专利名称：大白菜phk4蛋白编码序列及其功能验证的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学和基因工程领域。具体涉及到大白菜PHK4蛋白的编码序 列及其功能验证。
背景技术：
在高等植物中，细胞分裂素广泛参与了对植物生长发育的调控，包括参与配子细 胞与胚胎发育；促进芽的分化；调控顶端优势、抑制主根的伸长；促进维管束的形成、花和 果实的发育；参与胁迫反应和病原抵抗以及延缓开花时间和叶片衰老等。细胞分裂素的调控作用是通过信号网络实现的。细胞分裂素受体负责细胞分裂素 信号的感应和转导，是信号传递的起始点。大白菜是一种重要的蔬菜作物。分离大白菜的细胞分裂素受体基因，将为利用基 因工程手段调控大白菜的株型、单株重、生育期、根系发育，提高大白菜耐生物/非生物胁 迫能力奠定重要基础。目前已公布的大白菜基因组测序结果尚不完整，大白菜细胞分裂素受体 PHK4(pekinensis histidin kinase4)蛋白的编码序列至今在国内外未见报道。
发明内容
本发明公开了大白菜细胞分裂素受体PHK4蛋白质的氨基酸序列以及该蛋白的编 码基因的核苷酸序列及其功能验证。本发明解决技术问题所采用的技术方案是本发明分离出了多核苷酸，其序列特征是序列全长3156bp，编号为SEQ ID NO 1。该分子含有大白菜细胞分裂素受体PHK4蛋白的编码序列。本发明提供的蛋白质多肽，其特征是具有SEQ IDNO 2氨基酸序列。本发明提供了包含上述多核苷酸的载体。本发明提供了一种上述载体转化或转导的宿主细胞，在实例中该宿主细胞是大肠 杆菌感受态细胞、农杆菌感受态细胞、酵母Aslnl突变体和拟南芥ahk4-l突变体。本发明提供了一种利用转基因技术将PHK4基因转化入酵母突变体Δ slnl和拟南 芥ahk4-l突变体来验证PHK4具有细胞分裂素受体功能的方法。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围。实施例1大白菜细胞分裂素受体PHK4的基因组编码序列的分离用已知的十字花科植物细胞分裂素受体基因cDNA序列，通过比较，得到相似性较 高的一段大白菜的EST序列，在其上设计引物进行反向PCR扩增，得到该EST序列两侧未知序列，通过染色体步移技术进一步向一端延伸，扩增出3，端未知序列，再通过与基因序列库 的比对分析，寻找基因相似性较高的序列，在其上设计引物，通过常规PCR扩增获得5’端序 列，拼接后获得一段全长为8474bp的DNA序列。该序列包含PHK4蛋白的基因组编码序列。详细过程如下1、植物基因组DNA的环化提取植物基因组DNA，利用限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，然后通过T4DNA Ligase使酶切片段进行自身环化。2、反向 PCR设计反向PCR引物，引物序列为Pl :5，-GGATATTCAAATGCCACAG-3，(SEQ ID NO 3)P2 :5，-ATGAAGCAAGCATCGAAAG-3‘ (SEQ ID NO 4)以环化DNA作为模板，以P1，P2作为引物进行反向PCR扩增，对扩增产物进行嵌套 PCR，嵌套PCR扩增引物为P3 :GATTCTAGCCATGACAGC(SEQ ID NO 5)P4:TGTTGGAGGTGTCGTGCTT(SEQ ID NO 6)回收扩增产物，连接到PMD19-T载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克 隆，提取质粒，测序，与已知片段重复序列拼接。以此片段再次设计反向PCR引物，引物序列 为P5 :CATGGGAGACTTAGACGTGG(SEQ ID NO 7)P6 :CTCGAAGTGGAGCTATCCGC(SEQ ID NO 8)进行反向PCR扩增，回收扩增产物，连接到PMD19-T载体上，转化大肠杆菌感受态 细胞，挑取阳性克隆，提取质粒，测序，将测序结果的重叠区拼接，获得了长度为3249bp的 DNA片段。比对分析结果表明该序列包括PHK4基因完整3’端。3、染色体步移在3249bp片段的5’端设计三条特异性嵌套引物，引物序列为P-SPl :TTTGGAAGCGGCGGTTATGTCT(SEQ ID NO :9)P-SP2 :TCCTCCGACGAGAGTAAGTGTTT(SEQ ID NO :10)P-SP3 :TCAAACCAATCCCAGTGCCTCC(SEQ ID NO :11)与大连宝生物公司的染色体步移试剂盒中提供的四种经过独特设计的退火温度 较低的兼并引物，即API，AP2，AP3，AP4进行热不对称PCR反应。通过三次巢式PCR反应， 得到向3249bp片段5，端延伸的产物，片段长度为2627bp，回收扩增产物，连接到pMD19_T 载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒，测序，与已知片段重复序列拼 接后得到长度为M93bp序列。4、常规 PCR将实验得到的序列与NCBI数据库进行比对，设计引物RL-F，2-SP2 ；RL-F :TGTTATTGGGTCTCGCCTGG(SEQ ID NO :12)2-SP2 :GTTGTTCATCTTCACCGCCACTG(SEQ ID NO :13)进行常规PCR扩增，得到长度为3148bp的基因片段。将测序结果的重叠区拼接，获得了全长为8474bp的DNA序列。该序列包含PHK4蛋白的基因组编码序列。实施例2大白菜细胞分裂素受体PHK4基因CDS序列的克隆1、大白菜总RNA的分离取大白菜新鲜的幼嫩叶片，用液氮速冻，充分研磨。将样品粉末转入1. 5ml离心管 中，加入Trizol提取总RNA02、RT-PCR将实施例1中获得的PHK4蛋白的基因组编码序列用GENSCAN分析，预测到了该基 因的⑶S序列。在预测的外显子序列上设计一对引物PHK4A-F和PHK4A-R，序列为PHK4A-F :GTTCACGCTTTGGCTATTCT(SEQ ID NO :14)PHK4A-R :CTTCCTTCTCCATCATCCTT(SEQ ID NO :15)以提取的大白菜总RNA为模板，PHK4A-F和PHK4A-R为引物，进行RT-PCR反应，扩 增得到2065bp的cDNA片段。回收扩增产物，连接到pMD19_T载体上，转化大肠杆菌感受态 细胞，挑取阳性克隆，提取质粒，测序。3、3，-RACE按照AMBIONRACE cDNA Amplification Kit 的引物设计原则，在得到的 2065bp 的 cDNA上设计两个正向嵌套引物SPl和SP2，按照试剂盒的操作说明进行实验，先以3’ RACE adaptor (GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGGTTTTTTTTTTTTVN)进行反向 PCR,获得 cDNA 第一链，然后以Adaptorl和SPl为引物，进行第一轮PCR反应；Adaptorl和SPl引物序列 如下SPl :CCTTCAGGAACAACGAAACTGG(SEQ ID NO :16)Adaptorl :GCGAGCACAGAATTAATACGACT(SEQ ID NO :17)以Adaptor2和SP2为引物，进行第二轮PCR反应，得到854bp的片段。Adaptor2 和SP2引物序列如下SP2 :CACAAGACACCGAAACTCGC(SEQ ID NO :18)Adaptor2 :C GCGGATCCGAATTAATACGACTCACTATAGG(SEQ ID NO :19)将扩增产物连接到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆，提 取质粒，测序。将测序结果的重叠区拼接，与2065bp片段拼接后长度为^74bp，比对分析表 明结果表明其中包括PHK4基因cDNA完整的3’端序列。4、PHK4基因CDS的获得分析实施例1获得的PHK4基因的基因组DNA序列，预测起始密码子，以预测的密 码子为起始设计正向引物5’ -229，在得到的PHK4基因cDNA的3’端序列上的UTR区设计 一个反向引物PHK4H-R ；引物5’ -229和PHK4H-R的序列如下5，-229 :ATGGGTTTCGCCAAGATGCAGC(SEQ ID NO :20)PHK4H-R ggTACAAATCgAACTCCggT(SEQ ID NO 21)以cDNA为模板进行PCR扩增，得到3156bp的cDNA的片段，在本说明书中编号为 SEQ ID N01。将扩增产物连接到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆， 提取质粒，测序。其中1-2985为PHK4的CDS。实施例3 PHK4可以恢复酵母Δ slnl突变体对细胞分裂素的应答
1、含有PHK4基因的酵母表达载体的构建在获得大白菜cDNA基因序列的基础上，设计引入限制性内切酶位点的引物 PHK4H-R(Notl)和5' -229 (Spel)，以大白菜cDNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物克隆 到pMD19T-载体上，进一步克隆到酵母表达载体pCUY315上，构建成pCUY315_3k酵母融合 表达载体。PHK4H-R(Notl) :ata aga atg egg ccg egg TACAMTCgAACTCCggT (SEQ ID NO :22)5' -229(Spel) :gga cta gt ATGGGTTTCGCCAAGATGCAGC(SEQ ID NO :23)2、酵母Δ slnl突变体菌株TM182的转化挑取酵母八81111突变体菌株111182单克隆于液体￥ 0培养基，于301，160印111条 件下过夜培养，制备酵母感受态，采用醋酸锂转化法将构建的含有PHK4基因的酵母表达载 体pCUY315-3k、对照表达载体pCUY315、或含有拟南芥AHK4基因的pCUY90载体转化到酵母 TM182菌株中。3、检测转基因酵母Δ slnl突变体对细胞分裂素的应答将pCOT315_3k、或pCUY90、或pCOT315转化到酵母Δ slnl突变体菌株TM182中以 后，均勻涂到含有2%葡萄糖的SC培养基上，在培养基的中间放置一张无菌过滤灭菌膜，在 膜上滴加细胞分裂素(浓度为50μΜ，采用DMSO溶解)，30°C培养2-3天。在细胞分裂素的 刺激下，转化了 pCUY315-3k和pCUY90的培养基均长出菌落，而转化了 pCUY315的培养基则 未长菌落。说明大白菜PHK4蛋白和拟南芥AHK4蛋白均能使Aslnl突变体恢复对细胞分 裂素的应答，PHK4与AHK4具有相似的作用，即具有细胞分裂素受体的功能。实施例4PHK4可以恢复拟南芥ahk4_l突变体对细胞分裂素的应答1、含有PHK4基因的农杆菌表达载体的构建根据大白菜PHK4基因的ORF序列，设计引入限制性内切酶位点的引物 PHK4H-R(BglII)禾口 5' -229(Spel)；PHK4H-R(Bgl II) :gaa gat ctg g TACAAATCgAACTCCggT(SEQ ID NO :24)5' -229(Spe 1) :gga cta gt ATGGGTTTCGCCAAGATGCAGC(SEQ ID NO :25)扩增出带有限制性内切酶酶切位点的PHK4基因ORF全长，克隆到pMD19_T载体 上，进一步克隆到农杆菌表达载体P35S 1300上，并将载体转化到农杆菌中。2、利用叶盘法转化拟南芥取生长两周左右的拟南芥突变体和野生型的根组织，接到愈伤诱导培养基上预培 养2-3天；利用无菌牙签挑取YEB选择培养基上的阳性菌落(携带含PHK4基因的农杆菌表 达载体)，接种于2ml液体YEB培养基中(Kan+，Rif+)，160rpm振荡培养至对数生长期。同 时培养对照菌株(携带不含有PHK4基因的p35S 1300质粒)。室温下4000转离心lOmin，收集菌体；菌体用V2MS液体培养基重悬，使菌液的0D600 = 0. 3-0. 5 ；将经过预培养的叶片浸于制备好的菌液中，浸泡2-5分钟，在无菌滤纸上吸干菌 液；把经侵染的叶片接于预培养的培养基上，与农杆菌共培养2天；共培养结束后，将外植体转到含有抑菌抗生素及具有选择压的愈伤培养基上培养30天左右，然后转到含有细胞分裂素的分化培养基上，可见野生型愈伤组织以及转化了 PHK4基因的ahk4_l突变体愈伤组织转绿，而用对照菌株转化的突变体愈伤组织不转绿。说 明PHK4恢复了拟南芥ahk4-l突变体感受细胞分裂素的功能，PHK4具有细胞分裂素受体的 功能。
附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定本发明的范围。图1 转基因酵母Δ slnl突变体对细胞分裂素应答的检测图中1、含有pCUY315_3k融合载体的酵母转化体在滴加了细胞分裂素的膜上形 成的菌落。2 含有pCUY90融合载体的酵母转化体在滴加了细胞分裂素膜上形成的菌落。3 含有pCUY315的酵母转化体在滴加了细胞分裂素的膜上未形成菌落。序列表<110>辽宁师范大学<120>大白菜PHK4蛋白编码序列及其功能验证<160>25<170>PatentIn version 3. 5<210>1<211>3156<212>DNA〈213〉大白菜(BrassiesL pekinensis Rupr.)
〈220〉
<221>CDS
〈222〉⑴…(2985)
<400>1
atgggtttcgccaagatgcagcattcagtggcggtgaagatgaacaacgg60
gaccaagtgggtaacaaaaaggggtcaactttcatacaggaacacagagctttattacca120
aagggtttgattctatggacaatcattgtcgggtttataagcagagggatttatcagtgg180
atggatgatactagcaaggtcagaagagaagaggttttggttagtatgtgtgatcagaga240
gccaggatgttgcaggatcagtttagtgttagtgttaaccatgttcacgctttggctatt300
cttgtctcaacgtttcattaccacaagaatccatctgcaattgatcaggggacatttgct360
gactatacagcgagaacagcatttgagagaccgttgctaagtggagtggcttacgctgaa420
aaggttgtgaatgctgagagggagatgtttgagagtcagcacaattgggttataaagaca480
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attctgagagctagagagacagggaaagctgtcttaacaagcccttttagactactggct660
tctcaccatctaggagttgtgttaaccttccctgtgtacaaagcctctcttcctaaaaac720
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gagtcactcgttgagaatctactcggtcagctcgctggcaaccaggcgatagtagtgcat840
gtgtatgacatcaccaacgcgtcggatcctctcgtcatgtacgggaaccaagacgaagaa900
ggcgacacgtctctctaccacgagagcaag cttgattttg gagaccctttcaggaagcat960
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cttgatcgtgccaagatcgaagctgggaagctggagttggagtctgtgccttttgatata1380
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ttgatattaa tccttaccgg agttcgatttgtaccg3156
<210>2
<211>994
<212>PRT
<213>大白菜(Brassica pekinensis Rupr.)
<400>2
MetGlyPheAlaLysMetGlnHisSerValAlaValLysMetAsnAsn
151015
GlyAsnAsnAsnAspGlnValGlyAsnLysLysGlySerThrPhelie
202530
GlnGluHisArgAlaLeuLeuProLysGlyLeulieLeuTrpThrlie
354045
IleValGlyPhelieSerArgGlylieTyrGlnTrpMetAspAspThr
505560
SerLysValArgArgGluGluValLeuValSerMetCysAspGlnArg
65707580
AlaArgMetLeuGlnAspGlnPheSerValSerValAsnHisValHis
81859095
AlaLeuAlalieLeuValSerThrPheHisTyrHisLysAsnProSer
100105110
AlalieAspGlnGlyThrPheAlaAspTyrThrAlaArgThrAlaPhe
115120125
GluArgProLeuLeuSerGlyValAlaTyrAlaGluLysValValAsn
130135140
AlaGluArgGluMetPheGluSerGlnHisAsnTrpVallieLysThr
145150155160
MetAspThrGlyGluProSerProValArgAspGluTyrAlaProVal
161165170175
liePheSerGlnAspSerValSerTyrLeuGluSerLeuAspMetMet
180185190
SerGlyGluGluAspArgGluAsrlieLeuArgAlaArgGluThrGly
195200205
LysAlaValLeuThrSerProPheArgLeuLeuAlaSerHisHisLeu
210215220
GlyValValLeuThrPheProValTyrLysAlaSerLeuProLysAsn
225230235240
ProThrValGlnGluArglieAlaAlaThrAlaGlyTyrLeuGlyGly
245250255
AlaPheAspValGluSerLeuValGluAsnLeuLeuGlyGlnLeuAla
260265270
GlyAsnGlnAlalieValValHisValTyrAsplieThrAsnAlaSer
275280285
AspProLeuValMetTyrGlyAsnGlnAspGluGluGlyAspThrSer
290295300
LeuTyrHisGluSerLysLeuAspPheGlyAspProPheArgLysHis
305311315320
LysMetlieCysArgTyrLeuGlnLysAlaProlieProLeuAsnVal
321325330335
LeuThrThrValProLeuPhePheAlalieGlyPheLeuValGlyTyr
340345350
IleLeuTyrGlyAlaAlaValHislieValLysValGluAspAspPhe
355360365
HisGluMetGlnGluLeuLysValArgAlaGluAlaAlaAspValAla
370375380
LysSerGlnPheLeuAlaThrValSerHisGlulieArgThrProMet
385390395400
AsnGlylieLeuGlyMetLeuAlaMetLeuLeuAspThrGluLeuSer
405410415
SerThr Gln Arg Asp Tyr Ala Gln Thr Ala Gln Val Cys Gly Lys Ala
420425430
LeulieAlaLeulieAsnGluValLeuAspArgAlaLyslieGluAla
435440445
GlyLysLeuGluLeuGluSerValProPheAsplieArgSerlieLeu
450455460
AspAspValLeuSerLeuPheSerGluGluSerArgAsnLysGlylie
465470475480
GluLeuAlaValPheValSerAspLysValProGlulieValLysGly
485490495
AspSerGlyArgPheArgGlnlielielieAsnLeuValGlyAsnSer
500505510
ValLysPheThrGluLysGlyHisliePheValLysValHisLeuAla
515520525
GluGlnSerLysAspGlyAlaGluSerLysProAlaLeuAsnGlyGly
530535540
ValAlaSerGluAsplieThrAlaAlaSerLysProSerSerTyrAsn
545550555560
ThrLeuSerGlyTyrGluAlaAlaAspGlyArgAsnSerTrpAspSer
565570575
PheLysHisLeuLeuSerSerGluGluLeuLeuThrSerSerGluPhe
580585590
GluAlaSerSerAsnValArgLeuMetValSerlieGluAspThrGly
595600605
IleGlylieProLeuThrAlaGlnGlyArgValPheMetProPheMet
610615620
GlnAlaAspSerSerThrSerArgThrTyrGlyGlyThrGlylieGly
625630635640
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645650655
PheValSerArgProArgValGlySerThrPheTrpPheThrAlaVal
660665670
PheGluArgCysAspLysCysSerLeuLysLysProThrValGluAsn
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LeuProSerSerPheArgGlyMetArgAlalieValValAspAlaLys
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ProValArgAlaAlaValThrArgTyrHisMetLysArgLeuGlylie
705710715720
SerValAspValMetThrSerLeuArgThrAlaValSerThrAlaSer
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GlyArgAsrGlySerProLeuProSerGlyThrThrLysLeuAspMet
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IleLeuValGluLysAspSerTrplieSerThrGluAsplieAspAla
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GlulieArgGlnMetAsnSerArgThrAsnGlyAsnValHisHisLys
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ThrProLysLeuAlaLeuPheAlaThrAsnlieThrAsnSerGluPhe
785790795800
AspArgAlaLysSerAlaGlyPheAlaAspThrVallieMetLysPro
805810815
LeuArgAlaSerMetlieGlyAlaCysLeuGlnGlnValLeuGluLeu
820825830
ArgLysAlaArgGlnGlnHisProGluGlySerSerProAlaThrLeu
835840845
LysSerLeuLeuThrGlyLysLyslieLeuValValAspAspAsnMet
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865870875880
ValValCysAlaGluSerGlyGlnValAlaLeuGlyLeuLeuGlnlie
885890895
Pro His Ser Phe AspAla Cys PheMet Asp lie Gln Met Pro
900905 910
Asp Gly Phe Glu AlaThr Arg Glnlie Arg Met Met Glu Lys
915920925
Lys Glu Lys Thr LysLeu Glu TrpHis Leu Pro lie Leu Ala
930935940
Ala Asp Val lie HisAla Thr TyrGlu Glu Cys Leu Lys Ser
945950955
Asp Gly Tyr Val SerLys Pro PheGlu Glu Glu Asn Leu Tyr
965970
Val Ala Lys Ser PheLys Ala AsnPro lie Ser Asp Ser Ser
980985 990
Gln Ser
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>合成的引物
<400>3
ggatattcaa atgccacag
<210>4
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<400>4
atgaagcaag catcgaaag
<210>5
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<212>DNA
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<400>5
gattctagcc atgacagc
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>合成的引物
<400>6
tgttggaggt gtcgtgctt
<210>7
<211>20
Gln
Glu
Met
Gly
Lys 975 Cys
Met
Ala
Thr
Met 960
Ser
Ser
12
<212>DNA
<213>合成的引物
<400>7
catgggagac ttagacgtgg
<210>8
<211>20
<212>DNA
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<400>8
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<210>9
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<400>9
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<210>10
<211>23
<212>DNA
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<210>11
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权利要求
1.一种分离的大白菜PHK4蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO 2氨基酸 序列的多肽、或将SEQ ID NO :2氨基酸序列的一个或数个氨基酸残基缺失、插入或取代而形 成的保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码如权利要求1所述多肽的 多核苷酸。
3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸具有SEQID NO :1中1-3156 位的序列或其互补序列，或具有SEQ ID NO 1中H985位的序列或其互补序列。
4.一种载体，其特征在于，它包含权利求3所述的多核苷酸或该多核苷酸的部分片段。
5.一种用权利要求4所述载体转化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的 载体。
全文摘要
本发明提供了一种在大白菜中表达的PHK4蛋白、编码序列及其所起的细胞分裂素受体的作用。本发明涉及到所述基因的融合基因构建体，携带该构建体的重组表达载体。还涉及所述基因表达载体转化酵母细胞、植物细胞，以及由转化细胞产生的所属基因的转基因植物及其后代、种子及植物组织。本发明所获得的蛋白具有细胞分裂素受体的功能。
文档编号C12N9/12GK102108345SQ20091024896
公开日2011年6月29日 申请日期2009年12月29日 优先权日2009年12月29日
发明者任相亮, 李丹, 梁丹, 王火旭, 郑萍 申请人:辽宁师范大学