专利名称：重组牙鲆白细胞介素6蛋白及制备方法
技术领域：
本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种操作简便、成本低廉、重组蛋白纯度好、得率高、适应于工业化生产的重组牙鲆白细胞介素6蛋白及制备方法。
背景技术：
牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我国名贵的海产鱼类，是我国重要海水养殖的 经济鱼类之一。牙鲆具有个体大，含有高蛋白、低脂肪、丰富的维生素Bi、维生素B2和维生 素D等营养物质。目前国内外市场需求量大，产品供不应求。但是，近年来在牙鲆养殖面积 不断扩大的同时，因海水水质受污染等造成的恶化，再加上管理不善、滥用药物等造成其免 疫力下降等，使养殖牙鲆的病害有逐年增加，成为阻碍这一产业发展的瓶颈。与高等脊椎 动物相比，鱼类免疫因子的研究起步较晚，但近年的研究进展较快。白介素是与鱼类致炎 作用以及调理功能密切相关的一个功能性免疫因子。白介素家族的典型成员包括了 IL-1， IL-2，IL-6等。研究表明在鱼的体内，白介素参与并且在免疫反应中发挥重要作用。白细 胞介素-6(IL-6)在多效性细胞因子调节免疫反应，急性作用，造血反应和炎症中起着重要 的作用。它是由许多不同的细胞产生并且作用于和B细胞，T细胞，肝细胞，造血祖细胞和 中枢神经系统细胞。白细胞介素_6与IL-I和TNF-I在急性反应中起着有力的诱导作用。 虽然Bo-Hye Nam等已报告比目鱼白细胞介素_6基因的分子克隆和测序。然而，从牙鲆中 直接提取该蛋白的操作复杂、成本高、产量少，不能大规模产业化生产。
发明内容
本发明提供一种操作简便、成本低廉、重组蛋白纯度好、得率高、适应于产业化生 产的重组牙鲆白细胞介素6蛋白及制备方法。本发明的技术解决方案是一种重组牙鲆白细胞介素6蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO :4。一种上述重组牙鲆白细胞介素6蛋白的制备方法，其特征在于按如下步骤进行a.提取新鲜牙鲆肾脏总RNA ；b.设计牙鲆白细胞介素6蛋白编码序列的引物对，以上述提取的总RNA为模板进 行RT-PCR扩增；c.电泳回收RT-PCR产物与克隆载体pMD19T连接并转化入大肠杆菌感受态细胞 DH5 α，在含氨苄青霉素的LB固体培养基上培养通过蓝白斑法筛选阳性克隆，选择618bp大 小的条带进行回收；d.用限制性内切酶BamH I和Xho I分别双酶切c步骤回收质粒和表达载体 pET-32a(+)，将得到的两种目的基因片断用DNA连接酶连接，转化入大肠杆菌感受态细胞 DH5 α进行培养并筛选提取重组表达质粒；e.将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)内，培养菌株得 菌液，用IPTG诱导菌液，收集菌种；
f.将所收集的菌种进行扩大培养，收集菌体；g.将菌体破碎、裂解、纯化，收集纯化液。所述引物对的核苷酸序列为上游引物IL-6F :5，-CAGGATCCGCTCCAGTCGAATACGAG-3，；下游引物IL-6R :5，-CGCTCGAGTGTCATTTGGTAAGAGGG-3，；所述PCR反应条件为94 V预变性5分钟后进行94 V变性30秒、64 V复性30秒、 72°C延伸1分的32个循环的扩增，72°C延伸7分钟后保存于4°C。所述e步骤是将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)后， 挑取单菌落接种于含有氨苄青霉素的5ml LB液体培养基过夜培养，再取50 μ 1过夜培养的 菌液接种于含有氨苄青霉素的5ml LB液体培养基，37°C、200转/分摇菌2. 5小时，至菌液 的0D600为0. 4，向菌液中加诱导剂IPTG至终浓度为lmM，37°C摇菌4小时后，回收菌体。所述g步骤是用PBS重悬f步骤所得菌体，用超声波破碎细菌并用孔径为0. 22 μ m 的过滤器过滤细菌裂解液，在4ml Bind buffer中加Iml 50%的Ni-NTAHisBind树脂悬液， 轻轻混勻，静置，待树脂沉淀后取沉淀；在沉淀中加4ml细菌裂解液，轻轻混勻后用振荡器 4°C，200rpm振荡1 2h形成混合液；将混合液移入纯化柱，用0. 5ml Elute buffer洗脱， 收集洗脱液。本发明根据GenBank中牙鲆白细胞介素6蛋白的DNA序列，设计针对白细胞介 素6蛋白编码序列的引物对，以TRIzol Reagent提取新鲜牙鲆肝脏总RNA后进行RT-PCR 扩增。RT-PCR产物与pMD19T载体连接得重组质粒，经双酶切后目的基因再与表达载体 pET-32a(+)连接，获重组表达质粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中；通过IPTG诱导实现了 重组蛋白的可溶性表达。因在表达过程中不产生包涵体，该表达质粒表达的融合蛋白带有 组氨酸标签，方便了样品的鉴定和纯化，避免了样品的变性和复性，不但操作简单，降低了 制作成本，更主要的是蛋白结构不受破坏；重组蛋白纯度好、得率高且不易降解，适应于工 业化生产，为进一步研究牙鲆白细胞介素6蛋白的功能奠定基础。
图1本发明实施例牙鲆肾脏总RNA的琼脂糖凝胶电泳分析图。图2本发明实施例牙鲆白细胞介素6蛋白目的基因的琼脂糖凝胶电泳分析图。图3本发明实施例重组表达质粒的双酶切电泳鉴定图。图4本发明实施例纯化柱洗脱组分的SDS-PAGE分析图。图5本发明实施例重组表达质粒表达产物的SDS-PAGE分析图。图6本发明实施例重组表达质粒诱导表达的蛋白印迹分析图。
具体实施例方式实施例a.以TRIzol Reagent提取新鲜牙鲆肝脏总RNA并反转录进行第一链的cDNA的 合成。牙鲆总RNA的琼脂糖凝胶电泳分析图如图1所示，图中1 :MakerDL2000 ；2、3 牙鲆总 RNA电泳条带。b.根据已发表的GenBank中牙鲆白细胞介素6蛋白基因保守序列设计针对白细胞介素6蛋白编码序列的引物对，以上述第一链cDNA进行PCR扩增，引物对的核苷酸序列 为上游弓|物 IL-6F :5，-caKgatccKctccagtcgaatacgag-3‘；下游弓丨物 IL-6R :5，-cgctcgagtgtcatttggtaagaggg-3‘。RT-PCR反应条件为94°C预变性5分钟后进行94°C变性30秒、64°C复性30秒、 72°C延伸1分的32个循环的扩增，72°C延伸7分钟后保存于4°C。引物对由上海生物工程有限公司合成，划线部分分别为BamH I酶切位点和Xhol 酶切位点。以牙鲆白细胞介素6第一链cDNA为模板，用PCR技术获得目的基因。目的基因的 琼脂糖凝胶电泳分析图如图2所示，图中1 :Maker DL2000 ；2-5 牙鲆白细胞介素6基因的 RT-PCR 产物。c.PCR电泳回收产物与克隆载体PMD19T连接并转化入大肠杆菌感受态细胞 DH5 a，在含氨苄青霉素的LB固体培养基上培养通过蓝白斑法筛选阳性克隆，选择618bp大 小的条带进行回收；d.用限制性内切酶BamH I和Xho I分别双酶切c步骤所提取的质粒和表达载体 pET-32a(+)，37°C作用 2 小时后，酶切产物用 DNA Fragment Purification Kit(Takara 公 司)回收，PMD19T-IL-6质粒酶切产物和载体酶切产物按5 1混合，T4DNA连接酶(Takara 公司)16°C过夜连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5ci于37°C过夜培养。提取重组表达质 粒pET-IL-6 ；用BamH I和Xho I对重组表达质粒双酶切鉴定，鉴定结果如图3所示图中 1 :pET-IL-6 质粒；2 :pET-IL-6 ；3 :Maker DL2000 经 BamH I 和 Xho I 双酶切产物。测序结 果表明，所测序列与其他牙鲆白细胞介素6编码序列同源性极高，故初步确认所提取的重 组表达质粒为牙鲆白细胞介素6的编码序列。e.将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)内，培养菌株得 菌液，挑取单菌落接种5ml Amp LB液体培养基过夜培养，取50 yl过夜培养的菌液接种5ml Amp LB液体培养基，37°C 200转/分摇菌2. 5小时，至0D600为0. 4，所摇菌液加诱导剂IPTG 至终浓度为ImM，37°C摇菌4小时后，回收菌体，即得到菌种。f.将所收集的菌种进行扩大培养，收集菌体；g.用 BugBuster Ni-NTA His Bind Purification kit(Novagen 公司)纯 化融合蛋白，具体操作步骤是用PBS重悬f步骤所得菌体，用超声波破碎细菌并用孔径为 0. 22um的过滤器过滤细菌裂解液，除去其中的大颗粒。在4ml Bindbuffer中加1ml 50% 的Ni-NTA His Bind树脂悬液，轻轻混勻，静置，待树脂沉淀后用移液枪吸去上清液取沉淀； 在沉淀中加4ml细菌裂解液，轻轻混勻后用振荡器4°C，200rpm振荡1 2h形成混合液；将 混合液移入纯化柱，打开底部的盖子，收集液体；用4ml Wash buffer洗涤，收集洗涤液；用 0.5ml Elute buffer洗脱，收集洗脱液。SDS-PAGE分析各收集液，其结果如图4所示图中 1 蛋白Marker ；2 纯化蛋白部分。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子 克隆实验室手册(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条 件，或按照制造厂商所建议的条件。重组牙鲆白细胞介素6(IL_6)的鉴定
1.SDS-PAGE 电泳配制12%的分离胶和5%的浓缩胶。将诱导前的样品和诱导后的样品各取20 yl 分别加入20 ill 2XSDS loading buffer混勻，沸水煮5分钟，12000转/分离心10分钟， 留取上清做SDS-PAGE。120V恒压电泳2h、考马斯亮蓝R250染色2小时、脱色液脱色。观察，在43. 68kDa处有明显条带出现，如图5所示，图中1 蛋白Marker ;2_4 pET-IL-6诱导后表达蛋白；5 :pET-IL-6诱导前产物；6 :pET32a(+)诱导前产物；7 pET32a(+)诱导后表达蛋白。2. Western Blot 鉴定当SDS-PAGE电泳即将结束时，用蒸馏水洗清石墨板并擦干。从SDS-PAGE胶上切下 需要转膜的部分，切6张滤纸和1张硝酸纤维素膜(NC)。把硝酸纤维素膜浸没于去离子水 的水面中，滤纸浸没于转移缓冲液中，平衡5分钟。按纸、膜、胶、纸的顺序从阳极到阴极摆 放正确，连接电源，注意正负极。根据凝胶面积按0. 65-1. OmA/cm2接通电流，电转移0. 5_2h。 转移结束后，切断电源，从上至下拆卸装置，逐一拆去各层。在NC上作标记。把凝胶取出 进行抗体标记。硝酸纤维素膜放在密封的塑料袋中，内加封闭液和Anti-His Antibody。 (Anti-HisAntibody为1 1000稀释)，37°C摇床中温育lh。37°C摇床中温育lh。取出硝 酸纤维素膜，用PBS漂洗3次，每次10分钟。滤膜再用TBST漂洗10分钟。硝酸纤维素膜放在密封的塑料袋中，内加封闭液和1 2000稀释的HRP标记的羊 抗鼠酶标二抗。37°C摇床中温育lh。取出NC膜，用PBS漂洗4次。将NC膜放在底物液中直 到有条带出现(一般l-5min)，取出NC在水中漂洗一下，放在PBS中。观察结果，在43. 68KDa 处有一条特异性免疫条带。如图6所示，图中1 诱导后的pET-IL-6，和预期的pET-IL-6大 小一致；2 蛋白Marker。序列表<110>大连水产学院<120>重组牙鲆白细胞介素6蛋白及制备方法<160>4<170>Patentin Version 3. 1<210>1<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>1caggatccgc tccagtcgaa tacgag26<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列
<220><221>misc_feature<223> 引物<400>2cgctcgagtg tcatttggta agaggg26<210>3<211>618<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<223>牙鲆白细胞介素6蛋白基因<400>3gctccagtcgaatacgagcccaccgacagtcctgcaggtgacttttcaggtgaggagcag60gaggtgacccctgaccttttaagcgcctcaccggtgtgggacttgatcatcggtgtaacc120gctcaccaccagaaagagtttgaggatgaattccaacaggaagtgaaatatcgttttctg180aaccactacaaactctcctcactgccagcagactgccccagtgccaacttcagcaaggag240gcttgtctccaaaggttggctgaaggcctgcacacctacatggttctttttaagcacgtg300gagaaggagtacccgagcagctccatcctcttgcacgccagatatcacagcggggcactg360atcggcctcatcaaagaaaagatgaggaaccctggtcaggtgaccgtcccgaccagcaga420caggagcagcagctgctgcaagacatggacaaccccagcactttccacaggaagatgacg480gcgcacaacatcctgcggcagctccacaacttcctccgcaatgggaaggtggcaattcgt540aaaagagagatgcccaaacagaagaggagaaaggatgatggaattattccacccatccat600ccctcttaccaaatgaca618<210>4<211>376<212>PRT<213>人工序列
<220><221>CDS<223>牙鲆白细胞介素6蛋白<400>4Ala Pro Val Glu TyrGlu Pro Thr Asp Ser ProAla Gly Asp Phe15 1015Ser Gly Glu Glu GlnGlu Val Thr Pro Asp LeuLeu Ser Ala Ser20 2530Pro Val Trp Asp LeuLie Lie Gly Val Thr AlaHis His Gln Lys35 4045Glu Phe Glu Asp GluPhe Gln Gln Glu Val LysTyr Arg Phe Leu50 5560Asn His Tyr Lys LeuSer Ser Leu Pro Ala AspCys Pro Ser Ala65 7075Asn Phe Ser Lys GluAla Cys Leu Gln Arg LeuAla Glu Gly Leu80 8590His Thr Tyr Met ValLeu Phe Lys His Val GluLys Glu Tyr Pro95 100105Ser Ser Ser lie LeuLeu His Ala Arg Tyr HisSer Gly Ala Leu110 115120lie Gly Leu lie LysGlu Lys Met Arg Asn ProGly Gln Val Thr125 130135Val Pro Thr Ser ArgGln Glu Gln Gln Leu LeuGln Asp Met Asp140 145150Asn Pro Ser Thr PheHis Arg Lys Met Thr AlaHis Asn lie Leu155 160165Arg Gln Leu His AsnPhe Leu Arg Asn Gly LysVal Ala lie Arg170 175180Lys Arg Glu Met ProLys Gln Lys Arg Arg LysAsp Asp Gly lie185 190195lie Pro Pro lie HisPro Ser Tyr Gln Met Thr200 20权利要求
一种重组牙鲆白细胞介素6蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO4。
2.一种如权利要求1所述重组牙鲆白细胞介素6蛋白的制备方法，其特征在于按如下 步骤进行a.提取新鲜牙鲆肾脏总RNA；b.设计牙鲆白细胞介素6蛋白编码序列的引物对，以上述提取的总RNA为模板进行 RT-PCR 扩增；c.电泳回收RT-PCR产物与克隆载体pMD19T连接并转化入大肠杆菌感受态细胞 DH5 α，在含氨苄青霉素的LB固体培养基上培养通过蓝白斑法筛选阳性克隆，选择618bp大 小的条带进行回收；d.用限制性内切酶BamHI和Xho I分别双酶切c步骤所提取的质粒和表达载体 pET-32a(+)，将得到的两种目的基因片断用DNA连接酶连接，转化入大肠杆菌感受态细胞 DH5 α进行培养并筛选提取重组表达质粒；e.将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)内，培养菌株得菌 液，用IPTG诱导菌液，收集菌种；f.将所收集的菌种进行扩大培养，收集菌体；g.将菌体破碎、裂解、纯化，收集纯化液。
3.根据权利要求2所述的重组牙鲆白细胞介素6蛋白的制备方法，其特征在于所述引 物对的核苷酸序列为上游弓I物 IL-6F 5' -caggatccgctccagtcgaatacgag-3‘；下游弓I物 IL-6R 5' -cgctcgagtgtcatttggtaagaggg-3，；所述RT-PCR反应条件为94°C预变性5分钟后进行94°C变性30秒、64°C复性30秒、 72°C延伸1分的32个循环的扩增，72°C延伸7分钟后保存于4°C。
4.根据权利要求3所述的重组牙鲆白细胞介素6蛋白的制备方法，其特征在于所述e 步骤是将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)后，挑取单菌落接种 于含有氨苄青霉素的5ml LB液体培养基过夜培养，再取50 μ 1过夜培养的菌液接种于含有 氨苄青霉素的5ml LB液体培养基，37°C、200转/分摇菌2. 5小时，至菌液的0D600为0. 4， 向菌液中加诱导剂IPTG至终浓度为ImM，37°C摇菌4小时后，回收菌体。
5.根据权利要求4所述的重组牙鲆白细胞介素6蛋白的制备方法，其特征在于所述g 步骤是用磷酸盐缓冲液(PBS)重悬f步骤所得菌体，用超声波破碎细菌并用孔径为0. 22 μ m 的过滤器过滤细菌裂解液，在4ml Bind buffer中加lml50%的Ni-NTA His Bind树脂悬 液，轻轻混勻，静置，待树脂沉淀后取沉淀；在沉淀中加4ml细菌裂解液，轻轻混勻后用振荡 器4°C，200rpm振荡1 2h形成混合液；将混合液移入纯化柱，用0. 5ml Elute buffer洗 脱，收集洗脱液。
全文摘要
本发明公开一种重组白细胞介素6蛋白及制备方法，根据牙鲆白细胞介素6蛋白的DNA序列，设计引物对并以TRIzol Reagent法提取新鲜牙鲆肾脏总RNA并进行RT-PCR扩增，PCR产物与pMD19T载体连接得重组质粒，经双酶切后再与表达载体pET-32a(+)连接，获重组表达质粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中；通过IPTG诱导实现了重组蛋白的可溶性表达。因在表达过程中不产生包涵体，该表达质粒表达的融合蛋白带有组氨酸标签，方便了样品的鉴定和纯化，避免了样品的变性和复性，不但操作简单，降低了制作成本，更主要的是蛋白结构不受破坏；重组蛋白纯度好、得率高且不易降解，适应于工业化生产，为进一步研究牙鲆白细胞介素6蛋白的功能奠定基础。
文档编号C12N15/24GK101805404SQ20091024906
公开日2010年8月18日 申请日期2009年12月31日 优先权日2009年12月31日
发明者仇雪梅, 刘洋, 张峰, 潘秋丽, 王秀利, 袁野 申请人:大连水产学院