专利名称：基于scar分子标记快速检测副溶血弧菌的pcr特异扩增引物及检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测海水养殖动物病原菌的PCR特异扩增引物及检测试剂盒，尤其是一种检测准确性及灵敏性高、时间短、成本低的基于SCAR (Sequence characterized amplified region，特征性序列扩增区域)分子标记快速检测副溶血弧菌的PCR特异扩增 引物及检测试剂盒。
背景技术：
弧菌是海水养殖动物主要的条件致病菌，其中病原性弧菌能使养殖动物暴发性死 亡，与病毒、其他细菌或寄生虫等一起将会对海水养殖动物造成巨大的损害，被公认为是海 水养殖中最为严重的病害之一。如副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)可导致鱼、虾、 贝、海参等养殖动物大规模死亡，也给误食感染了副溶血弧菌食物的人类健康带来隐患。目 前，对弧菌的检测方法有生理生化鉴定技术、酶联免疫吸附试验、16S rRNA基因鉴定等，分 别存在如下不足生理生化鉴定技术耗时费力，检测的准确率低；酶联免疫吸附试验敏感 性不高；16S rRNA基因鉴定只能将致病弧菌鉴定到属，而无法鉴定到种。
发明内容
本发明是针对现有技术所存在的上述技术问题，提供一种检测准确性及灵敏性 高、时间短、成本低的基于SCAR分子标记快速检测副溶血弧菌的PCR特异扩增引物及检测
试齐U盒。本发明的技术解决方案是一种基于SCAR分子标记快速检测副溶血弧菌的PCR特 异扩增引物，其特征在于上、下游引物的核苷酸序列为上游引物VpaF 5 ‘ -ACTACCGAACACGGGCTGTAT-3 ‘；下游引物VpaR 5 ‘ -GGCTGGGCATCGTAATCAT-3 ‘。一种基于SCAR分子标记快速检测副溶血弧菌的检测试剂盒，其特征在于包含如 下试剂试剂I 用灭菌双蒸水溶解的PCR特异扩增上游引物VpaF和下游引物 VpaR的混合液，浓度为0. 5-2 μ M，上、下游引物的核苷酸序列为上游引物VpaF : 5 ‘ -ACTACCGAACACGGGCTGTAT-3 ‘；下游引物 VpaR 5 ‘ -GGCTGGGCATCGTAATCAT-3 ‘试剂II :dNTPs四种脱氧核苷酸的混合液，浓度为50 500 μ M ；试剂III :10XPCR 缓冲液:500mM KCl.pH 8. 4 的 IOOmM Tris-HClU5mM MgCl2 禾口 16mM 二硫苏糖醇；试剂IV =Taq DNA聚合酶，浓度为5U/μ 1 ；试剂V:灭菌双蒸水；试剂VI 作为阳性模板的副溶血弧菌的总DNA，浓度为50ng/y 1 ；试剂VII 含有IX上样缓冲液的DL2000DNA分子量，浓度为50ng/y 1。
本发明是利用RAPD (Random amplified polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA) 技术在各种弧菌中进行分析，发现了副溶血弧菌的差异特异性DNA片段，将差异特异性DNA 片段回收测序，然后再根据测得的序列转化成SCAR标记。设计并合成了用于检测副溶血弧 菌的PCR特异扩增上下游引物，组装检测试剂盒，可用培养的弧菌菌落直接做PCR反应进行 检测，无需提取弧菌基因组DNA，可以将弧菌鉴定到种。省时省力、简便、快速、准确、特异性 好、灵敏度高。可用于海水养殖动物养殖过程中副溶血弧菌的跟踪检测及海水环境监测，具 有很高的实用价值。
图1是用本发明实施例检测患溃疡病的牙鲆病灶的结果示意图。
具体实施例方式本发明实施例是利用200多条RAPD引物在副溶血弧菌 (Vibrioparahaemolyticus)(ATCC 17802)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)(ATCC 27562)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus) (ATCC 17749)、河弧菌(Vibrio fluvialis) (ATCC33810)、最小弧菌(Vibrio mimicus)(ATCC 33653)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi) (ATCC 33842)、坎氏弧菌(Vibrio campbellii) (ATCC 33864)和鲨鱼弧菌 (Vibriocarchariae) (ATCC 35084)等弧菌上开发并转化为副溶血弧菌的种属特异性SCAR 标记，其核苷酸序列为ACTACCGAACACGGGCTGTATACGTTTAGCGAAATGGATAGAAATGAAGGTGCAGAGCTCGCGTTTTTT CGCGGTAGTGAATCCGTCTCTTTGCCGATTAATGGCGATTATCCGTGTCATTTGGATATCAAAGAACCGTTGTTGGC GGTTGCTAATTATGGCTCTGGAAATGTTAGCGTATTTCAATTGGATCGCGATGGTAAACCGCTTGGTTTATTGGCGG ATTTATACGTTGATGGATGCGGGCCGAATTTAGAGCGCCAAACTTCTCCTCACGCTCATCAAGTCACGTTTTTAAAG CACAGTCATCAATTGGTTGTCGTAGACTTAGGCAGCGATAGCGTCCTTATTTATGATTACGATGCCCAGCC。本发明实施例是根据上述特异性SCAR标记，设计并合成了快速检测副溶血弧菌 的PCR特异扩增引物，其特征在于上、下游引物的核苷酸序列为上游引物VpaF 5 ‘ -ACTACCGAACACGGGCTGTAT-3 ‘；
下游弓丨物 VpaR 5 ‘ -GGCTGGGCATCGTAATCAT-3 ‘。本发明所设计的检测试剂盒含有如下试剂试剂I 用灭菌双蒸水溶解的PCR特异扩增上游引物VpaF(5 ‘ -ACTACCGAACAC GGGCTGTAT-3 ‘)和下游引物 VpaR (5 ‘ -GGCTGGGCATCGTAATCAT-3 ‘)的混合液，浓度为 0. 5-2 μ M ；试剂II :dNTPs四种脱氧核苷酸的混合液，浓度为50 500 μ M ；试剂III :10XPCR 缓冲液:500mM KCl.pH 8. 4 的 IOOmM Tris-HClU5mM MgCl2 禾口 16mM 二硫苏糖醇(DTT)；试剂IV =Taq DNA聚合酶，浓度为5U/ μ 1 ；试剂V 灭菌双蒸水(ddH20)；试剂vl 作为阳性模板的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) (ATCC17802) 的总DNA，浓度为50ng/ μ 1 ；
试剂VII 含有IX上样缓冲液的DL2000DNA分子量，浓度为50ng/y 1。用本发明实施例检测患溃疡病的牙鲆病灶致病性副溶血弧菌，按下述步骤进行(1)在超净工作台上用接菌环刮取溃疡病的牙鲆病灶，在2216E培养基上划线接菌，28°C培养10 12小时，当细菌菌落的直径在1 1. 5mm左右时可直接用于SCAR-PCR 反应；(2)在 200 μ 1 PCR 反应管中放 1μ 1试剂 Ι、2μ 1 试剂 ΙΙ、2· 5μ 1试剂ΙΙΙ、0· 5μ 1 试剂IV及19 μ 1试剂V，充分混勻；(3)用无菌牙签在2216Ε平板上随机挑取单菌落，再将单菌落置于上述PCR反应管中，用作细菌总DNA模版；(4)然后将PCR管放在热循环仪上进行扩增反应，反应的条件为94°C预变性5分钟，然后进行如下25个循环94°C变性30秒，58°C退火25秒，72°C延伸25秒；最后72°C延 伸7分钟，4°C保存；做检测样品；(5)在 200 μ 1 PCR 反应管中放 1μ 1试剂 Ι、2μ 1 试剂 ΙΙ、2· 5μ 1试剂 ΙΙΙ、0· 5μ 1 试剂IV及19 μ 1试剂V，充分混勻，然后将PCR管放在热循环仪上进行扩增反应，反应的条 件为94°C预变性5分钟，然后进行如下25个循环94°C变性30秒，58°C退火25秒，72°C延 伸25秒；最后72°C延伸7分钟，4°C保存；做阴性对照；(6)在 200 μ 1 PCR 反应管中放 1μ 1试剂 Ι、2μ 1 试剂 ΙΙ、2· 5μ 1试剂 ΙΙΙ、0· 5μ 1 试剂IV、18 μ 1试剂V及1 μ 1试剂VI，充分混勻；然后将PCR管放在热循环仪上进行扩增 反应，反应的条件为94°C预变性5分钟，然后进行如下25个循环94°C变性30秒，58°C退 火25秒，72°C延伸25秒；最后72°C延伸7分钟，4°C保存；做阳性对照；(7)分别取步骤(4)、(5)、(6)和试剂VII 3-5 μ 1经1 %琼脂糖凝胶电泳25-35分 钟后于紫外仪上观察，若在371bp处出现明亮的DNA条带，则为副溶血弧菌阳性；若无反应 条带显示，则为阴性。实际检测结果如图1所示，图中M :DL2000DNA分子量(试剂VII) ；1 副溶血弧菌 阴性对照(用试剂VI作DNA模版的SCAR-PCR结果)；2 副溶血弧菌阳性对照(用试剂V 的SCAR-PCR结果)；3 检测样品(用培养的细菌菌落做SCAR-PCR结果)。结果表明所检测患溃疡病的牙鲆病灶中有副溶血弧菌。序列表<110>大连水产学院<120>基于SCAR分子标记快速检测副溶血弧菌的PCR特异扩增引物及检测试剂盒<160>2<170>PatentIn Version 3. 1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature
<223> 引物<400>1actaccgaac acgggctgta t21<210>2<211>22
<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>2ggctgggcat cgtaatcat19
权利要求
一种基于SCAR分子标记快速检测副溶血弧菌的PCR特异扩增引物，其特征在于上、下游引物的核苷酸序列为上游引物VpaF5′-ACTACCGAACACGGGCTGTAT-3′；下游引物VpaR5′-GGCTGGGCATCGTAATCAT-3′。
2.一种基于SCAR分子标记快速检测副溶血弧菌的检测试剂盒，其特征在于包含如下 试剂试剂I 用灭菌双蒸水溶解的PCR特异扩增上游引物VaF和下游引物VaR 的混合液，浓度为0. 5-2 μ M，上、下游引物的核苷酸序列为上游引物VpaF 5 ‘ -ACTACCGAACACGGGCTGTAT-3 ‘；下游引物 VpaR 5 ‘ -GGCTGGGCATCGTAATCAT-3 ‘； 试剂II :dNTPs四种脱氧核苷酸的混合液，浓度为50 500 μ M ； 试剂 III :10XPCR 缓冲液:500mM KCl.pH 8. 4 的 IOOmM Tris-HClU5mM MgCl2 禾口 16mM 二硫苏糖醇；试剂IV =Taq DNA聚合酶，浓度为5U/μ 1 ； 试剂V:灭菌双蒸水；试剂VI 作为阳性模板的副溶血弧菌的总DNA，浓度为50ng/y 1 ； 试剂VII 含有IX上样缓冲液的DL2000DNA分子量，浓度为50ng/y 1。
全文摘要
本发明公开了一种基于SCAR分子标记快速检测副溶血弧菌的PCR特异扩增引物及检测试剂盒。上、下游引物的核苷酸序列为上游引物VpaF5′-ACTACCGAACACGGGCTGTAT-3′；下游引物VpaR5′-GGCTGGGCATCGTAATCAT-3′。试剂盒中包括用灭菌双蒸水溶解的PCR特异扩增上游引物VpaF和下游引物VpaR的混合液，浓度为0.5-2μM。可用培养的弧菌菌落直接做PCR反应进行检测，无需提取弧菌基因组DNA，省时省力、简便、快速、准确、特异性好、灵敏度高。该试剂盒可用于海水养殖动物养殖过程中副溶血弧菌的跟踪检测及海水环境监测，具有很高的实用价值。
文档编号C12Q1/04GK101805788SQ20091024906
公开日2010年8月18日 申请日期2009年12月31日 优先权日2009年12月31日
发明者仇雪梅, 王秀利, 田春雨 申请人:大连水产学院