专利名称：一种利用生殖结节器官培养建立体外尿道下裂模型的方法
一种利用生殖结节器官培养建立体外尿道下裂模型的方法技术领域：
本发明涉及一种器官培养物的应用，尤其涉及利用生殖结节器官培养建立体外尿
道下裂模型。背景技术：
尿道下裂是一种常见的先天性畸形，是由于尿道发育不全而致的尿道开口异常， 可位于阴茎至会阴部尿道行经的任何部位，导致患者排尿障碍，阴茎发育不良、阴茎屈曲畸 形、包皮发育异常等，对患者的生理和心理都会产生一定程度的影响。 尿道下裂在男性新生儿中的发病率达1/125 1/250，我国的发病率为3/1000。近 年来，尿道下裂发病率不明原因地增加了一倍，引起了国外健康机构和专家的关注，美国已 启动了这方面的研究。近几年来，我国的一些学者也逐渐开始了对该疾病的研究。目前尿 道下裂动物模型建立的方法多种多样，没有一个公认的标准。建立理想的尿道下裂动物模 型，对研究该病的病因和发病机制至关重要。现在已建立的尿道下裂动物模型，主要是在孕 期给予母鼠药物干预，导致仔鼠发生先天性尿道下裂。目前常用的药物包扩干扰内分泌因 素的药物，雌激素类、孕激素和抗雄激素等；皮质类固醇类药物，强的松等；还有抗组胺类 药物，氯雷他定等和环境中的内分泌活性药物，临苯二甲酸二丁酯、DDT等。
上述不同类型的动物模型，所选动物的种类、诱导尿道下裂发生所用的药物、药物 的剂型、剂量、给药途径、给药时间和频率等都没有一个统一的标准。目前研究报道的尿道 下裂动物模型缺乏标准化，每一项研究都只能代表某一种特定条件下的尿道下裂，从而使 得所有研究难以在一个相同的标准下进行横向比较。 此外，动物实验，阴茎和尿道的发育深藏于子宫内，不易观察，机体内存在的复杂 内分泌环境也很难阐明其机制。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用生殖结节器官培养建立体外尿道下裂模型的方法
及其利用该方法培养建立的体外尿道下裂模型。 为实现上述目的，本发明公开以下技术方案 —种利用生殖结节器官培养建立体外尿道下裂模型的方法，将雄性生殖结节置于 亲水性PTFE膜器官型细胞培养皿中培养，所用培养液为BGJB，同时加入双氢睾酮和17-13 乙炔基雌二醇； 所述雄性生殖结节为受孕14. 5天的胚胎生殖结节； 所述双氢睾酮和17-P乙炔基雌二醇的用量为质量比1 : 10;所述双氢睾酮的用量为10nM，所述17-13乙炔基雌二醇的用量为100nM。 利用上述方法即可培养得到所需的体外尿道下裂模型。 高浓度雌激素对在体外培养的生殖结节的生长具有明显的抑制作用。在10nM双 氢睾酮和100nM 17-13乙炔雌二醇条件下培养72小时后，生殖结节的长度和表面积分别增
3加了 20. 1%，23. 8% ;而在无17-13乙炔雌二醇培养条件下，生殖结节的长度和表面积分别 增加了 42. 0%，45. 5%。因此乙炔雌二醇诱导的尿道下裂模型，其生长被显著抑制，明显低 于无雌激素培养的生殖结节。如图1所示，lOOnM雌激素处理的生殖结节基底部包皮生长明 显受抑，尿道外口 (Me)的延伸受到阻碍，还停留于结节干腹侧中段，而无雌激素组尿道外 口已到达生殖结节顶端，包皮发育良好，包绕结节干生长并向远端延伸，整个生殖结节已有 出生后阴茎的雏形。 本发明提供的生殖结节器官培养模型，该尿道下裂模型冠状面HE染色表现为如 图2所示，整个尿道仍呈实性细胞索，上皮增生不良，排列混乱，细胞形态较圆，与培养前受 孕14.5天的类似。而体内正常发育和单纯加入雄激素培养的生殖结节尿道近端出现明显 的管化趋势，尿道上皮细胞增生明显，形成分层的复层上皮结构，细胞呈现立方形的成熟分 化表现。 本发明的积极效果 本发明采用生殖结节体外培养，加以雌激素诱导，建立器官水平的尿道下裂模型， 这一模型有利于为建立标准化的尿道下裂模型起到良好的示范作用。该模型造模成功率 高，重复性好，应用价值高，值得推广。
图1为生殖结节器官培养尿道下裂模型生长情况图 图中A为培养前的生殖结节，B为单纯双氢睾酮培养的生殖结节，C为雌激素干预 建立的尿道下裂模型； 图2为生殖结节器官培养尿道下裂模型尿道发育情况图 图中A为培养前的生殖结节，B为体内发育的17. 5d生殖结节，C为单纯双氢睾酮
培养的生殖结节，D为雌激素干预建立的尿道下裂模型； 图3为生殖结节的获取及培养图； 图4为胎鼠性别鉴定，性腺解剖示意图 图中A、B为雌性，C、D为雄性，t为卵巢，A为睾丸。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的技术方案做详细说明。
1.生殖结节的切取 每个孕鼠体内平均有6 10个胚胎，呈串珠状排列，解剖显微镜下切开胎膜，即可 见胚胎。如图3所示，于会阴部两后腿之间脐血管根部下方可见局部隆起样生殖结节，受孕 14. 5天胚胎生殖结节约长0. 5 0. 8mm，结节腹侧有尚未闭合的尿道沟。在生殖结节根部 用膜状内障剪迅速切下生殖结节，保证切缘光滑平整，将离体的生殖结节转移至培养皿中， 使生殖结节位于气液交界处。
2.性别鉴定 对每个胎鼠进行性别鉴定，生殖结节切下后即刻解剖性腺，如图4所示，见到睾丸 者为雄性，见到卵巢者为雌性，鉴定成功率达到90% 。
3.激素诱导尿道下裂模型
4
将步骤2中鉴定的雄性胎鼠的生殖结节，置于30mm Millicell-CM亲水性PTFE膜 器官型细胞培养皿中培养。在BGJB培养液(Gibco公司，货号12591)中加入10nM双氢睾酮 (International Library公司，货号IL1050632)和100nM的17-P乙炔基雌二醇(sigma 公司，货号E1024)，在5% C02， 37t:条件下培养，每24小时换液一次，培养3天即可造模成 功，以单纯10nM双氢睾酮培养为对照判断造模是否成功。 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围。
权利要求
一种利用生殖结节器官培养建立体外尿道下裂模型的方法，其特征在于，将雄性生殖结节置于亲水性PTFE膜器官型细胞培养皿中培养，所用培养液为BGJB，同时加入双氢睾酮和17-β乙炔基雌二醇。
2. 根据权利要求1所述的利用生殖结节器官培养建立体外尿道下裂模型的方法，其特 征在于，所述雄性生殖结节为受孕14. 5天的胚胎生殖结节。
3. 根据权利要求1所述的利用生殖结节器官培养建立体外尿道下裂模型的方法，其特 征在于，所述双氢睾酮和17-13乙炔基雌二醇的用量为质量比1 : 10。
4. 根据权利要求3所述的利用生殖结节器官培养建立体外尿道下裂模型的方法，其特 征在于，所述双氢睾酮的用量为10nM，所述17-13乙炔基雌二醇的用量为100nM。
5. 利用权利要求1-4中任一方法培养的体外尿道下裂模型。
全文摘要
本发明公开了一种利用器官培养物建立尿道下裂模型的方法以及利用该方法培养得到的体外尿道下裂模型。利用雌激素干预体外培养的生殖结节，该模型的病理表现与目前公认的小鼠尿道下裂动物模型表现相同，生殖结节生长受到明显抑制，整个尿道仍呈实性细胞索，尿道管化不明显，上皮增生不良，排列紊乱。该模型的建立避免了在尿道发育相关研究过程中动物实验花费高、实验周期长和研究结果易受体内神经-内分泌因素影响的特点。该模型造模成功率高，重复性好，应用价值高，值得推广。
文档编号C12N5/07GK101792733SQ20091024805
公开日2010年8月4日 申请日期2009年12月31日 优先权日2009年12月31日 公开号200910248051.发明者周娟, 王 忠, 王浩, 陈其, 马利民 申请人:上海交通大学医学院附属第九人民医院