专利名称：一种桦褐孔菌及从桦褐孔菌中提取三萜类物质的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种桦褐孔菌及从桦褐孔菌中提取三萜类 物质的方法。本发明所称的桦褐孔菌命名为桦褐孔菌(Inonqqus obliquusLNUF008)，已于 2009年11月24日在中国典型培养物保藏中心保藏，编号为CCTCC M 209280。
背景技术：
桦褐孔菌Inonqqus obliquus，国内还称为桦癌褐孔菌、斜生纤孔菌。属担子菌亚 门、层菌纲、非褶菌目、刺革菌科。桦褐孔菌的形态它的子实体呈现肿瘤状(不育性的块状物)，直径25 40cm，深 色，表面深裂，很硬，时脆。孢子阔椭圆状至卵状，光滑，有刚毛。菌丝为二系菌丝系统，具有 生殖菌丝和骨架菌丝。气生菌丝多为骨架菌丝，黄褐色，具有刚毛状菌丝和稀少刚毛；基内 菌丝多为生殖菌丝，淡黄褐色，有隔，无锁状联合。桦褐孔菌在俄罗斯、波兰、芬兰等地是一种应用很广泛的药用真菌，英文名chaga。 1955年，chaga被俄罗斯医学研究院用来治疗肿瘤，特别是消化系统和肺部肿瘤。16世纪 至今，东欧一些国家的民间就是用这种菌的菌核来防治癌症。西伯利亚的Khhanty人用这 种真菌来预防和治疗心脏病、肝病、胃病和食道疾病等。近期研究表明，桦褐孔菌能抑制艾 滋病等病毒(HIV-I)，抗辐射、并通过抑制蛋白质生物合成、抗有丝分裂及消除自由基活性 等作用机制来抑制或延缓肿瘤细胞的生长和防治0-157大肠杆菌中毒。但是，目前桦褐孔菌的使用主要以野生为主。野生的桦褐孔菌主要生长在俄罗斯 的西伯利亚地区、日本北海道、芬兰等地。在我国吉林长白上地区和黑龙江大小兴安岭地区 有野生桦褐孔菌生长。而采用野生直接使用，其有效成分利用率低。三萜类物质在医学上 具有很高的应用价值，现有从桦褐孔菌中提取三萜类物质，提取率较低。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种桦褐孔菌(Inonqqusobliquus LNUF008)，于中国典型培养物保藏中心保藏，编号为CCTCC M209280。以下简称桦褐孔菌 LNUF008。采用此菌，三萜类物质的提取率高。本发明的另一目的是提供一种从桦褐孔菌中提取三萜类物质的方法。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是一种桦褐孔菌，其特征在于桦褐 孔菌(Inonqqus obliquus LNUF008)，2009年11月24日于中国典型培养物保藏中心保藏， 编号为 CCTCC M 209280。本发明提供的桦褐孔菌LNUF008的筛选方法为自长白山野生林区采摘新鲜的桦褐孔菌子实体(直径22. 5cm)，在无菌间内分离 菌丝体。首先，从子实体上剜下直径5cm的块，以75%的酒精表面消毒lOmin，用无菌水冲 洗5 6次，0. 1 %的氯化汞表面消毒1 2min，用无菌水冲洗。用无菌刀将子实体块劈开，用无菌剪从中心菌肉处剜取直径0. 5cm小块，移至平皿培养基中，28°C培养5天。待长出菌落后，将菌落挑入斜面培养基中，培养7天，至斜面长满，得菌株LNUF008，将斜面于4 °C冰箱保存。菌株LNUF008的鉴定如下A.菌丝体外部形态观察结果将斜面中菌丝体接种至固体培养基平皿中央，28°C恒温培养10天，肉眼逐日观察 菌丝体外观形态变化。培养3天后，平皿中央菌块周围有白色绒状菌丝出现；培养5天后， 菌落不断扩展，菌丝白色但逐渐加粗；培养7天后，菌落扩展到平皿1/2，菌丝体逐渐匍匐 于培养基上，由白色逐渐变黄；培养10天后，菌落继续扩展，菌丝体由黄色向棕色转变，并 有模糊的环纹出现，菌落表面有菌孔，并出现黄褐色液珠，如
图1。从表面形态观察，此菌株 LNUF008与桦褐孔菌极为相似。B.菌丝体显微结构观察利用载玻片培养观察法对菌株LNUF008菌丝体进行观察。菌丝为二系菌丝系统， 具有生殖菌丝和骨架菌丝。气生菌丝多为骨架菌丝，初为白色，宽2. 5 4. 0 μ m，具有刚毛 状菌丝；基内菌丝体多为生殖菌丝，淡黄褐色，宽3.0 5.0 μ m，有隔，无锁状联合，如图1。C.菌株LNUF008的测序及进化树的制作菌丝体的DNA提取取0. Ig菌株LNUF008的菌丝体，在1. 5mL的Eppendorf管中 用研杵充分研磨后加入600 μ L 2XCTAB提取缓冲液(EDTA20mmol/L，Tris-HCl 1 OOmmo 1/ L，pH 8.0,NaCl 0. 7mol/L，CTAB 20g/L)，65°C水浴放置30min。加入等体积氯仿、异戊醇混 合液(V V = 24 1)充分摇勻，4°C下10，000r/min离心lOmin，转移上清液至新的1. 5mL 的离心管中，加入等体积的苯酚、氯仿和异戊醇(V V V = 25 24 1)。本步骤需重复 多次，直至处于中间的蛋白质相消失为止。移取上清液至一新的Eppendorf管中，加入10% 体积的3mol/L NaAc溶液(pH 6. 0)以及2. 5倍体积的冰冻乙醇，4°C下10，000r/min离心 5min，沉淀用 70%的酒精洗 2 3 次。晾干，加 TE(含 l(kimol/L Tris-HCl，lmmol/L EDTA PH 8.0)缓冲液，充分溶解后在_20°C下保存备用。测得的菌株LNUF008的ITS序列如下所示TCGAGGGGCCTGTGCTGGCACGGAAACGTTTGCATGTGCACGGCCTTTCGTGCTCAAATCCAACTCTCA AACCCCTGTGCACCTATACAAGTTGAAGGTCTTAGTAGTTTCTGTAATCGAACGGCAAGTCAAGTACGTCGAGTAAT CMGTACGAGGGTTTCGGGCCTTGGAAAGTGTGAAAGATGGAAAGGCAAGCTTCAGAGACAAGGAGACGAAAAGCTT TTGGCTTCATTACAAACACCAATATAATTGTTATGTGAATGAAATGCTCCTTGTGGGCGATAATAAATACAACTTTC AACAACGGATCTCTAGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAG TGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGTTAAT CTCAAATCGCTCGTCTATTCTTAATTGAAGTGGCTTTCGATTTGGACTTGGAGGTTTTGCTGGCCCGGGCGACTTTG GTTGCCCTTGGTTTGTCGGCTCCTCTCAAATACATTAGCTGGACTTTGGTTCGCGTTTACGGTGTAATAATGTAATG TTCACCAAGACGCTTGCCTAACAAGTCTGCTTCTAATAGTCCTTAAGTTGGACAAGGATCCCTTCGTTGGGCCTTCT T以上为PCR扩增后产物的测序结果，其全长为686个bp将测得的菌株LNUF008的ITS序列在GenBank序列库中做BLAST比对。结果显示， 本实验鉴定菌株 LNUF008 与 Inonotus Obliquus DQ103883 及 Basidiomycete sp FJ190414相似度为100%。在GenBank中搜索具有与之相似的序列的16株菌株如下
权利要求
一种桦褐孔菌，其特征在于桦褐孔菌(Inonqqus obliquusLNUF008)，于中国典型培养物保藏中心保藏，编号为CCTCC M 209280。
2.一种从权利要求1所述的桦褐孔菌中提取三萜类物质的方法，其特征在于步骤如下1)将权利要求1所述的桦褐孔菌(Inonqqusobliquus LNUF008)活化，制备种子液；2)发酵液制备种子液以发酵液体积2%的接种量接到发酵罐液体综合培养基中，发 酵温度为26 30°C，发酵时间为70 74小时，pH为6. 8 7. 2，通气量为0. 5 1. 0立 方米/小时，转速为400转/分钟，罐压为0. 1 0. 2兆帕；3)提取将发酵液抽滤，45°C干燥，抽滤出菌丝体，将菌丝体倒入研钵中，研磨成粉末 状，加入8 12倍体积的有机溶剂，浸泡24小时；于50°C，77KHz下超声破碎50 70分 钟；然后将混合液于5000转/分钟条件下离心10分钟，弃去沉淀，收集上清液，减压浓缩， 得目标产物。
全文摘要
本发明涉及一种桦褐孔菌及从桦褐孔菌中提取三萜类物质的方法。采用的技术方案是桦褐孔菌(Inonqqus obliquus LNUF008)，CCTCC M209280。利用此桦褐孔菌提取三萜类物质的方法如下经活化，制备种子液；以发酵液体积2％的接种量接到发酵罐液体综合培养基中，发酵，将发酵液抽滤，45℃干燥，抽滤出菌丝体，将菌丝体倒入研钵研磨成粉末状，加入10倍体积的有机溶剂，浸泡24小时；于50℃，77KHz下超声破碎60分钟；于5000转/分钟条件下离心10分钟，弃去沉淀，收集上清液，减压浓缩，得目标产物。本发明提取的三萜类物质含量高，回收率高，为大规模生产提供了可行性。
文档编号C12P15/00GK101933460SQ20091024861
公开日2011年1月5日 申请日期2009年12月22日 优先权日2009年12月22日
发明者刘宏生, 宋雅娜, 朱俊丰, 朱春玉, 艾海新, 郑方亮, 郭立雄 申请人:辽宁大学