专利名称：提高固定化脂肪酶活性和稳定性的方法
技术领域：
本发明属于酶化学领域，涉及固定在无机的活性炭、硅胶和有机的树脂上用化学方法提高酶其活性和稳定性的技术；同时还涉及有机物的催化酯化和转酯化的技术。
背景技术：
脂肪酶通常被用于工业上在有机媒介中催化酯化或转酯化反应。以脂肪酶为催化剂制备生物柴油，反应条件温和、醇用量少、甘油易回收、无废物，可以解决目前化学法生产生物柴油所用催化剂存在的分离难、耗能多的问题。酶的固定化技术解决了脂肪酶在催化反应过程中易结块、不易回收、很难重复利用等问题，并且提高了脂肪酶的活性和稳定
性[1]。 提高固定化酶在有机媒介中的催化活性和稳定性意义重大。采用某些极性有机溶剂处理脂肪酶可以明显提高其催化活性和稳定性[2—4]。通过极性有机溶剂改变脂肪酶分子的构象[5]以及载体对脂肪酶的吸附状态，促进酶与底物的结合，提高酶的催化性能，进而提高生物催化剂的经济性和实用性。
参考文献 [1]蔡志强，杨广花，赵希岳，等.固定化酶催化高酸废油脂合成生物柴油的研究.中国粮油学报，2008，23(4) :160-162. [2]Min G K， Eun G L， Bung H C. Improved enantioselectivity ofCandidarugosa lipase towards ketoprofen ethyl ester by a simple two—steptreatment. ProcessBiochemistry， 2000(35) :977_982. [3]Michiakim， KojiK， Kazuo K. Enhanced activities of lipase pretreatedwithorganic solvents. Journal of Chemical Technology and Biotechnology,2001(76) :1070-1073. [4]Sonia C， Andres R A， Rosa M C， et al. Small water amounts increasethecatelytic behaviour of polar organic solvents pre—treated CMidida rugosalipase. Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2001 (11) :939-947.
[5]Chang C S， Hsu C S. Enhancement of enantioselectivity an reactionrate onthe synthesis of(S)-ketoprofen hydroxyalkyl ester in organic solventsviaisopropanol—dried immobilized lipase.Journal of Chemical TechnologyandBiotechnology， 2005(80) :537-544.
发明内容
本发明的目的旨在提高固定化脂肪酶在有机媒介中的催化活性和稳定性，进而提
高生物催化剂的经济性和实用性。 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是提供一种应用有机化合物处理固定化脂肪酶的方法，采用醇、酮和酯为固定化酶处理剂，将吸附固定的脂肪酶浸泡于处理剂
3中，再对浸泡的固定化脂肪酶进行分离收集和干燥处理，即得催化活性和稳定性得以提高的固定化脂肪酶。其方法包括如下步骤 a、脂肪酶液制备取15g酶粉溶于300ml 、 pH7. 0的磷酸缓冲液(0. 05mol/LK2HP04-KH2P04)，制得0. 05mg/ml的脂肪酶液。 b、脂肪酶固定化将lg经预处理的固定化载体(预处理的方法用lmol/LHCl于室温下浸泡3h，然后水洗至中性)加入30 50ml酶液中，于3(TC、150rpm振荡吸附2h。
c、固定化脂肪酶的分离和存放过滤分离得湿固定化酶，于4t:放置24h。
d、有机溶剂处理在20 50ml极性有机溶剂中加入lg湿固定化酶，于25 35t:、150rpm振荡处理1 1. 5h，抽滤得处理过的固定化酶，于4"放置24h，测定酶活力。
所述有机溶剂为极性有机溶剂醇、酮、酯。醇以C2 C3醇、酮以C3 C4酮、酯以乙酸的C2 C4酯为好。最佳溶剂醇为丙醇、或异丙醇；酮为丙酮或丁酮；酯为乙酸乙酯
或乙酸异戊酯。 e、大豆油转酯化将22. 5g大豆油、llml正己烷及lg有机溶剂处理过的固定化酶混合，于3(TC预热20min，按醇油摩尔比3 : 1 (大豆油的1摩尔质量是854，甲醇的摩尔质量是46，甲醇的摩尔数为甲醇质量除以甲醇的摩尔质量，大豆油的摩尔数为大豆油的质量除以大豆油的摩尔质量，醇油摩尔比为甲醇的摩尔数除以大豆油的摩尔数)平均分3次加入无水甲醇，于150rpm振荡反应24h 。 f、固定化脂肪酶催化剂回收转酯化反应结束后，用丙酮洗涤固定化脂肪酶催化剂3次，于4。C干燥24 48h，测定酶活力。 其中，所述的固定化载体为40目活性炭、或硅胶G、或匿-130树脂，所述的醇为丙
醇、或异丙醇，所述的酮为丙酮、或丁酮、所述的酯为乙酸乙酯、或乙酸异戊酯。 采用本发明方法，通过使用极性有机溶剂浸泡处理吸附固定的脂肪酶LVK-FIOO
一定时间，即可得到催化活性和稳定性得以提高的固定化脂肪酶，其脂肪酶活力是对照的
1. 5 2. 5倍、半衰期延长3 8h、催化大豆油转酯化反应延长使用3-6批。所得固定化脂
肪酶可用作于油脂的转酯化、合成或水解。 与现有技术相比较，其突出优点为本方法操作简单，能有效提高固定化脂肪酶催
化活性和稳定性，具有很高的推广利用价值。 以下结合实施例和说明书附图对本发明作进一步说明。
图1为应用有机化合物提高固定化脂肪酶活性和稳定性的工艺流程示意图。
具体实施方式
实施例1 a、脂肪酶液制备取15g酶粉溶于300ml 、 pH7. 0的磷酸缓冲液(0. 05mo1/LK2HP04-KH2P04)，制得0. 05mg/ml的脂肪酶液。 b、脂肪酶固定化将lg经预处理的40目活性炭加入30ml酶液中，于3(TC、150rpm振荡吸附2h。所述预处理是用lmol/LHCl于室温下浸泡3h，然后水洗至中性。
c、固定化脂肪酶的分离和存放过滤分离得湿固定化酶，于4t:放置24h。
d、有机溶剂处理选择丙酮为固定化酶处理剂。在30ml丙酮中加入lg湿固定化 酶，于25t:、150rpm振荡处理lh，抽滤得处理过的固定化酶，于4t:放置24h，测定酶活力。
e、大豆油转酯化将22. 5g大豆油、llml正己烷及lg有机溶剂处理过的固定化酶 混合，于3(TC预热20min，按醇油摩尔比3 : 1平均分3次加入无水甲醇(每次加无水甲 醇1. lml)，于150rpm振荡反应24h，分析粗脂肪酸甲酯(棕榈酸甲酯4. 27g ;硬脂酸甲酯
1. 86g ;油酸甲酯7. 83g ;亚油酸甲酯4. 18g ;亚麻酸甲酯1. 47g)。 f、固定化脂肪酶催化剂回收转酯化反应结束后，用丙酮洗涤固定化脂肪酶催化 剂3次，于4t:干燥24h，测定酶活力。所得固定化脂肪酶活力为150u/g，是对照酶活力的1. 5倍，半衰期延长6h，催化大 豆油转酯化反应延长使用5批次。
实施例2 a、脂肪酶液制备取15g酶粉溶于300ml 、 pH7. 0的磷酸缓冲液(0. 05mo1/ LK2HP04-KH2P04)，制得0. 05mg/ml的脂肪酶液。 b、脂肪酶固定化将lg经预处理的硅胶G加入40ml酶液中，于30°C 、 150rpm振荡 吸附2h。硅胶G预处理方法同实施例1。 c、固定化脂肪酶的分离和存放过滤分离得湿固定化酶，于4t:放置24h。
d、以乙酸乙酯为固定化酶处理剂，在20ml乙酸乙酯中加入lg湿固定化酶，于 3(TC、150rpm振荡处理1. 5h，抽滤得处理过的固定化酶，于4"放置24h，测定酶活力。
e、大豆油转酯化将22. 5g大豆油、llml正己烷及lg有机溶剂处理过的固定化酶 混合，于3(TC预热20min，按醇油摩尔比3 : 1平均分3次加入无水甲醇(每次加无水甲 醇1. lml)，于150rpm振荡反应24h，分析粗脂肪酸甲酯(棕榈酸甲酯4. 03g ;硬脂酸甲酯
1. 82g ;油酸甲酯7. 69g ;亚油酸甲酯4. 09g ;亚麻酸甲酯1. 47g)。 f、固定化脂肪酶催化剂回收转酯化反应结束后，用丙酮洗涤固定化脂肪酶催化 剂3次，于4t:干燥24h，测定酶活力。 所得固定化脂肪酶活力为180u/g，是对照酶活力的1. 8倍，半衰期延长8h，催化大 豆油转酯化反应延长使用3批次。
实施例3 a、脂肪酶液制备取15g酶粉溶于300ml 、 pH7. 0的磷酸缓冲液(0. 05mo1/ LK2HP04-KH2P04)，制得0. 05mg/ml的脂肪酶液。 b、脂肪酶固定化将lg经预处理的DM-130树脂加入50ml酶液中，于30°C 、 150rpm 振荡吸附2h。匿-130树脂预处理方法同实施例1。 c、固定化脂肪酶的分离和存放过滤分离得湿固定化酶，于4t:放置24h。 d、以丙醇为固定化酶处理剂，在40ml丙醇中加入lg湿固定化酶，于35°C 、 150rpm
振荡处理1. 5h，抽滤得处理过的固定化酶，于4t:放置24h，测定酶活力。 e、大豆油转酯化将22. 5g大豆油、llml正己烷及lg有机溶剂处理过的固定化酶
混合，于3(TC预热20min，按醇油摩尔比3 : 1平均分3次加入无水甲醇(每次加无水甲
醇1. lml)，于150rpm振荡反应24h，分析粗脂肪酸甲酯(棕榈酸甲酯4. 05g ;硬脂酸甲酯
1. 82g ;油酸甲酯7. 58g ;亚油酸甲酯3. 98g ;亚麻酸甲酯1. 54g)。 f、固定化脂肪酶催化剂回收转酯化反应结束后，用丙酮洗涤固定化脂肪酶催化
5剂3次，于4。C干燥48h，测定酶活力。 所得固定化脂肪酶活力为170u/g，是对照酶活力的1. 7倍，半衰期延长3h，催化大 豆油转酯化反应延长使用3批次。
权利要求
提高固定化脂肪酶活性和稳定性的方法，其特征在于包括如下步骤a、脂肪酶液制备取15g酶粉溶于300ml、pH7.0的磷酸缓冲液，制得0.05mg/ml的脂肪酶液；所述pH7.0的磷酸缓冲液组成为0.05mol/L K2HPO4-KH2PO4；b、脂肪酶固定化将1g经预处理的固定化载体加入30～50ml酶液中，于30℃、150rpm振荡吸附2h；所述固定化载体为活性炭、或硅胶G、或DM-130树脂，其预处理方法为用1mol/LHCl于室温下浸泡3h，然后水洗至中性；c、固定化脂肪酶的分离和存放过滤分离得湿固定化酶，于4℃放置24h；d、有机溶剂处理在20～50ml极性有机溶剂中加入1g湿固定化酶，于25～35℃、150rpm振荡处理1～1.5h，抽滤得处理过的固定化酶，于4℃放置24h，测定酶活力；所述有机溶剂为极性有机溶剂醇、酮、酯；e、大豆油转酯化将22.5g大豆油、11ml正己烷及1g有机溶剂处理过的固定化酶混合，于30℃预热20min，按醇油摩尔比3∶1平均分3次加入无水甲醇，于150rpm振荡反应24h；f、固定化脂肪酶催化剂回收转酯化反应结束后，用丙酮洗涤固定化脂肪酶催化剂3次，于4℃干燥24～48h，测定酶活力。
2. 根据权利要求1所述提高固定化脂肪酶活性和稳定性的方法，其特征在于步骤e的 有机溶剂处理中所述的醇为C2 C3醇；所述酮为C3 C4酮；所述酯为乙酸的C2 C4酯。
3. 根据权利要求1或2所述提高固定化脂肪酶活性和稳定性的方法，其特征在于步骤 e的有机溶剂处理中所述的醇为丙醇、或异丙醇；所述的酮为丙酮或丁酮；所述的酯为乙酸 乙酯或乙酸异戊酯。
全文摘要
一种提高固定化脂肪酶活性和稳定性的方法。采用能改变脂肪酶分子构象以及载体对脂肪酶的吸附状态的极性有机溶剂为处理剂，对吸附固定的脂肪酶浸泡适当时间而成；所述的固定化载体选取40目活性炭、或硅胶G、或DM-130树脂，所述的有机化合物选取醇、酮、酯中的一种为固定化酶处理剂。将吸附固定的脂肪酶浸泡于有机化合物处理剂中，再对浸泡的固定化脂肪酶进行分离收集和干燥处理，即得催化活性和稳定性得以提高的固定化脂肪酶。所得处理的固定化脂肪酶可用作于油脂的转酯化、合成或水解，其酶活力为对照的1.5～2.5倍、半衰期延长3～8h、催化大豆油转酯化反应延长使用3-6批。改善了固定化酶的使用性能。
文档编号C12N11/14GK101736000SQ200910249000
公开日2010年6月16日 申请日期2009年12月30日 优先权日2009年12月30日
发明者孙玉梅, 杜凯 申请人:大连工业大学