专利名称：葛根黄豆苷元-7，4’-二氧代醋酸化合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，涉及一种葛根黄豆苷元-7，4’-二氧代醋酸(DZV)、包含该化合物的药物组合物及其医药新用途，特别是该化合物及其组合物在抗脑缺血、缺氧、心肌缺血、缺氧、拮抗记忆障碍、抗血小板聚集及抗血栓形成、保护缺氧所致大鼠皮层神经元损伤的药物中的应用。本发明还涉及利用葛根黄豆苷元制备水溶性衍生物葛根黄豆苷元-7，4’-二氧代醋酸化合物的合成方法。
背景技术：
葛根黄豆苷元是中药葛根及黄豆等豆科植物的有效成分，经大量药理和临床研究证明其具有明显的扩张冠状动脉、脑血管、外周血管和微血管，增加血管流量和循环，降低血管阻力降低胆固醇和血液粘度，增强心肌收缩力，减少心肌耗氧量以及β-肾上腺受体阻滞，异黄酮植物激素等作用。因而能有效预防治疗心血管类疾病，妇女更年期综合症和骨质疏松症等疾病。
但是黄豆苷元属于异黄酮类化合物，其自身的结构特点决定其存在一个比较大的缺点和不足，即水溶性极差，生物利用度低，因而限制了给药途径和剂型，极大影响了临床疗效和给药范围。因此，对葛根黄豆苷元进行局部修饰，在保留或增强药效的同时，改善其水溶性具有重要意义。
为了解决葛根黄豆苷元水溶性差的问题，人们试图通过对葛根黄豆苷元进行衍生来改善其水溶性。
CN1296947A公开了一些葛根黄豆苷元新衍生物。在其中公开的式I中，公开了在葛根黄豆苷元的7，4’位上用含1-4个碳原子的羧酸基及其相应的酯对葛根黄豆苷元进行衍生获得的衍生物。但是，该申请并没有具体给出本发明的化合物。而在葛根黄豆苷元的7，4’位上存在二氧代醋酸基团时可显著提高母体化合物的水溶性。
CN101255149A公开了一种7，4’-二(琥珀酸单酯)氧乙氧基-葛根黄豆苷元(DZ5)，但是，该发明化合物的性能不显著。
发明内容
本发明的目的在于提供一种葛根黄豆苷元新衍生物葛根黄豆苷元-7，4’-二氧代醋酸化合物，其与葛根黄豆苷元相比较，水溶性大，生物利用度高，且其药理活性大，毒副作用小，可以用于制备一种新型预防和治疗心脑血管系统疾病的药物，用于治疗隐性心脏病、心绞痛、心肌梗塞、心肌硬化、心源性猝死和脑中风等。
本发明所应用的葛根黄豆苷元-7，4’-二氧代醋酸化合物是以葛根黄豆苷元为母体，采用半合成的方法进行7，4’位取代而成的葛根黄豆苷元新衍生物。结构通式如下
其中R1和R2可以相同或不同，并彼此独立地选自H、金属离子、有机阳离子、碱性氨基酸阳离子、C1-C10烷基，并优先地选自H+、Na+、K+、Li+、Mg2+、Al3+、Fe2+、Fe3+、Ca2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Ba2+、Sn2+、赖氨酸、精氨酸、组氨酸，NH4+，甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、戊基、异戊基、已基、庚基。R3和R4可以相同或不同，并彼此独立地选自H或C1-C10烷基，并优先选自H、甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、戊基、异戊基、已基、庚基。
本发明的合成方法步骤如下 (1)在500ml圆底烧瓶中，加入葛根黄豆苷元2.54g，无水碳酸钾2.76-13.8g，碘化钾0.02-3.32g，一氯乙酸乙酯2.45-6.13g，加入有机溶剂10-200ml中，30℃-100℃水浴反应2-15h，蒸馏去掉有机溶剂，水洗，滤过，烘干； (2)取上述化合物溶于无水乙醇10-100ml中，加入等摩尔量的酸，于0℃-100℃水浴下水解，得到目标化合物，过滤，干燥，用80％乙醇重结晶。
在获得游离酸形式的该化合物后，本领域技术人员可以用本领域公知的方法将其转化成各种碱加成盐或酯。
本发明方法中，步骤(1)所用的有机溶剂可以使用极性溶剂或非极性溶剂，最好使用经过干燥的溶剂。如四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮、吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、三氯甲烷等。
本发明人通过小鼠常压耐缺氧实验模型、小鼠急性脑缺血实验模型、小鼠KCN中毒实验模型、小鼠NaNO2中毒实验模型、学习记忆实验模型、小鼠双侧颈总动脉及迷走神经结扎实验模型、对缺氧所致大鼠皮层神经元损伤的作用模型、对垂体后叶素所致大鼠心肌缺血的影响模型、体外抗血小板聚集实验(比浊法)模型、体内抗血小板聚集实验(比浊法)模型、对家兔颈总动脉血栓形成的影响模型等对DZV进行药理活性研究。
为了表明本化合物意想不到的优良效果，本发明将其与葛根黄豆苷元水溶性衍生物7，4’-二(琥珀酸单酯)氧乙氧基-葛根黄豆苷元(DZ5)、葛根黄豆苷元-7-氧代醋酸(DZd)、葛根黄豆苷元-7，4’-二氧代丙酸(DZe)进行了比较。结果表明，DZV能显著延长断头小鼠喘气时间，使KCN中毒小鼠生存时间显著延长，提示该药具有抗急性脑缺血，降低脑耗氧耗能的作用。此外，该药能拮抗东莨菪碱所致的小鼠记忆障碍，具有增强记忆的作用。DZV还能显著延长常压耐缺氧条件下和异丙肾上腺素诱导急性心肌缺氧模型小鼠的存活时间，并能有效的对抗异丙肾上腺素引起心肌耗氧量增加而导致的心肌缺血缺氧，改善心功能。血小板聚集实验结果表明DZV可显著抑制AA诱导的血小板聚集，从而抑制血小板的活化，起到抗血栓形成的作用。同时，还具有保护缺氧所致大鼠皮层神经元损伤的作用。且其各项药理指标在相同剂量下均优于或相当于其他衍生物。
本发明还考察了DZV的毒性并与DZ5进行比较，并考察了DZV在大鼠体内的药动学参数，为临床应用提供帮助。
本发明的另一个目的是提供一种含有DZV和药学可接受载体或赋形剂的药物组合物。所述的药物组合物具有抗脑缺血、缺氧，心肌缺血、缺氧，拮抗记忆障碍，抗血小板聚集及抗血栓形成，保护缺氧所致大鼠皮层神经元损伤等作用。
与现有技术中化合物相比，本发明的化合物水溶性大，生物利用度高，药理活性大，毒副作用小，性能显著提高，且其制备方法简单，重现性好。
图1为黄豆苷元-7，4’-二氧代醋酸钠(水)的紫外扫描图谱 图2为黄豆苷元-7，4’-二氧代醋酸钠的红外图 图3为黄豆苷元-7，4’-二氧代醋酸钠的质谱图 图4为黄豆苷元-7，4’-二氧代醋酸钠的13C-NMR谱 图5为黄豆苷元-7，4’-二氧代醋酸钠的1H-NMR谱
具体实施例方式 通过下面实施例详细说明本发明。但是应该理解这些实施例只是说明本发明，而不是在任何方面限制本发明的范围。
本实验中化合物熔点测定用Shimadzu DSC-60 differential scanningcalorimeter；核磁共振采用Bruker ARX-300型核磁共振仪，内标TSP-d4；质谱采用Agilent 1100 SL型离子阱质谱仪；紫外全波长扫描采用Unico 4802HUV/Vis double beam spectrophatometer；红外采用Bruker IFS 55红外测定仪。
下面实施例中所用色谱条件如下色谱柱Spherisorb C18柱(10цm，4.6×250mm)大连化物所；流动相甲醇∶水∶磷酸(63∶37∶0.05v∶v∶v)；流速0.8ml·min-1；紫外检测波长275nm；柱温25℃。
实施例1黄豆苷元-7，4’-二氧代醋酸的制备 在500ml圆底烧瓶中，加入葛根黄豆苷元2.54g，无水碳酸钾2.80g，碘化钾3.32g，氯乙酸乙酯3.66g，加入100ml无水丙酮中，回流反应8h，蒸馏去掉丙酮，水洗，滤过，干燥；取上述化合物溶于30ml无水乙醇中，加入等摩尔量1mol/L的HCL，回流反应5小时，过滤，干燥，得到白色粉末，用80％乙醇重结晶，得到mp274.91℃，白色片状结晶3.33g，收率90％。
实施例2黄豆苷元-7，4’-二氧代醋酸钠的制备 在500ml圆底烧瓶中，加入葛根黄豆苷元2.54g，无水碳酸钾1.38g，碘化钾3.32g，氯乙酸乙酯2.45g，加入20ml无水N，N-二甲基甲酰胺中，80℃水浴反应10h，水洗，滤过，烘干；取上述化合物溶于无水乙醇中，加入等摩尔量的盐酸溶液，得到黄豆苷元-7，4’-二氧代醋酸，过滤，干燥；取上述化合物溶于50ml无水乙醇中，滴加等摩尔量的氢氧化钠溶液，过滤，干燥，得到白色无定形粉末3.64g(mp＞350℃)，收率88％。UV(水)λmax＝249nm，302nm，IR(KBr)cm-13419.6(-OH)，1638(C＝O)；MS[M-H]-368.7，[M+H]+370.9；1H-NMR4.41-4.85(m，4H)，6.77(d，1H)，6.90-6.93(d，2H)，6.95-6.99(m，1H)，7.24-7.27(d，2H)，7.83-7.86(d，1H)，7.92(s，1H)。其紫外，红外，质谱，核磁图见附页。
实施例3黄豆苷元-7，4’-二氧代醋酸乙酯的制备 在500ml圆底烧瓶中，加入葛根黄豆苷元2.54g，无水碳酸钾2.76g，碘化钾0.25g，氯乙酸乙酯7.35g，加入100ml无水三氯甲烷中，70℃水浴反应10h，水洗，滤过，烘干，得到白色片状结晶3.62g，mp＝167.51℃，收率85％。
实施例4黄豆苷元-7，4’-二氧代醋酸铵的制备 在500ml圆底烧瓶中，加入葛根黄豆苷元2.54g，无水碳酸钾1.38g，碘化钾3.32g，氯乙酸乙酯2.45g，加入150ml二氯甲烷中，水浴回流反应15h，水洗，滤过，烘干；取上述化合物溶于无水乙醇中，加入等摩尔量的盐酸溶液，得到黄豆苷元-7，4’-二氧代醋酸，过滤，干燥；取上述化合物溶于100ml无水乙醇中，滴加等摩尔量的氨水，过滤，干燥，得到白色无定形粉末3.64g(mp＞350℃)，收率90％。
实施例5黄豆苷元-7，4’-二氧代醋酸精氨酸的制备 在500ml圆底烧瓶中，加入葛根黄豆苷元2.54g，无水碳酸钾6.90g，碘化钾3.32g，氯乙酸乙酯6.13g，加入150ml二氯甲烷中，水浴回流反应15h，水洗，滤过，烘干；取上述化合物溶于60ml无水乙醇中，加入等摩尔量的盐酸溶液，得到黄豆苷元-7，4’-二氧代醋酸，过滤，干燥；取上述化合物溶于无水乙醇中，滴加等摩尔量的精氨酸溶液，过滤，干燥，得到白色无定形粉末4.61g(mp＞350℃)，收率85％。
以下通过实施例对本发明在药效学和药动学方面的作用做进一步说明，前7例是脑缺血实验模型，8到11是心肌缺血实验模型 试验动物昆明种小鼠，雌雄兼用，鼠龄为6-8周，体重为20±2g；SD雄性，180-220g，雌雄兼用；大耳白家兔，2.0-2.5kg，雌雄兼用，购于沈阳药科大学动物中心，受试动物预处理在饲养室内观察一周，室温21-23℃，相对湿度30-70％，食用沈阳药科大学动物中心提供机制料块，饮自来水，自然光照。实施例6DZV对小鼠急性脑缺血的影响 60只小鼠随机分成6组，每组10只，雌雄各半，分别灌胃相同剂量的空白对照药-生理盐水、DZV、DZ5、DZd、DZe300mg/kg、阳性对照药-尼莫地平(120mg/kg)，每天给药1次，连续给药7d，最后一次给药1hr后，自小鼠耳后部快速断头，记录从断头开始到最后一次喘息停止的时间，T检验进行组间差异比较。(结果见Tab1.)
Tab 1.Effect of DZ V、DZ5、DZd and DZe on persistent time of gasping of isolated heads of miceby decapitation.(Mean ±SD，n＝10)
″*″表示P＜0.05 ″**″P＜0.01 ″***″P＜0.001 结果表明，阳性对照药，DZV，DZd和DZ5均可不同程度地延长断头小鼠的喘气持续时间，阳性对照药和衍生物DZV作用最为显著(P＜0.001)。DZV(P＜0.001)作用显著性大于DZ5，DZd组，DZe组无延长作用。
实施例7DZV对小鼠常压耐缺氧的影响 将60只小鼠随机分成6组，分组、给药方法同实验1，连续给药7d，最后一次给药40min后，将小鼠放入250ml磨口广口瓶(瓶中放有15g钠石灰，上盖滤纸)将瓶盖盖紧，记录小鼠存活时间，用T检验法进行组间差异比较。(结果见Tab2.) Tab2.Effect of DZV、DZ5、DZd and DZe on Consurvival time of mice subjected to normobarichypoxia.(Mean±SD，n＝10)
结果表明，阳性对照药、DZV和DZ5组对小鼠在常压缺氧情况下的存活时间有不同程度的延长作用。其中DZV组和尼莫地平组较为明显，DZV组显著性大于DZ5组，DZd组和DZe组没有显著性作用。
实施例8DZV对小鼠KCN中毒的影响 将60只小鼠随机分成6组，分组、给药方法同实验1，连续给药7d，最后一次给药1小时后，尾静脉注射KCN，剂量为5mg/kg。记录小鼠存活时间及存活率，用T检验法进行组间差异比较。(结果见Tab3.) Tab3.Effect of DZV、DZ5、DZd and DZe on survival time of mice by KCN(Mean±SD，n＝10)
结果表明，DZV组的作用最为明显(P＜0.001)，阳性对照药、DZ5及DZV、DZd、DZe组均可不同程度延长KCN中毒小鼠的存活时间。DZV组显著性大于DZ5、DZd、DZe组。有10％--40％的动物存活。
实施例9DZV对小鼠学习记忆的影响 将105只小鼠随机分成7组，每组15只，均为雄性，分别为空白1、空白2、阳性对照组、DZV、DZ5、DZd及DZe 300mg/kg组。灌胃给药3d后开始训练，每只每天训练10次，连续训练3d。最后一次给药后30min，空白2、阳性对照组、给药组分别腹腔注射东莨菪碱(1ml/kg)，再过30分钟后开始测试，每只测5次，记录小鼠错误次数。用T检验法进行组间差异比较。(结果见Tab4.)。
Tab4.Effect of DZV、DZ5、DZd and DZe on the memory in mice
″^^^″表示与空白组比P＜0.001 ″*″表示与模型组比P＜0.05 ″**″P＜0.01 ″***″P＜0.001 结果表明，阳性对照药、DZV、DZ5和DZd对东莨菪碱所致小鼠记忆障碍有不同程度改善作用，使小鼠错误次数减少，DZV组和阳性对照组的作用最为显著(P＜0.001)，显著性均大于DZ5组和DZd组，提示该药对小鼠记忆障碍的具有明显改善作用。DZe组无明显改善作用。
实施例10DZV对小鼠NaNO2中毒实验的影响 取小鼠60只，随机分成6组，每组10只，雌雄各半，分组、给药方法同实验1，最后一次给药后10分钟后ip.NaNO2 800mg/kg，观察小鼠的存活时间，以呼吸停止为死亡指标。(结果见Tab 5.)。
Tab 5.Effects of DZ V、DZ5、DZd and DZe on survival time in the intoxicant mice of NaNO2(Mean±SD，n＝10)
与NS比较*P＜0.05，**P＜0.01 实验结果表明，DZV组、DZ5组、DZe组和阳性对照组均能显著延长NaNO2中毒小鼠的存活时间，与生理盐水对照组比较具有显著性差异。
实施例11DZV对缺氧所致大鼠皮层神经元损伤的作用 将怀孕17-19d的大鼠脱颈处死，无菌条件下取出胎鼠，超净台前取出胎鼠大脑，置于冰浴的DMEM培养液中，仔细剔除软脑膜及血管，分离大脑皮层。将分离的大脑皮层剪碎，用0.25％胰酶在37℃水浴中消化5min，离心(1000r，5min)弃上清液，用IMDM培养液(含10％的胎牛血清)轻轻吹打分散成细胞悬液，细胞悬液过滤，调整细胞浓度为1×106cell·mL-1，将细胞接种于预先用0.01％多聚赖氨酸覆盖过的96孔培养板，每孔100μL，置37℃，5％CO2培养箱中孵育。18-22h后换新鲜的加有1％阿糖胞苷的IMDM培养液，再隔24h后换50％含血清IMDM培养液。以后每隔1d换1次新鲜的含血清IMDM培养液，细胞培养至5-6d。
实验分为空白、模型组和DZ、DZV、DZ5、DZd和DZe不同浓度组。实验时各组均换为无血清的IMDM培养液，给药组加入不同浓度DZ或DZV置于5％CO2培养箱孵育，24h后空白对照组换为含有葡萄糖的Earle’s液，缺氧模型组换为不含葡萄糖的Earle’s液，然后把培养板置于缺氧罐内，通入95％N2和5％CO2混合气体20min。24h后，每孔加入MTT溶液10μl，37℃5％CO2培养箱孵育4h，吸出原液，每孔再加入DMSO溶液100μl，微微振荡10min，用酶标仪492nm波长测定光密度值。
实验数据采用SPSS13.0统计软件进行分析，各组数据用均值±标准误(X±SE)表示，采用One-Way ANOVA评价整体性差异，用LSD进行组间比较，P＜0.05为有显著性差异。
对正常神经元影响见Tab 6.，对缺氧神经元的影响见Tab 7.。
Tab 6.Effects of DZV、DZ5、DZd and DZe on the viability of primary cultured neurons(Mean±SD)
Tab 7.Effects of DZV、DZ5、DZd and DZe on the injure of primary cultured neurons induced byhypoxia.(Mean±SD)
#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001，compared with the control group； *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，compared with the model group 实施例12小鼠双侧颈总动脉及迷走神经结扎实验 取小鼠60只，随机分成6组，每组10只，雌雄各半，分组、给药方法同实验1。给药后40分钟用0号丝线结扎双侧颈总动脉和迷走神经，观察小鼠的存活时间，以呼吸停止为死亡指标。(结果见Tab 8.)。
Tab 8.Effects of DZV、DZ5、DZd and DZe on survival time ofmice subjected to bilateral carotidartery ligation.(Mean±SD，n＝10)
与NS比较*P＜0.05 **P＜0.01 实验结果表明，DZV组、DZ5组、DZd组和阳性对照组均能显著延长迷走神经结扎小鼠的存活时间，与空白组比较具有显著性差异。且DZV组延长时间大于DZ5组和DZd组，DZe组无明显延长作用。
实施例13对垂体后叶素所致大鼠心肌缺血的影响 取健康SD大鼠50只，雌雄不限，随机分为5组生理盐水(NS)组，DZ5组、DZd组、DZe组、DZV 75mg/kg静脉注射给药。用25％的乌拉坦1g/kg ip.麻醉后，仰位固定于鼠台上，以6号针头刺于四肢皮下，并与心电图机肢体导联电极相连。心电图机选择标准电压1mv＝10mm，纸速50mm/s。各组分别尾静脉iv.相应浓度的受试药物5ml/kg，给药10分钟后，舌下iv.垂体后叶素(Pit)0.8U/kg，5s内注完。用心电图机记录注射Pit前及注射后15s、30s、45s、60s、90s和3min、5min、8min的ECG。观察T波高度变化及心率变化。T波高度及心率均为每个时间点连续测5个波形，取其平均值。T波高度无论升高或降低，取变化的绝对值。实验结果作组间t检验，判断其显著性。
(1)DZV对T波高度变化的影响 结果表明，NS对照组大鼠iv.Pit后，心电发生明显改变，第一期(0～30s)出现明显的S-T段抬高和T波高耸(P＜0.01)；第二期(30s以后)，呈现明显的S-T段下移，T波低平或倒置(P＜0.05或P＜0.01)。本实验结果与其它文献报道相符。DZV组在各时间点显著对抗Pit引起的∑ST升高或降低，其作用效果优于相同剂量给药的DZ5组，DZd组和DZe组。(结果见Tab 9.)。
Tab 9.Effects of DZV、DZ5、DZd and DZe on the aptitude of T wave of acute myocardialischemia induced by PIT in rats(Mean土SD，n＝10)
与pre-pit比较 *P＜0.05 **P＜0.01 (2)DZV对心率变化的影响 NS组大鼠iv.Pit后，可使大鼠心率明显减慢，至8分钟仍未恢复。DZV在各时间点均明显缓解Pit所致的心率减慢，作用优于相同剂量给药的DZ5组，DZd组和DZe组。(结果见Tab 10.)。
Tab 10.Effects of DZ V、DZ5、DZd and DZe on the changes of heart rate of acute myocardialischemia induced by PIT in rats(Mean土SD，n＝10)
与pre-pit比较 *P＜0.05 **P＜0.01 实施例14体外抗血小板聚集实验(比浊法) 家兔随机分6组，每组6只。耳缘静脉采血4.5mL，以3.8％枸橼酸钠抗凝(血与抗凝剂体积比为9∶1)，室温下离心(800kg，3min)，取上清液制备富血小板血浆(PRP)。分离出PRP后，再离心(2000kg，10min)取上清液制备贫血小板血浆(PPP)，用PPP调节透光率为100％。取PRP 200μL置于比浊管内，分别加入DZ V、DZ5、DZd、DZe75mg/ml或阿司匹林(ASP，100mg/ml)20μL，对照组加等容积NS。温育5分钟后，以花生四烯酸(AA)为诱导剂，描记10分钟聚集曲线，测定最大聚集强度。结果见Tab 11。
依下式计算血小板聚集抑制百分率
Tab 11.Effects of DZV、DZ5、DZd and DZe on the platelet aggregation induced by AA inrabits in vitro.(Mean土SD，n＝6)
与NS比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 实验结果表明，DZV在体外对AA诱导的家兔血小板聚集有明显抑制作用，作用优于DZ5组和DZd组。除DZe组外，各剂量组与NS对照组比较，均有显著性差异。ASP组对AA诱导的体外家兔血小板聚集也有明显的抑制作用(P＜0.01)。
实施例15体内抗血小板聚集实验(比浊法) 家兔分别从耳缘静脉iv.DZ V、DZ5、DZd、DZe 75mg/kg或ASP 80mg/kg，对照组iv.等容积NS。给药后10min自另一耳缘静脉放血，按体外试验法分别进行PRP和PPP的制备，用AA作诱导剂，考察药物对血小板聚集的影响。结果见Tab12。
Tab 12 Effects of DZV、DZ5、DZd and DZe on the platelet aggregation induced by AA in rabitsin vivo.(Mean土SD，n＝6)
与NS比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 实验结果表明，DZV、ASP组、DZ5、DZd及DZe组对AA诱导的家兔血小板聚集均有明显抑制作用。其中，DZV、DZ5显著性最高(P＜0.001)，抑制作用大于DZd及DZe组。
实施例16对家兔颈总动脉血栓形成的影响 家兔随机分为6组，每组8只。用3％异戊巴比妥钠按60mg/kg耳缘静脉注射麻醉，背位固定，分离一侧颈总动脉，在相距约4cm处将两端用动脉夹夹住血管，取12号细缝衣针，连一根一端打结的细线，自近心端穿入颈总动脉，顺血管走行3cm，从远心端穿出，将另一端也打结后剪断细线，然后缓慢松开动脉夹。分别从另一侧耳缘静脉iv.生理盐水、DZV、DZ5、DZd、DZe75mg/kg以及ASP80mg/kg。恢复血流2h后将各组家兔的该段颈总动脉剪下，纵向切开，取出细线，置滤纸上，吸去余血，并迅速称重，减去细线自身重量，即得血栓湿重。结果见Tab 13。
依下式计算血栓形成抑制率
Tab 13 Effects of DZV、DZ5、DZd and DZe on the wet weight of thrombosis formated incommon carotid artery in rabit.(Mean土SD，n＝8)
与NS比较，*P＜0.05，**P＜0.01 实验结果表明DZV(iv.)对家兔颈总动脉血栓形成有明显抑制作用，与对照组比较有显著性差异(P＜0.01)。ASP组和DZ5组对家兔颈总动脉血栓形成也有明显的抑制作用(P＜0.01)，DZd和DZe组没有明显抑制作用。
实施例17DZV的急性毒性实验 灌胃最大剂量的DZV，小鼠全部存活，存活者外观、行动均无异常，未能测出LD50。求得最大耐受量为口服5g/kg，静注给药LD505.50g/kg。DZ5通过急性毒性实验，求得最大耐受量为口服3g/kg，静注给药3.78g/kg。DZV与DZ5相比，具有更大的耐受量，毒副作用小，安全性更高。
实施例18DZV在大鼠体内的药物动力学研究 取5只大鼠，雌雄兼用，进行静脉持久性管术，，交叉做灌胃、静注实验(静脉注射15、25、35mg·kg-13种不同剂量)。以上交叉实验均间隔1周。给药后5、10、20、30、45、60、90、120、180min各取血0.25mL，离心后取血浆0.1mL置入-20℃冰箱内待测。血药浓度-时间数据用中国数学药理学会编制的实用药代动力学计算程序3P97在计算机上自动拟合血药浓度-时间曲线，并算出各项药代动力学参数。
(1)静脉给药(iv) 大鼠静脉注射3种不同剂量的DZV注射液，在大鼠体内药动力学行为均符合二室开放模型。其主要药代动力学参数见Tab 14。
Tab 14 The pharmacokinitic parameters after the jugular vein injection of 3 doses of DZV to rats(Mean±SD，n＝5.)
由tab5可见，在静脉注射15、25mg·kg-1 DZV时，2种不同剂量的t1/2(β)，V(c)，CL等主要动力学参数十分相近，经统计学t检验无显著性差异(P＞0.05)，且AUC随剂量增加而成比例增加，说明在此剂量范围内DZ V的消除为线性动力学，但当静脉注射35mg·kg-1 DZV时，t1/2(β)延长(P＜0.05)，CL明显减少(P＜0.05)，AUC超比例增加，表明大剂量35mg·kg-1给药后，本品在大鼠体内的消除为非线性动力学。
(2)灌胃给药(ig) 大鼠5只，灌胃给药DZV 120mg·kg-1后，血药浓度-时间数据经计算机拟合，动力学行为符合一室开放模型。其主要药代动力学参数见表tab 15。结果表明，该药吸收、消除均很迅速。
Tab 15 The pharmacokinetic parameters of DZ V after intragastic adminstration torats(Mean±SD，n＝5，)
大鼠经灌胃、颈静脉交叉给予DZV后，测得血药浓度-时间数据分别采用隔室模型和统计矩2种方法处理，计算AUC及AUC/D(D给药剂量)，2种方法的结果比较见tab16、17。
Tab 16 The bioavailability of DZV(compartment model)
Tab 17 The bioavailability of DZ V(statistical algorithm)
由tab16、17可见，大鼠灌胃DZ V的绝对生物利用度为38.66％、40.09％，2种方法处理结果相近，经统计学处理，2者之间没有显著性差异(P＞0.05)，说明数据处理结果的合理性。
总之，本实验表明DZV具有较好的抗脑缺血、缺氧、抗心肌缺血、缺氧，拮抗记忆障碍，抗血小板聚集及抗血栓形成，保护神经元等作用。药效高于或相当于相同剂量的葛根黄豆苷元的其他衍生物DZ5，DZd，DZe。此外，从急性毒性实验可得，本发明的实质特点和显著进步在于DZV在具有以上各药效的同时，安全性高，其口服和静脉注射的耐受量都大于DZ5。此项研究对于药效评价和临床应用具有重要意义，为DZV的进一步开发提供了理论依据。
以下通过实施例对本发明在制剂方面的应用做进一步说明。
片剂的普通配方可以是DZV10-90％重量比，淀粉89-9％重量比，硬脂酸镁1％重量比，50％乙醇适量。胶囊剂的普通配方可以是DZV10％-100％重量比，淀粉90-0％重量比，颗粒剂的普通配方可以是DZV5％-100％重量比，(蔗糖+糊精)95-0％重量比，蔗糖∶糊精＝2∶1。同时本领域技术人员也可以根据需要用本领域公知的技术和载体配制成其他剂型。
实施例19片剂 DZV 30g 淀粉32.5g 硬脂酸镁0.5g 50％乙醇11ml 上述组分混合制粒后压片即得。
实施例20胶囊剂 DZV 60g 淀粉80g 上述组分混匀，填入空胶囊中，即得 实施例21颗粒剂 DZV 80g 淀粉230g 糊精90g 乙醇54ml 上述组分混合、过筛，混匀，以乙醇制成湿颗粒，干燥，整粒，得到颗粒剂。
实施例22滴丸 DZV45g PEG600015g PEG400030g 将DZV加入到加热融化的聚乙二醇辅料中混匀；接着将熔融混合液移入滴丸机进行滴制；药液滴至液体石蜡冷却剂中冷却；用吸布吸干冷却剂，选丸，即得到DZV滴丸。
实施例23注射剂 DZV 6g 氢氧化钠溶液适量 盐酸溶液 适量 注射用水 至100ml 将上述组分混合后，加注射用水80ml，搅拌至完全溶解后，加入0.1％活性炭，60℃保温搅拌30min，趁热过滤，除去活性炭，补加注射用水至全量。用0.45μm滤膜粗滤，再用0.22μm的微孔滤膜过滤。灌封，121℃流通蒸气中灭菌15min，即得DZV注射液。
实施例24冻干制剂 DZV 6g 甘露醇5g 氢氧化钠溶液 适量 盐酸溶液 适量 注射用水 至100ml 按处方量称取各组分，加注射用水80ml，搅拌至完全溶解后，加入0.1％活性炭，60℃保温搅拌30min，趁热过滤，除去活性炭，补加注射用水至全量。用0.45μm滤膜粗滤，再用0.22μm的滤膜过滤，冷冻干燥，即得注射用DZV。
实施例25口服液 DZV 5g 蒸馏水30ml 单糖浆加至100ml 取DZV溶于蒸馏水中，加单糖浆至全量，即得。
实施例26外用制剂 DZV 10g 卡波姆940 4g 甘油 15g 三乙醇胺 适量 蒸馏水至100ml 取卡波姆4g加适量水溶胀后，加入甘油，研磨使湿润，加三乙醇胺研磨成透明凝胶基质.另取DZV，用适量水溶解，搅匀。将上述药液加入凝胶基质中，边加边研磨，加蒸馏水至100ml，继续搅拌均匀，得透明凝胶剂。
权利要求
1.具有如下通式的葛根黄豆苷元-7，4’-二氧代醋酸化合物
其中R1和R2可以相同或不同，并独立地选自H或可以使该化合物形成可药用盐或酯的基团；R3和R4可以相同或不同，并独立地选自H或烷基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述的R1和R2彼此独立地选自H、金属离子、有机阳离子、碱性氨基酸阳离子、C1-C10烷基；R3和R4彼此独立地选自H或C1-C10烷基。
3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，它是以葛根黄豆苷元为母体，采用半合成的方法进行7，4’位取代而成的葛根黄豆苷元-7，4’-二氧代醋酸化合物的游离酸或其可药用盐或酯。
4.根据权利要求1或2所述的化合物，其特征在于R1和R2独立地选自H+、Na+、K+、Li+、Mg2+、Al3+、Fe2+、Fe3+、Ca2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Ba2+、Sn2+、赖氨酸、精氨酸、组氨酸，NH4+，甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、戊基、异戊基、己基、庚基；R3和R4独立地选自H、甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、戊基、异戊基、己基、庚基。
5.一种如权利要求1所述的葛根黄豆苷元-7，4’-二氧代醋酸化合物的制备方法，其特征在于包括下述步骤
(1)在500ml圆底烧瓶中，加入葛根黄豆苷元2.54g，无水碳酸钾2.76-13.8g，碘化钾0.02-3.32g，一氯乙酸乙酯2.45-6.13g，加入有机溶剂10-200ml中，30℃-100℃水浴反应2-15h，蒸馏去掉有机溶剂，水洗，滤过，烘干；
(2)取上述化合物溶于无水乙醇10-100ml中，加入等摩尔量的酸，于0℃-100℃水浴下水解，得到目标化合物，过滤，干燥，用80％乙醇重结晶。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(1)的取代反应所述的有机溶剂选自四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮、吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、三氯甲烷，反应必须在无水条件下进行。
7.一种药物组合物，其特征在于其包含葛根黄豆苷元-7，4’-二氧代醋酸化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
8.葛根黄豆苷元-7，4’-二氧代醋酸化合物及其组合物在制备抗脑缺血、缺氧，抗心肌缺血、缺氧，抗记忆障碍，抗血小板聚集及抗血栓形成药物或保健品中的应用。
9.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，其可以进一步制成注射剂、片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸、口服液或外用剂型形式。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，涉及葛根黄豆苷元-7，4’-二氧代醋酸化合物及其制备方法。所述化合物具有如下通式，其中R1和R2可以相同或不同，并彼此独立地选自H、金属离子、有机阳离子、碱性氨基酸阳离子、C1-C10烷基；R3和R4可以相同或不同，并彼此独立地选自H或C1-C10烷基。葛根黄豆苷元-7，4’-二氧代醋酸化合物可以和药学可接受的载体或赋形剂组成药物组合物。所述化合物及其药物组合物具有抗脑缺血、缺氧，心肌缺血、缺氧，拮抗记忆障碍，抗血小板聚集及抗血栓形成，保护缺氧所致大鼠皮层神经元损伤等作用。
文档编号A23L1/30GK101759680SQ200910248888
公开日2010年6月30日 申请日期2009年12月30日 优先权日2009年12月30日
发明者王淑君 申请人:沈阳药科大学