专利名称：一种非接触共培养诱导干细胞体外定向分化的方法
技术领域：
本发明涉及干细胞组织工程领域，具体地说是一种非接触共培养诱导干细胞体外 定向分化的方法。
背景技术：
干细胞是来自于胚胎、胎儿或成体内，在特定的条件下具有一定的自我更新与增 殖分化能力的一类细胞，该类型细胞不但能够产生表现型与基因型与自身完全相同的子细 胞，而且能产生组成机体组织、器官的已特化的细胞，同时还能分化为祖细胞，因此干细胞 是修复体内受损组织的理想种子细胞，在细胞治疗、外科整形及组织工程等方面都具有极 其重要的研究和临床应用价值。根据发生学来源干细胞可分类为胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)和成 体干细胞(adult stem cell, ASC) 0胚胎干细胞(ESC)是指当受精卵分裂发育成囊胚时 内细胞团的细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性，是一种高度未分 化细胞，具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞[文献1 Thomson JA,Itskovitz-Eldor J，Shapiro SS，et al. Embryonic stem cell lines derived fromhuman blastocysts. Science，1998，282 :1145-1147.]。成体干细胞(ASC)是指存在于一种已分化组织中的未分化细胞，能够自我更新并 且能特化形成该类型组织的细胞。ASC存在于机体的各种组织器官中，包括骨髓间充质 干细胞、造血干细胞、神经干细胞、肝干细胞、皮肤表皮干细胞、肠上皮干细胞、视网膜干细 胞、胰腺干细胞等[文献 2:JiangY，Jahagirdar BN, Reinhardt RL, et al. Pluripotency of mesenchymal stem cellsderived from adult marrow. Nature,2002,418 :41-49. 文献 3 :Bjornson CR, Rietze RL, Reynolds BA, et al. Turning brain into blood :a hematopoietic fateadopted by adult neural stem cell in vivo. Science,1999,283 534-537.文献 4 :Dor Y, Brown J, Martinez 01 et al. Adult pancreatic beta-cells are formed byself-dulplication rather than stem-cell differentiation. Nature，2004，4 :41_46.]。在多数情况下，成体干细胞可分化为与其组织来源一致 的细胞，但是在某些情况下，ASC则表现出很强的跨系或跨胚层分化的能力，即横向分 化(trans-differentiation)[文 献 5 Krause DS, Theise ND, Collector MI, etal. Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone-marrow derivedstem cell.Cell,2001,105 :369-377.文献 6 :Clarke DL, Johansson CB, WilbertzJ, et al. Generalized potential of adult neural stem cells.Science,2000,288 1660-1663.]干细胞的分化主要受到生长微环境的调控，体内正常组织微环境可以诱导干细 胞向特定组织细胞类型定向分化并整合为组织。而将干细胞直接植入受损组织时，其修 复的效果不理想，并常伴有并发症。这是由于受损组织的微环境已被破坏，干细胞识别此 微环境的能力下降，定向分化效率降低。另外，由于干细胞可多向分化，直接将其植入体内还可能产生肿瘤。因此，干细胞在植入人体之前，应在体外先进行定向诱导分化，以提 高其在体内向受损组织类型分化的效率，并降低临床应用的风险[文献7:Li X, Yu X， Lin Q，et al. Bone marrow mesenchymal stem cells differentiate intofunctional cardiac phenotypes by cardiac microenvironment. Journal ofMolecular and Cellular Cardiology. 2007，42 :295-303.]。目前诱导干细胞体外定向分化的方法主要有(1)条件培养液诱导[文献8
EJ, Hong SH, Jeong JA, et al. In vitro mesengenic potential of humanumbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells.Biochemical andBiophysical Research Communications. 2004,321 :102-108. ] ； (2)诱导细胞和干细胞直接接触共培养诱导[文献 9 :0ng SY, Dai H, Leong Kff. Inducinghepatic differentiation of human mesenchymal stem cells in pellet culture. Biomaterials. 2006,27 :4087-4097. ] ； (3)诱导细胞和干 细胞transwell膜分离共培养诱导[文献7]。但上述方法分别存在如下问题(1)条件培 养液含有的化学试剂具有一定的毒性，可使干细胞发生变异，增加临床应用的风险；(2)直 接接触共培养将诱导细胞和干细胞在同一个培养体系中混合在一起，干细胞不能彻底和诱 导细胞分开，因此存在着干细胞分离纯化困难、免疫安全性差、容易引起病毒传播等问题， 不适合临床应用；C3)尽管Transwell膜分离共培养方式通过半透膜将诱导细胞和干细胞 隔开，两种细胞不直接接触，但是Transwell体系基于M孔板或6孔板，规模很小，且半透 膜的作用面积有限，存在严重的物质浓度梯度，不适合大规模诱导干细胞细胞体外定向分 化。因此，需要进一步发展生物安全性好、适合大规模干细胞体外定向诱导分化的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种非接触共培养诱导干细胞体外定向分化的方法，其既 能实现干细胞向诱导细胞类型体外定向分化，同时又能将干细胞和诱导细胞进行免疫隔 离，有利于目的细胞的回收和应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种非接触共培养诱导干细胞体外定向分化的方法，将具有诱导分化功能的诱导 细胞包埋在生物微胶囊中，将该微胶囊再与外部不同生长方式的干细胞进行共培养，通过 微胶囊内诱导细胞的定向诱导作用，实现干细胞的定向诱导分化(图1)。所述生物微胶囊为海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊或海藻酸钠/壳聚糖微胶囊。采用 静电液滴法、气流喷射法等制备包埋有诱导细胞的海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊或海藻酸钠 /壳聚糖微胶囊等。通过体外高密度三维生长，使得微胶囊内诱导细胞保持其功能，持续分 泌诱导因子，诱导细胞分泌的诱导因子透过微胶囊膜作用于微胶囊外部的干细胞，诱导干 细胞向目的细胞类型或三维组织定向分化；微胶囊对干细胞和诱导细胞进行了免疫隔离， 利于回收目的细胞。与微胶囊共培养的干细胞的培养方式为常规二维生长方式、或在生物支架材料中 的三维生长方式。所述干细胞为多来源干细胞，包括胚胎干细胞或成体干细胞。所述诱导细胞为多来源体细胞、转基因细胞或细胞株；其中，多来源体细胞是指从 动物或人的各种组织中通过分离、培养而得到的已分化成熟的细胞；转基因细胞是指导入了人工修饰基因的细胞，该细胞能够表达所修饰基因的特定功能；细胞株是指通过选择法 或克隆形成法获得的具有特殊性质或标志物的克隆化细胞群。所述诱导细胞和干细胞可以是同源同种细胞、同源异种细胞、异源异种细胞。所述共培养方式为静态共培养或于生物反应器中的动态共培养。所述干细胞定向诱导分化后可为目的细胞或三维组织，目的细胞是指单细胞，三 维组织是指由细胞、三维支架所形成的三维组织。本发明具有如下优点1.操作简单，实现干细胞体外定向诱导分化。本发明利用微囊化诱导细胞分泌的 生长因子促进微胶囊外部的干细胞体外定向分化，干细胞与诱导细胞被免疫隔离，不直接 接触，有利于目的细胞的分离和应用。2.生物微胶囊所提供的特殊生长环境，能够实现诱导细胞体外高密度三维生长， 有利于诱导细胞保持其功能，持续分泌生长因子作用于外部的干细胞。3.生物微胶囊能够将干细胞和诱导细胞进行免疫隔离，避免了两者的免疫反应， 可以使用一种或多种异体、异源的诱导细胞(体细胞、转基因细胞以及细胞株)进行诱导， 且共培养结束后微囊化诱导细胞可以被去除，从而与目的细胞彻底分离，更好地保证了临 床应用的安全性。4.由于生物微胶囊体积小，密度低，表面积大，容易悬浮，可在生物反应器中实现 三维动态共培养模式，利于规模化放大。5.应用范围广。由于微胶囊的免疫隔离特性，本发明方法可使用多来源异体、异种 的诱导细胞(体细胞、转基因细胞以及细胞株)进行诱导；可促进多来源干细胞体外定向分 化，分化的目的细胞类型可包括成骨、心肌、神经、软骨、肝等，进一步加速受损组织的修复 和治疗，扩大了其临床应用前景。总之，本发明能够诱导干细胞体外定向分化为特定细胞类型或三维组织，同时能 够彻底分离开干细胞和诱导细胞。生物微胶囊能够良好地保持诱导细胞的功能和活性，其 免疫隔离特性使得可使用多来源异体、异种的诱导细胞，其可悬浮的特性也适于在生物反 应器等动态条件下进行诱导。由于具备以上优点，使得该实验方法在受损组织的临床治疗 研究中将发挥重要作用。
图1为非接触共培养诱导干细胞体外定向分化示意图，包括干细胞二维生长方式 (A)和在支架材料中的三维生长方式(B)；图2为微囊化BMP-2基因转染的CHO细胞和SD大鼠骨髓间充质干细胞共培养第 14天时，共培养组(A)和对照组(B)碱性磷酸酶ALP染色结果，共培养组ALP呈强阳性，对 照组则为弱阳性；图3为微囊化BMP-2转基因细胞和骨髓间充质干细胞共培养的第0、7、10、15天 时，相同数量的共培养组的被诱导细胞、对照组的骨髓间充质干细胞及第3代成骨细胞胞 浆内ALP酶活性定量检测结果，共培养过程中共培养组ALP酶活性逐渐接近于成骨细胞，并 明显高于对照组；图4为微囊化BMP-2转基因细胞和骨髓间充质干细胞共培养第沈天时，共培养组(A)和对照组(B)钙化结节(Von Kossa)染色结果，共培养组出现了钙沉积，对照组则不明 显；图2、3、4的实验结果说明微囊化BMP-2转基因细胞能够诱导骨髓间充质干细胞体 外定向分化为成骨细胞。图5为微囊化人心肌细胞株HCM和小鼠胚胎干细胞共培养15天时，心肌蛋白 Troponin T(A)和desmin )的免疫组化结果，心肌蛋白表达为阳性，说明在微囊化HCM细 胞的诱导下胚胎干细胞已经体外定向分化为心肌细胞。图6为在旋转反应器中动态共培养20天时，支架材料中细胞的βΙΙΙ-tubulin和 Hoechst33342免疫荧光染色结果，β ΙΙΙ-tubulin染色为阳性，说明在微囊化SD大鼠嗅鞘 细胞的诱导下SD大鼠骨髓间充质干细胞已经体外定向分化为嗅鞘细胞，并具有良好的三 维组织结构。
具体实施例方式实施例1 非接触共培养诱导骨髓间充质干细胞体外定向分化为成骨细胞用静电液滴法制备包埋有BMP-2基因转染的CHO细胞的海藻酸钠-聚赖氨酸微 胶囊。将制备好的微胶囊加入到细胞培养液中，置培养箱中培养(见文献Optimization of the Seeding Density in MicroencapsulatedRecombinant CHO Cell Culture. Ying Zhang, Jing Zhou, Xulang Zhang, Weiting Yu, Xin Guo, Wei Wang, Xiaojun Ma. Chemical and BiochemicalEngineering Quarterly, 2008, 22 (1) :105-111)，每3 天定期更换培养液。将微囊化BMP-2转基因细胞与1 X 104cells/cm2的密度接种的二维贴壁培养的骨 髓间充质干细胞按上述培养条件共培养，将单独培养的骨髓间充质干细胞作为对照组，除 培养体系无微囊化BMP-2转基因细胞外其它条件与共培养组相同。在共培养的第0、7、10、 15天，将共培养组的被诱导细胞、对照组干细胞以及成骨细胞分别进行ALP酶活性的定量 检测；在共培养的第14天，将共培养组和对照组的贴壁细胞进行碱性磷酸酶ALP定性染色； 在共培养的第26天将共培养组和对照组的贴壁细胞进行钙化结节(VonKossa)染色。实验 结果见图2-4。结果显示，共培养组中的骨髓间充质干细胞已经向成骨细胞分化，与对照组 有显著性差异。实施例2 非接触共培养诱导胚胎干细胞体外定向分化为心肌细胞用气流喷射法制备包埋有人心肌细胞株HCM的海藻酸钠-壳聚糖微胶囊。将制备 好的微胶囊加入到细胞培养液中，置培养箱中培养，每3天定期更换培养液，培养条件同实 施例1。将微囊化HCM细胞与lX104CellS/Cm2的密度接种的二维贴壁培养的小鼠胚胎干 细胞共培养，在共培养的第15天将共培养体系中的贴壁细胞进行心肌蛋白Troponin T和 desmin的免疫组化染色。实验结果见图5。结果显示，共培养组中的小鼠胚胎干细胞已经 向心肌细胞分化，与对照组有显著性差异。实施例3 生物反应器中非接触共培养诱导骨髓间充质干细胞体外定向分化为三 维神经组织用静电液滴法制备包埋有SD大鼠嗅鞘细胞的海藻酸钠-壳聚糖微胶囊。将制备 好的微胶囊加入到嗅鞘细胞培养液中，置培养箱中培养，每3天定期更换培养液。培养条件同实施例1。将微囊化嗅鞘细胞与2X 106CellS/Cm3的密度接种的生长在三维壳聚糖支架中的 SD大鼠骨髓间充质干细胞共同接种到旋转式生物反应器中进行动态共培养，在动态共培养 的第20天，对支架材料中的细胞进行i3III-tubulin/H0echSt33342免疫荧光检测。实验 结果见图6。结果显示，共培养组中的骨髓间充质干细胞已经向嗅鞘细胞分化，与对照组有 显著性差异。本发明操作简单，允许使用一种或多种异体、异种的诱导细胞促进干细胞体外定 向分化，即微胶囊膜可以使诱导细胞分泌的诱导因子透过微胶囊作用于外部的干细胞，同 时又能将诱导细胞和干细胞进行免疫隔离，不直接接触，有利于不同细胞的分离和收获。本 发明不但在常规静态培养下能实现干细胞体外的定向诱导分化，还可以为生物反应器中动 态诱导干细胞定向分化为三维组织提供有效的诱导方法，在受损组织的临床治疗研究中将 发挥重要作用。
权利要求
1.一种非接触共培养诱导干细胞体外定向分化的方法，其特征在于将具有诱导分化 功能的诱导细胞包埋在生物微胶囊中，将该微胶囊再与干细胞进行共培养，通过微胶囊内 诱导细胞的定向诱导作用，实现干细胞的定向诱导分化(图1)。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于与微胶囊共培养的干细胞的培养方式为 常规二维生长方式、或在生物支架材料中的三维生长方式。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述干细胞为多来源干细胞，包括胚胎干 细胞或成体干细胞。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述诱导细胞为多来源体细胞、转基因细 胞或细胞株；其中，多来源体细胞是指从动物或人的各种组织中通过分离、培养而得到的已分化成 熟的细胞；转基因细胞是指导入了人工修饰基因的细胞，该细胞能够表达所修饰基因的特 定功能；细胞株是指通过选择法或克隆形成法获得的具有特殊性质或标志物的克隆化细胞群。
5.按照权利要求1或4所述的方法，其特征在于所述诱导细胞和干细胞可以是同源 同种细胞、同源异种细胞、异源异种细胞。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述共培养方式为静态共培养或于生物 反应器中的动态共培养。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述干细胞定向诱导分化后可为目的细 胞或三维组织，目的细胞是指单细胞，三维组织是指由细胞、三维支架所形成的三维组织。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述生物微胶囊为海藻酸钠/聚赖氨酸 微胶囊或海藻酸钠/壳聚糖微胶囊。
全文摘要
本发明涉及干细胞组织工程领域，是一种非接触共培养诱导干细胞体外定向分化的方法，将具有诱导分化功能的诱导细胞包埋在生物微胶囊中，该微胶囊再与干细胞进行共培养，通过微胶囊内诱导细胞的定向诱导作用，实现干细胞定向诱导分化。本发明操作简单，允许使用一种或多种异体、异种的诱导细胞促进干细胞体外定向分化，即微胶囊膜可以使诱导细胞分泌的诱导因子透过微胶囊作用于外部的干细胞，同时又能将诱导细胞和干细胞进行免疫隔离，不直接接触，有利于不同细胞的分离和收获。本发明不但在常规静态培养下能实现干细胞体外的定向诱导分化，还可以为生物反应器中动态诱导干细胞定向分化为三维组织提供有效的诱导方法，在受损组织的临床治疗研究中将发挥重要作用。
文档编号C12N5/077GK102102090SQ20091024845
公开日2011年6月22日 申请日期2009年12月16日 优先权日2009年12月16日
发明者于炜婷, 刘洋, 王为, 马小军 申请人:中国科学院大连化学物理研究所