而被广泛的应用于虫害防治。1996年全世界第一例转基因抗虫植物在美国获 准应用，它使用的基因来自Bt crylAc.在接下来的几年里，转cryIAb基因的抗虫玉米，转 cry3Aa基因的抗虫土豆等相距问世。在中国，自1998年开始正式推广含有crylAc/crylA 基因的抗虫棉以来，已经被普遍种植。在转基因作物商业化的第一个12年(1996-2007)中， 由于能得到持续稳定的收益，农民种植转基因作物量逐年增加。2007年，全球转基因作物种 植面积增长率达12%，即增加1230万hm2，达到1. 143亿hm2 (2. 824亿英亩)。第一个12 年，转基因作物商业化给工业化国家和发展中国家的农民都带来了经济和环境效益。由于目前商品化的转基因抗虫作物的抗虫基因种类比较单一，如此大面积推广种 植存在害虫避难所减少与害虫抗药性上升的风险。因此需要不断分离高毒力的或者新的基 因组合来避免害虫抗药性上升的风险。因此，筛选分离克隆新的、高毒力的Bt杀虫基因，可以丰富杀虫基因资源，为转基
3因作物与工程菌株提供新的基因来源，提高Bt转基因产品的抗虫效果，并且可以降低害虫 对Bt毒蛋白的抗性风险，避免新的生态灾难降临，具有重要的经济、社会和生态效益。
发明内容
本发明提供一种苏云金芽孢杆菌crylAi在抗虫中的用途，其对小菜蛾、玉米 螟、棉铃虫、粉纹夜蛾、甜菜夜蛾、二化螟等害虫具有高毒力；同时通过对苏云金芽孢杆菌 crylAi改造，得到苏云金芽孢杆菌晶体杀虫蛋白mcrylAi基因序列，以应用于转化微生物 和植物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。苏云金芽孢杆菌crylAi基因在抗鳞翅目害虫中的应用。所述应用是将苏云金芽孢杆菌crylAi基因表达的晶体蛋白用于杀灭鳞翅目害 虫。所述应用是将上述基因转入到微生物或植物，使之表达对鳞翅目害虫的毒性蛋 白。一种改造的mcrylAi基因，其具有如SEQ NO. 3所述的核苷酸序列。改造的mcrylAi基因在抗鳞翅目害虫中的应用。所述应用是将上述基因转入到微生物或植物，使之表达对鳞翅目害虫的毒性蛋 白。本发明发现菌株BTS6(保藏号CGMCC 3459)对鳞翅目害虫具有高毒力，从中克隆 得到一个基因，经测序(其核苷酸序列为SEQ NO. 1)发现，与公开的crylAi基因相似性为 100%。经实验证明，该基因蛋白(其氨基酸序列为SEQ NO. 2)对鳞翅目害虫具有高毒力， 从而可将其转化植物或微生物，使之表达蛋白杀灭鳞翅目害虫。根据CrylAi蛋白的杀虫活性区氨基酸序列设计合成了可以用于转基因植物开发 的DNA序列，其核苷酸序列如SEQ N03所示，该改造基因mcrylAi用于转化玉米，CrylAi蛋 白的含量最高可占总可溶蛋白的0. 23 %。保藏信息
分类命名苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis保藏号CGMCC3459保藏日期2009年11月23日保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号
图 1，cryl 类 PCR-RFLP 鉴定图谱1，引物k3un2/k5un2扩增酶切条带；2，引物k3un3/k5un3扩增酶切条带；M，IOObp ladder图2，cryIAx阳性克隆PCR鉴定1,3. 6kb PCR 产物；2，阴性对照；Μ, λ /Eco 1301图3，CrylAx在大肠杆菌中的表达1，空白对照不可溶组分；2，表达菌株不可溶组分；3，空白对照可溶组分；4表达菌株可溶组分图4植物表达载体pUlAi的构建图5植物表达载体pUlAi的酶切鉴定M =Lamda DNA/Ecol301I 1 :pUlAi/Sac I+BamH I，2:pT8A/Sac I+BamH I 3 p3300-Ubi/Sac I+BamH I图6抗性植株PCR检测M :DM2000P :pUlAi CK 阴性对照 1 15 部分转基因植株图7PCR阳性植株中cryIAi蛋白占可溶性蛋白比例图8T0代转基因植株的玉米螟生物活性测定A，B 未转基因植株 C 转基因植株
具体实施例方式实施例ICrylAi基因、蛋白功能1-1菌株BTS6杀虫活性测定将菌株接种到LB固体培养基上，培养72小时，至芽孢与晶体释放。将芽孢与晶体 用灭菌水洗下来，悬浮起来，稀释到1亿芽孢每毫升的浓度用于杀虫活性测定。以小菜蛾、 玉米螟、棉铃虫、甜菜夜蛾为例，测定对鳞翅目害虫的杀虫活性。结果显示该浓度的芽孢晶 体混合物对小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟具有高活性。四种试虫的死亡率都为100%。1-2BTS6 菌株的 PCR-RFLP 鉴定1.利用两对 cryl 类鉴定引物 k3un2/k5un2，k3un3/k5un3 (Kuo, W. S. and Chak, K. F. Identification of novel cry-type genes from Bacillus thuringiensis strains on the basis ofrestriction fragment length polymorphism of the PCR-amplified DNA. Applied andEnvironmental Microbiology, 1996,62 :1369-1377.)，对 BTS6 菌株大质 粒进行PCR-RFLP分析得到酶切图谱如图1。综合泳道1，2的酶切条带和已知基因的酶切图谱可以 大体确定BTS6菌株中含有crylA，crylE, crylK类基因，对鉴定PCR产物建立T-A克隆库， 进行测序。得到其中cryIA类片断与cryIAi相似性100%。1-3设计一对cryl类基因通用引物扩增从crylAi全长基因根据cryl类基因保守区设计了一对通用引物(CrylAi5/CrylAi3)，序列如下
CryIAi 5-ATGGATAACAATCCGAACATCAATGCry1Ai 3-CTATTCCTCCATAAGGAGTAATTCC通过PCR扩增的方法，以BTS6的基因组为模版，克隆cryIAi基因全长，见图2，连 接PEB表达载体得到阳性克隆。获得的重组表达载体质粒命名为PEBS6。用pfuDNA聚合酶，用如下体系进行PCR扩增。。 超纯水补至50 μ L，混勻离心，加石蜡油30 μ L。扩增循环94°C变性1分钟，54 °C退火1分钟，72°C延伸4分钟，25个循环，最后 72°C延伸10分钟。l-4crylAi全长基因序列分析对阳性克隆进行测序，得到基因全长序列。连接方案载体0.1-0.2yg目的片段 DNA0.5-1. Oyg5XLigation Buffer2μ LT4DNALigase1 μ L用超纯水补足体积到10 μ L，充分混勻，16°C连接4h或4°C连接过夜。转化方案1、挑取单菌落于5ml LB震荡培养过夜；2、按接种量接种于LB液体培养基中，37°C，230rpm培养2-2.5hr，(0D600 = 0. 5-0.6)；，3、4°C, 4，OOOrpm 离心 IOmin ；4、弃上清，加入预冷的0. IM CaC1250ml悬浮细胞，置于冰上30min以上；5、4°C，4, OOOrpm 离心 lOmin，回收细胞；6、用2_4ml冰预冷的0. IM CaC12重悬细胞，分装成200 μ 1/0. 5mL离心管中，于
4°C保存(可保存一周)。7、取200 μ 1感受态细胞与5 μ L连接产物充分混勻，冰浴30min。8、42°C 热激 1. 5min，冰浴 3min。9、加入 800 μ 1 LB 培养基 37°C培养 45min。10、取200 μ 1涂板，加入相应的抗生素，及IPTG，X_gal，37°C培养。基因全长3. 6kb，见SEQ NO. 1，翻译蛋白共1187个氨基酸见SEQ NO. 2。通过利用 在线分析工具(http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast. cgi)比对，使用蛋白保守结构域 数据库比对(Conserved Domain Database)分析，该蛋白氨基酸序列SEQ N0. 2的36至608 位氨基酸是该蛋白的杀虫活性区域。该基因序列与已报道的crylAi基因序列完全一致。
Distilled water
30% Degassed Acrylamide
1.5MTris(pH8.8)
1.0MTris(pH6.8)
10%SDS
10%APS
TEMED
分离胶8% (ml)
4.6
2.7 2.5
0.1 0.1 0.006
堆积胶5% (ml)
2.7
0.67
0.5 0.04 0.04 0.004上样上样10-15 μ 1，电泳:130-150V 恒压。染色与脱色电泳后取出凝胶，用蒸馏水冲洗后，放入染色液中，60rpm振荡染色 Ihr左右，脱色液中脱色2hr左右，脱色至凝胶背景透明，清水中漂洗至蛋白带清晰。cryIAi 基因可以表达约134kD的蛋白(见图3)。1-6杀虫活性测定以小菜蛾、玉米螟、棉铃虫为例测定蛋白对鳞翅目的杀虫活性，见由表1、表2、表 3，结果可知CrylAi蛋白对鳞翅目害虫有高毒力。敏感小菜蛾的生物活性测定结果如表1，各浓度重复4次，每重复接虫15头。表1，CrylAi对敏感小菜蛾的生物活性测定 敏感小菜蛾的生物活性测定结果显示CrylAi对敏感小菜蛾有高毒力。对敏感亚洲玉米螟的生物活性测定见表2，各浓度重复3次，每重复接虫24头表2，CrylAi敏感亚洲玉米螟的生物活性测定
7 对敏感亚洲玉米螟的生物活性测定结果显示CrylAi敏感亚洲玉米螟有高毒力。对敏感棉铃虫的生物活性测定见表3，各浓度重复3次，每重复接虫15头。活虫按 发育等级分类。表3CrylAi敏感棉铃虫的生物活性测定结果 对敏感棉铃虫的生物活性测定结果显示，CryIAi敏感棉铃虫的生物活性表现为高效抑制发育。实施例2CrylAi蛋白在转基因植物中的应用2-1 改造基因 mCrylAi根据CrylAi蛋白的杀虫活性区氨基酸序列设计合成了可以用于转基因植物开发 的DNA序列。去除了多聚腺苷酸化信号26个，GC含量提高了 11.5%。该序列具有GC含量 为48%的特征；含有利于植物表达的序列，命名为mCrylAi具体见SEQ NO. 3。在基因上游 添加了 Ω序列和Kozak序列，在基因3’端添加了内质网定位信号。该改造基因mCrylAi合成序列由组成型Ubiquitin启动子驱动，导入到水稻中，对 二化螟有较好的抗虫活性。序列中下划线为Ω序列，加粗的为Kozak序列，边框为KEDL内质网定位信号，上 游添加了 BamH I、HindIII、XbaI、XmaI、SmaI、NcoI，下游添加了 SacI、EcoRI 酶切位点，便 于载体构建。
丨III!
合成序列与原有核苷酸序列有84%的相似性。以下是比对结果。 Query :mCrylAi 序列如 SEQ NO. 3 Sbjct 原有cryIAi序列
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Sbjct 1261 gtaccacctcgtgcgggatttagccatcgattgagtcatgttacaatgctgagccaagca 1320 Query 1435 gctggagcagtctacaccttgagagcacccacgttctcttggcaacatcgcagtgccgag 1494
Sbjct 1321 gctggagcagtttacaccttgagagctccaacgttttcttggcagcatcgcagtgctgaa 1380 Query 1495 ttcaataacataatcgcgtcggatagcatcactcagatccctgcagtgaagggcaacttt 1554
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Sbjct 1381 tttaataatataattgcatcggatagtattactcaaatccctgcagtgaagggaaacttt 1440 Query 1555 cttttcaatggctctgtcatctcaggaccaggcttcactggtggggacttagttcggctc 1614
Sbjct 1441 ctttttaatggttctgtaatttcaggaccaggatttactggtggggacttagttagatta 15000179
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M 0181 0182
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Query 1615 aattcgagtggcaacaacattcagaaccgggggtacattgaggttcccattcacttcccg 1674
Sbjct 1501 aatagtagtggaaataacattcagaatagagggtatattgaagttccaattcacttccca 1560 Query 1675 tcgacctctaccaggtatcgagttcgtgtacggtatgcctctgtgaccccgattcacctc 1734
Sbjct 1561 tcgacatctaccagatatcgagttcgtgtacggtatgcttctgtaaccccgattcacctc 1620 Query 1735 aacgtcaattggggcaactcgtccattttctccaacacagtaccagccacagccacgtca 1794
Sbjct 1621 aacgttaattggggtaattcatccattttttccaatacagtaccagctacagctacgtca 1680 Query 1795 ctcgacaacctgcaatcgagcgacttcggctacttcgagagtgccaatgccttcacgtct 1854
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Sbjct 1861 cagaaggcggtgaatgcgctgtttacgtctacaaaccaactagggctaaaaacaaatgta 1920 Query 2035 acgga 2039
Illll
Sbjct 1921 acgga 1925 2-2植物表达载体构建
用BamH I和Sac I双酶切中间载体p3300_Ubi，将回收的载体片段分别与用同样 两个限制性内切酶消化的cryIAi片段相连，构建流程见图4，酶切鉴定(图5)证明植物表 达载体PUlAi构建成功，该载体含有由组成型启动子Ubiquitin驱动的cryIAi基因，筛选 标记为bar基因。2-3玉米遗传转化2-3-1玉米的控制授粉
12
(1)玉米抽雄后，用大口袋套住雄穗，下面用别针别住，收集花粉；(2)雌穗花丝未抽出前，用小口袋将其套住，并用大头针别好；(3)在授粉的前一天，当花丝伸出约2cm长时，用剪刀剪去花丝的顶部，促进其伸 长；(4)第二天，当花丝伸长后，依下列组合进行授粉(前为母本，后为父本)齐31 X 综31 ；(5)授粉后系上小牌，写上授粉的品种和日期，10 12天后收获；2-3-2幼胚的剥离和培养(1)将新收获的玉米雌穗去掉苞叶、花丝，花丝一定要去干净，可用酒精灯将未除 净的花丝烧去；用小刀去掉雌穗的头尾部分；
Tween20
(2)将雌穗浸在70%乙醇中灭菌30sec；
(3)将雌穗取出，浸在2.5%的次氯酸纳中灭菌10 15min，可以在溶液中加几滴
(4)用灭菌水清洗3次，用滤纸擦去残留的水珠，置于无菌的环境中备用；
(5)将一只枪式镊子从顶部插入雌穗，用左手持住镊子，右手用装有#21刀片的手 术刀切去籽粒的上半部分；(6)换上#10刀片，将刀尖插入籽粒下部的果皮与胚乳之间，将胚乳挑出；(7)用刀尖将粘在胚乳顶部或顶部果皮内的幼胚转移到诱导培养基上，操作要小 心，不要损伤幼胚。放置时注意胚轴(较平的一面)向下，盾片向上，每皿约放置20 30 个；(8) 27 28°C暗培养3 4周，使之开始脱分化，形成愈伤组织；此后，选择生长迅 速、质地松脆、颜色鲜亮的愈伤组织继代培养，每2 3周继代一次，选择生长良好的愈伤准 备基因枪转化；(9)在射击前4hr，将切成小块的愈伤转移到含0.4M甘露醇的高渗培养基上；(10)射击后，使愈伤在高渗培养基上继续培养过夜，然后转移到诱导培养基上，恢
复培养一周。2-3-3用基因枪进行玉米转化
干)；
(1)打开超净台，用70%乙醇擦拭超净台内部和基因枪的表面及内部；
(2)打开紫外灯，灭菌30min；
(3)按前述步骤准备微弹；
(4)易裂片、微弹载体、阻拦网灭菌(置于70%乙醇中l.Omin，放在滤纸上自然风
(5)打开气瓶，调节压力至2，OOOpsi；
(6)按前述方法安装微弹载体和微弹；
(7)将易裂片、阻拦网和微弹载体安装进固定装置中；射击参数为Gap distance :20mm ；微弹载体飞行距离(Macroprojectile flight distance) :10mm;微弹飞 ^fS&m (Particle flightdistance) :7cm ;J￡力:1, 350psi ；^2SiS :25inches Hg.；
(8)把培养皿放在托盘上，使愈伤都集中在托盘中间的圆圈内，将托盘插入倒数第 二档；
(9)打开基因枪的电源；(10)打开真空泵；(11)关闭基因枪的门，按下“抽真空”键(Vac)，当真空表读数达到25incheS Hg.时，使键置于“保持(Hold) ”档；(12)按下“射击(Fire)，，健直到射击结束；(13)按下“放气”健，使真空表读数归零；(14)打开基因枪门，取出培养皿，盖好盖子并用封口膜封好；(15)重复上述步骤，直至完成转化。2-3-4转化愈伤组织的筛选和植株的再生(1)将转化后的愈伤组织置于黑暗中，28°C培养过夜，然后转移到N6诱导培养基 上培养5 7天；(2)将愈伤转移到筛选培养基上(含PPT20mg/L)，两周继代一次，选择色泽正常、 分化良好的愈伤，弃去衰老死亡的愈伤。每皿的培养物不宜过多，愈伤块应尽量小些，并使 愈伤紧贴培养基；(3)继代3 4次后，将愈伤移至N6分化培养基上，在光周期为亮/暗=16/8， 28°C条件下培养，每两周继代一次；(4)将发生绿芽的愈伤组织切分；(5)当小植株长到1 2cm高时，转移进三角瓶中(含MS生根培养基)继续培养；(6)3 4叶期且根系较发达时，将小苗移入小花盆中，移入温室培养；二周后移入 大花盆，直至开花结实。2-4转基因植株的PCR检测2-4-1转基因植株基因组DNA的提取-SDS法1)称取0. 2g的叶片放入1. 5ml离心管，用液氮充分研磨成粉末。2)加入 500μ1 SDS-BufferdOOmM Tris, 50mM EDTA, 500mM NaCl，pH 8.0)，混勻。 3)再加入20 μ 1 20% SDS，轻轻混勻后置于65°C水浴10分钟。4)加入250 μ 1 5Μ KAC,混勻，冰上放置30分钟。5)4°C离心，12000rpm, 10 分钟。6)取上清，移入新的离心管中，加入等体积的异丙醇中，冰浴5分钟。7)4°C离心，12000rpm, 10 分钟。8)弃上清，70%乙醇洗涤两次，真空干燥DNA后，加入40 μ 1无菌双蒸水溶 解，-20°C保存备用。PCR检测
反应体系40 μ 1
10XPCR buffer4μ 1
dNTPs(2. 5mM)3. 2μ 1
引物对(10 μ Μ)各 1· 6μ 1
模板1 μ 1
Taq 聚合酶(5U/y 1)0. 4μ 1
超纯水补至40 μ 1PCR反应条件94°C 预变性 5min 72°C延伸 IOmin16 °C Imin 终止反应检测引物JclAiF GTTTCTGTTGAGCGAGTTTGTTCCJclAiR CACAGCATAGTCGGTGTAGTTGCC经过抗性筛选得到15株抗性植株，提取抗性植株基因组，以其做模板，进行PCR检 测，共得到6株PCR阳性植株(图6)。提取PCR阳性植株可溶性蛋白，1号植株CrylAi蛋 白的含量最高可占总可溶蛋白的0. 23 %。(图7是改造mCry IAi表达蛋白在可溶性蛋白中 所占比例图)PCR阳性植株的生物活性测定将PCR阳性植株移栽，当植株生长到6 8叶时，将玉米螟初孵幼虫接于心叶中， 以未转化植株作为阴性对照，接虫2周后调查食叶级别见表4。结果显示，人工接虫玉米螟 后，转基因植株单株间的抗虫性表现有一定差异转基因植株对玉米螟表现为抗性，没有或 只有很小的玉米螟危害的虫孔(图8，未转化植株被玉米螟咬食严重，叶片虫孔大且虫孔数 目多，已影响到植株的正常生长。 附录SEQUENCE LISTING<110>中国农业科学院植物保护研究所<120>苏云金芽孢杆菌crylAi在抗虫中的用途、改造的mcrylAi基因及应用<130>P09478/ZWB<160>3<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>3546<212>DNA
tcaaaattaattagaagtttggttccttattgtgcaccactgtgcgcatcgaggatttagggaaatctagaaagcggagatataaagaggcaaacggatagaagcgtattttagaaggtcggagatttcacaaaacaaccgttcgtgtctggagagggctaactgtgtagactcaagaaggaaagcaattgatggacgaaccagctggctgagatcggaggaatag<210>2<211>1181<212>PRT<213>crylAi全长基因编码的氨基酸序列<400>21METAspAsnAsnProAsnIIeAsnGluCysIleProTyrAsnCysLeuSerAsnProGlu21 ValGluValLeuGlyGlyGluArgIIeGluThrGlyTyrThrProIIeAspIIeSerLeu41 SerLeuThrGlnPheLeuLeuSerGluPheValProGlyAlaGlyPheValLeuGlyLeu61 ValAspIIeIIeTrpGlyIlePheGlyProSerGlnTrpAspAlaPheLeuValGlnlIe81 GluGlnLeulleAsnGlnArglleGluGlupheAlaArgAsnGlnAlaIleSerArgLeu101 GluGlyLeuSerAsnLeuTyrGlnlleTyrAlaGluSerPheArgGluTrpGluAlaAsp121 ProThrAsnProAlaLeuArgGluGluMETArglleGlnPheAsnAspMETAsnSerAla141 LeuThrThrAlalleProLeuPheAlaValGlnAsnTyrGlnValProLeuLeuSerVal161 TyrValGlnAlaAlaAsnLeuHisLeuSerValLeuArgAspValSerValPheGlyGln181 ArgTrpGlyPheAspAlaAlaThrIIeAsnSerArgTyrAsnAspLeuThrArgLeuIIe201 GlyAsnTyrThrAspTyrAlaValArgTrpTyrAsnThrGlyLeuGluArgValTrpGly
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17
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苏云金芽孢杆菌cry1Ai基因在抗鳞翅目害虫中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，是将苏云金芽孢杆菌cryIAi基因表达的晶体蛋白用于 杀灭鳞翅目害虫。
3.根据权利要求1所述应用，是将上述基因转入到微生物或植物，使之表达对鳞翅目 害虫的毒性蛋白。
4.一种改造的mcryIAi基因，其具有如SEQ NO. 3所述的核苷酸序列。
5.权利要求4所述的改造的mcryIAi基因在抗鳞翅目害虫中的应用。
6.根据权利要求5所述应用，是将上述基因转入到微生物或植物，使之表达对鳞翅目 害虫的毒性蛋白。
全文摘要
本发明涉及“苏云金芽孢杆菌cry1Ai在抗虫中的用途、改造的mcry1Ai基因及应用”，属于生物技术领域。苏云金芽孢杆菌cry1Ai对鳞翅目害虫具有高毒力，根据Cry1Ai蛋白的杀虫活性区氨基酸序列设计合成了的改造基因mcry1Ai序列，更有利于植物表达，表达量最高可占总可溶蛋白的0.23％。
文档编号C12N15/32GK101926365SQ200910241558
公开日2010年12月29日 申请日期2009年11月26日 优先权日2009年11月26日
发明者何康来, 宋福平, 张 杰, 束长龙, 粱革梅, 黄大昉 申请人:中国农业科学院植物保护研究所