一种建立高效表达人环氧合酶2的重组人肠癌细胞株的方法及应用的制作方法

专利名称：一种建立高效表达人环氧合酶2的重组人肠癌细胞株的方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属基因工程制药技术及应用领域，涉及一种建立高效表达人环氧合酶 2(C0X-2)的重组人肠癌HCT-116细胞株HCT-116ωχ_2的方法及应用，具体地说，本发明涉及 建立稳定转染含人环氧合酶2(C0X1)基因启动子编码序列和荧光素酶报告基因序列的永 生化哺乳动物细胞系，通过压力筛选和基因扩增后，获得稳定、灵敏、高效表达C0X-2的肿 瘤克隆细胞株，并将细胞株应用于以C0X-2基因为靶点的抗肿瘤药物的筛选及评价。
背景技术：
研究表明，环氧化酶(CyClOOXygenaSe，C0X)是前列腺素(PGs)合成过程中一个重 要的限速酶，可将花生四烯酸代谢成各种前列腺素产物，从而维持机体的各种病理生理过 程。目前发现哺乳动物的环氧化酶至少有C0X-1和C0X-2两个同工酶，C0X-1在组织中的 表达相当稳定，对维持胃和肾功能的平衡发挥重要的作用，而C0X-2的表达在不同的组织、 不同的状况下变动很大，它的主要产物是环前列腺素和PGE2。现有技术公开了 C0X-2基因全长8. 3kb,由10个外显子和9个内含子组成，定位 于第1号染色体Icf 2 25_3，由5’端0. Skb的转录起始点上游区，61Λ的蛋白质编码区以及 1.5kb 3，端非编码区组成，其mRNA约4. 51Λ，基因编码603或604个氨基酸，含有17个氨 基酸残基构成的信号肽，与C0X-1有59%-61%的同源性。在其5’旁侧区，含有几个可能 的转录调节序列，包括转录起始位点上游25bp位处共同的TATA框序列。一个C/EBP基序， 两个AP-2位点，三个SP1位点，两个NF- κ B位点，一个CRE基序和一个EST-I位点。在蛋白 质编码区，C0X-2基因的ORF起始于CTGCGATGC序列，由10个外显子编码。在3，旁侧区， 整个3’UTR包含于外显子10，其间无内含子存在，有三个富含腺嘌呤核苷酸的序列M TAAA， 相互之间相隔^Obp。C0X-2发现于某些细胞中，主要定位于核膜。因此，C0X-2产生的Pk产物可进入 核内，调节靶细胞基因的转录。研究表明C0X-2不仅是启动炎症反应的关键酶，而且其表达 和与肿瘤的发生、增殖、分化、浸润、转移及预后等方面有重要作用。研究提示，C0X-2主要通 过以下途径导致胃癌的发生(1)C0X作为一种刺激因子在静息状态下不表达，只有在某些 恶性细胞中，可能由于癌基因的激活或抑癌基因的失活而被活化，C0X-2的转录后失控，使 C0X-2过度表达，C0X-2的过氧化酶活化可催化一系列异体氧化反应，参与氧化诱癌途径， 从而形成致癌物；(2) C0X-2通过催化形成Pk促进肿瘤的发生，C0X-2通过催化反应可产生 PGG、PGH、PGE，其中PGE为其主要代谢产物，可诱导细胞增殖，促进细胞粘附，抑制具有免疫 调节功能的淋巴因子的产生，抑制T细胞和B细胞增殖，降低机体对肿瘤细胞的局部免疫反 应；(3)C0X-2过度表达可增加PGE2的合成，PGE2诱导细胞增殖并刺激Bcl_2蛋白表达，降 低介导凋亡的转化生长因子- β (TGF-β )2型受体水平，降低介导细胞间粘附的E-钙粘蛋 白(E-cadherin)活性，从而抵抗各种刺激诱导的细胞凋亡，促进细胞增殖，引起肿瘤的发 生；(4)C0X-2促进PG合成的增加如PGE1、PGE2和15d_PGJ等作用于EP2、EP4及PPARr等，
4通过EP/cAMP等途径激活各种胞内激酶如PKA、Ras蛋白活性，诱导VEGFmRNA和蛋白表达 水平上调，参与肿瘤新生血管的形成，促进肿瘤的转移；( C0X-2可使细胞周期存在明显G1 期推迟，而且Cyclin D1蛋白激酶、Rb1激酶和细胞周期依赖激酶(⑶K4)活性明显下降，这 样通过阻碍细胞周期，阻止延长细胞生存期，增强对胞外基质的粘附，而异常延长细胞生存 期使一系列基因突变，促进肿瘤形成。另外，C0X-2可促进肿瘤细胞相关血管的生成，增加 癌细胞的侵袭性，激活基质金居蛋白酶2降解细胞外基质，产生促血小板凝集的血栓烷等， 从而有利于肿瘤的侵袭和转移。C0X-2在肿瘤发生、发展和转移的整个过程中起着重要的作用，参与了肿瘤形成的 多个环节。因此，对肿瘤组织或肿瘤细胞中C0X-2活性检测可以作为监测肿瘤的发生发展 的一个重要手段，同时C0X-2在细胞中的基因表达水平也可以作为抗肿瘤药物筛选的一个 重要指标。荧光素酶报告基因(Iuc)根据来源不同主要分为细菌荧光素酶 (bacterialluciferase，BL)、萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, FL)以及以海星、发 光鱼、发光甲虫等为来源的荧光素酶，目前研究最广泛并且成为商品酶的是BL和FL。BL是 由2个多肽亚基组成的异源二聚体，相对分子质量约为79X 103。在还原性黄素(FMNH)、 八碳以上长链脂肪醛(RCHO)和氧分子(O2)存在时，发射出蓝绿光G50-490nm)。FL由单 一的多肽链组成，相对分子质量为(60 64) X IO3,在Mg2+、ATP、O2存在时催化D-荧光素 (D-Luciferin)氧化脱羧发光(550 580nm)。由于Iuc的检测方法简便，灵敏度高，因而成 为目前应用最广泛的报告基因之一，其主要应该于基因表达研究、蛋白质间相互作用研究、 毒性物质检测研究、RNAi研究等。荧光素酶基因已被广泛应用于不同启动子下外源基因表达强度和转录调控的研 究的报告基因。该报告基因的灵敏度高，对于研究低水平表达如弱启动子的调控方式有较 大的意义。实践表明，荧光素酶检测的最大优点是不损害监测对象，便于在整体水平或离体 器官内测定基因产物是否表达。可见光的形成使观察基因的空间表达成为可能，为研究细 胞分化、细胞问联络、基因的空间表达和生物(或细胞)间的相互作用提供了新的途径。

发明内容
本发明的目的是为研究肿瘤相关基因的表达提供一种更为直接、便捷、敏感的 技术手段。涉及一种建立高效表达人环氧合酶2 (C0X-2)的重组人肠癌HCT-116细胞株 HCT-116cox-2的方法，具体地说，本发明涉及建立稳定转染含人环氧合酶2 (COX-幻基因启动 子编码序列和荧光素酶报告基因序列的永生化哺乳动物细胞系，通过压力筛选和基因扩增 后，获得稳定、灵敏、高效表达C0X-2的肿瘤克隆细胞株。本发明在前期构建的pGL3-BasiC-C0X-2重组质粒的基础上，采用含荧光素酶基 因(lUC2/I hlUC)和药物筛选基因抗性位点的新型载体质粒pGL4系列载体，构建新的重组 质粒pGL4-C0X-2，使该重组质粒在原来pGL3-BasiC-C0X-2重组质粒只具备萤火虫荧光素 酶基因的基础上，同时含有一个可以进行稳定转染的抗性基因；通过将重组质粒稳定转染 哺乳动物细胞，用药物对细胞进行筛选，建立一种稳定表达C0X-2基因和荧光素酶报告基 因的重组细胞极株。具体而言，本发明运用基因重组和分子克隆技术，扩增人C0X-2基因启动子序列，将扩增出的C0X-2基因基因子序列和pGL4系列载体质粒运用酶切、酶连、基因筛选等基因 重组技术进行克隆，得到连接产物然并转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，制备出的含C0X-2 基因启动子和荧光素酶报告基因的重组质粒。将构建好的重组质粒与含海肾荧光素酶报告 基因内参质粒瞬时共转染肿瘤细胞，通过检测细胞的双荧光素酶活性证实重组质粒能在细 胞内稳定表达。再将重组质粒进行稳定转染，通过药物进行加压筛选，将质粒序列完全整合 到细胞内，使其能够在肿瘤细胞内稳定表达C0X-2基因启动子的活性，建立稳定表达C0X-2 基因和荧光素酶报告基因的重组肿瘤细胞株。分别通过在体外细胞和体内动物实验检测抗 肿瘤药物对重组肿瘤细胞的抑制作用，来反映抗肿瘤药物对C0X-2基因启动子转录活性的 影响，评价药物的抗癌效能，从而广泛的应用于以C0X-2为靶点抗肿瘤药物的筛选。本发明建立高效表达人环氧合酶2的重组人肠癌细胞株的方法包括如下步骤1，构建稳定表达C0X-2基因和荧光素酶报告基因的重组质粒pGL4-C0X-2，通过提取人C0X-2基因启动子，以含荧光素酶报告基因的PGL4系列质粒为载体， 插入C0X-2基因启动子，构建含C0X-2基因启动子和荧光素酶报告基因的pGL4-C0X-2重组 质粒；本发明中，可采用的载体质粒主要有pGL4. 14-22和pGL4. 76-84、其中最常用的是 pGL4. 17[luc2/Neo] (5599bp)和 pGL4. 79[hRluc/Neo] (4879bp)，本发明以 pGL4. 17[luc2/ Neo]为例构建重组质粒，并将重组质粒命名为pGL4. 17-C0X-2 ；所述的报告基因选自萤火虫荧光素酶或海肾荧光素酶基因，主要包括luc2、 luc2P、luc2CP 和 hRluc、hRlucP、hRlucCP，其中 luc2 和 luc2P 为最常用的报告基因；构建上述重组质粒PGL4-C0X-2，通过以下步骤1)制备含有C0X-2基因启动子目的序列(1)提取含有C0X-2基因启动子人基因组DNA ；(2) PCR扩增、纯化C0X-2基因启动子目的序列；2)大量制备pGL4. 17载体质粒3)构建稳定表达C0X-2基因启动子的重组质粒(1) C0X-2基因启动子目的序列和pGL4. 17载体质粒的双酶切；(2) C0X-2基因启动子目的序列和pGL4. 17载体质粒连接；(3)连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，含Amf的琼脂平板筛选阳性克隆；(4)阳性克隆单菌落的PCR鉴定，剔除假阳性菌落；(5)挑取阳性克隆单菌落摇菌，大量扩增提取制备重组质粒；(6) PCR、双酶切及测序鉴定重组质粒。本发明中，所述的重组质粒中所含的载体质粒为含稳定转染抗生素筛选基因的质 粒，其包括HygrcANec/和Pure/。其中最常用的是Nec/基因。本发明中，所述的重组质粒中包含多酶切位点和β -内酰胺酶基因。本发明中，所述的重组质粒中所包含的载体质粒和人环氧合酶2基因启动子均含 有Bgl II和Hind III双酶切位点 本发明中，所述的荧光素酶报告基因选自萤火虫荧光素酶或海肾荧光素酶基因。
本发明中，所述的人环氧合酶2基因启动子序列，其长度为250_700bp，优选长度 为 562bp，序列中包含 NF- κ B、NF-IL6、SP-1、AP-2、CRE、E-Box 转录位点和 TATA 框。
本发明中，所述的萤火虫荧光素酶或海肾荧光素酶基因包括luc2、luc2P、luc2CP 和 hRluc、hRlucP、hRlucC。2，建立高效表达人环氧合酶2 (C0X-2)的重组细胞株HCT_116G°X_2稳定转染含C0X-2基因启动子和荧光素酶报告基因的PGL4-C0X-2重组质粒到人 肠癌HCT-116细胞株(市购)，通过药物加压筛选、基因扩增后，获得稳定、灵敏、高效表达 C0X-2基因的克隆细胞株，该细胞株在高效表达C0X-2的同时能稳定表达萤火虫荧光素酶 或海肾荧光素酶活性；建立上述高效表达人环氧合酶2(C0X_2)的重组细胞株HCT_116G°X_2通过以下步 骤1)确定G418的筛选HCT-116细胞的最低筛选浓度；2)pGL4. 17-C0X-2重组质粒稳定转染HCT-116细胞；3)G418筛选稳定转染后的HCT-116细胞；(1)重组质粒转染HCT-116细胞24h后加入G418筛选；(2)阳性单克隆细胞簇接种及传代培养；(3) RT-PCR或flfestern Blot鉴定单克隆细胞株的真阳性；4)稳定传代培养的细胞进行荧光素酶活性检测。本发明的进一步目的是提供上述稳定表达C0X-2基因和荧光素酶报告基因的重 组人肠癌HCT-116 x_2细胞株的应用。本发明通过体外实验和体内实验，验证抗肿瘤药物对C0X-2基因启动子转录活性 的影响，评价药物的抗癌效能，结果证实，所述的细胞株可应用于以C0X-2基因为靶点的抗 肿瘤药物的筛选和评价。本发明中，体外实验采用不同浓度的抗肿瘤药物作用于正常人肠癌HCT-116细胞 株和高表达C0X-2基因的HCT_116g°x_2细胞株，作用不同时间后检测抗肿瘤药物对两种细胞 的生长抑制作用及对HCT-116 x_2细胞株荧光素酶活性的影响；体内实验包括将正常的人肠癌HCT-116细胞和高表达C0X-2基因的重组人肠癌 HCT-116ωχ_2细胞株接种于裸小鼠皮下，建立裸小鼠人肠癌皮下移植瘤，使用抗肿瘤药物治 疗裸小鼠，治疗后检测裸小鼠瘤体大小、C0X-2蛋白和mRNA的表达；通过以下步骤1) HCT-116ωχ_2细胞株筛选抗肿瘤药物(1)正常培养HCT-116ωχ_2细胞并稳定传代；(2)抗肿瘤药物对HCT-I 16g°x_2细胞生长抑制作用的检测；(3)抗肿瘤药物对HCT-116 X_2细胞荧光素酶活性的影响；2)建立人肠癌HCT-I 16g°x_2细胞裸小鼠移植瘤模型(1)重组人肠癌HCT_116g°x_2细胞株皮下接种裸小鼠，连续传代；(2)取生长旺盛的瘤组织接种裸小鼠右侧腋窝，建立裸小鼠人肠癌移植瘤模型；3)抗肿瘤药物对人肠癌HCT-116 x_2细胞裸小鼠移植瘤模型C0X-2表达的影响(1)不同浓度抗肿瘤药物给药裸小鼠移植瘤模型；(2)检测裸小鼠瘤体大小、C0X-2蛋白和mRNA的表达。本发明中，所述的抗肿瘤药物，包括抗肿瘤的化学、生物类药物，中药复方、中药单体和单味中药提取物。本发明通过建立重组人肠癌HCT_116G°X_2细胞株的方法，可进一步建立一个可广泛 应用于表达其它相关基因(如HIF-1、NF-KB等)的技术平台，进而将此方法广泛应用于现 代基因工程制药领域。本发明方法建立的重组人肠癌HCT_116G°X_2细胞株具有以下优点能稳定表达人环氧合酶2(C0X1)基因启动子，可以快速、高效的合成环氧合酶2 蛋白，广泛的应用于筛选以C0X-2基因为靶点的抗肿瘤药物；含有荧光素酶报告基因(luc2或hRluc)，能稳定表达萤火虫荧光素酶或海肾荧光 素酶活性，在各种细胞实验中，可以通过检测荧光活性来间接反映细胞内C0X-2基因的表 达水平，克服其他通过mRNA或蛋白的检测来反映C0X-2基因的表达水平；建立的重组人肠癌HCT-116ωχ_2细胞株能够稳定传代培养，传代后细胞内C0X-2基 因启动子和荧光素酶报告基因的生物学性状不会发生改变。


图1. C0X-2基因启动子序列的克隆，其中，Marker 为 DL2000，1、2、3、4 为 C0X-2 基因启动子片段(562bp)。图2. pGL4. 17-C0X-2重组质粒的Bgl II和Hind III双酶切及PCR结果，其中，Marker 为 DL2000,1 为 pLG4. 17-C0X-2 重组质粒 PCR 扩增结果(562bp)，2 为 pLG4. 17-C0X-2 重组质粒双酶切结果(5599+562bp)，3 为 pLG4. 17-C0X-2 重组质粒(6161bp)，4 为 pLG4. 17 载体质粒(5599bp)。图3. pGL4. 17_C0X_2重组质粒测序比对结果。图4. pGL4. 17-C0X-2重组质粒构建概要图。图5. pGL4. 17_C0X_2重组质粒与内参质粒共转染人肠癌HCT-116细胞的双荧光素 酶活性。图6.抗肿瘤药物对重组的人肠癌HCT_116g°x_2细胞株生长抑制作用的比较。图7.不同浓度抗肿瘤药物对重组的人肠癌HCT-116 X-2细胞株荧光素酶活性的影 响。图8. Tan IIA对裸小鼠人肠癌HCT-116ωχ_2细胞移植瘤模型瘤体作用比较。图9. Tan IIA对裸小鼠人肠癌HCT-116G°X_2细胞移植瘤模型C0X_2mRNA表达的影 响。
具体实施例方式下面通过实施例和说明书附图对本发明的方案做进一步的说明，但实施例和说明 书附图仅对本发明作必要性的解释，其中的实例决不意味着对本发明内容的限制。实施例lpGL4. 17-C0X-2重组质粒的构建根据已知人的C0X-2基因启动子序列[GenBank (gi | 4506264)]设计并合成两端引 物
上游(5’端)引物包含C0X-2基因启动子互补碱基，一个Hind III识别位点，三 个保护碱基，5’ -CCCAAGCTTCCTGGACGTGCTCCTGAC-3’。下游(3’端)引物包含C0X-2基因启动子互补碱基，一个Bgl II识别位点，二个 保护碱基，5，-GAAGATCTTCCTCGACCCTCTAAAGACG-3，。以人基因组DNA为模板，利用常规PCR反应进行扩增，扩增体系为基因组 DNA2y L、2. 5mM 的 dNTP 4 μ LUOXbuffer 5 μ L、10 μ M 的上下游引物各 1 μ L、高保真 Taq 酶1 μ L，加水至50 μ L，反应条件为95°C预变性!Min ；94°C变性30s、65°C退火45s、72°C 延伸lmin，共35个循环；72°C终末延伸5min，最后4°C保温。扩增得到约562bp的目的 片段(图1)，将目的片段纯化回收后与载体质粒PGL4. 17均进行Bgl II和Hind III双 酶切，酶切体系为pGL4. 17/C0X-2 目的片段(10 μ L/30 μ L)、IOU/μ L 的 Bgl II 和 Hind III 各 2. 5 μ LUOXTango Buffer 5 μ L，加水至 50 μ L，37°C 酶切过夜(8_12h)。将回收 纯化后得到的两个线性片段用T4DNA连接酶进行酶连，体系为C0X-2启动子片段回收产 物(50ng/y L)5y L、pGL4. 17-C0X-2 回收产物(200ng/ μ L) 1 μ LUO X Buffer 2 μ L、T4DNA ligase (5U/μ L，Fermentas) 1 μ L，加水至20 μ L，16°C酶连5_8h，也可酶连过夜。将酶连产 物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，经过含氨苄青霉素的LB固体培养基筛选，在得到转化子 的平板上随机挑取单菌落进行PCR扩增，得到的阳性菌落进行摇菌扩增质粒，提取质粒后 进行PCR、Hind III和Bgl II双酶切(图2)及测序(图3)鉴定，证实与目的序列一致。实施例2重组质粒pGL4. 17_C0X_2转染肿瘤细胞及双荧光素酶活性检测将培养于含有10%新生牛血清、100U/ml青霉素、100μ g/ml链霉素RPMI-1640完 全培养基中人肠癌HCT-116细胞株，按0. 5 X IO5/孔的量在M孔板中接种对数生长期的细 胞，在37°C 5% CO2培养箱中过夜培养，直到细胞密度达到80%以上。将上述常规培养的人肠癌HCT-116细胞随机分为阴性对照组、重组质粒组和阳性 对照组，分别按如下剂量加入不同质粒进行共转染(1)阴性对照组:pGL4. 17 (0. 25 μ g) +pRL-TK (0· 25 μ g)，η = 3(2)重组质粒组:pGL4. 17-C0X-2 (0· 25 μ g) +pRL-TK (0· 25 μ g)，η = 3(3)阳性对照组:pGL3-Basic-C0X-2 (0. 25 μ g)+pRL-TK (0· 25 μ g)，η = 3在灭菌后的1.5ml离心管中配制待转染质粒和内参质粒pRL_TK、转染脂质体 Transfectam Reagent 复合物如下将待转染质粒、内参质粒pRL-TK各0. 25 μ g/孔稀释至50 μ L/孔不含血清和抗生 素的RPMI-1640中，轻柔混均后静置5min。然后将转染脂质体悬液(1 μ L/孔)加入50 μ L/ 孔不含血清和抗生素的RPMI-1640中，轻柔混均后静置5min。最后将两者混合在一起，充分 混勻静置20min，使质粒DNA与转染脂质体充分结合，形成DNA/脂质体复合物。吸除M孔板中的培养液，用不含血清和抗生素的RPMI-1640培养液润洗一遍，然 后在每个孔中加入100 μ L对应的DNA/脂质体复合物。在37°C、5% CO2培养箱中培养3- 后，向各孔加入1000 μ 1含RPMI-1640完全培养基。继续培养后收集样品，进行双 荧光素酶检测。按照 Progega 公司的 Dual-Luciferase Reporter Assay 试剂盒说明书指导 配制工作液IXPLB(细胞裂解液)、LAR II (萤火虫荧光素酶检测液)、1ΧΜορ & Glo Reagent (海肾荧光素酶检测液)。将上述各组共转染后的HCT-116细胞培养对-4他后收
9集样品。用PBS润洗一遍，加入100 μ L/孔的1 XPLB裂解液(M孔)，摇床室温下200rpm 摇动 15min。取 100 μ L 的 LAR II 于 1. 5mL 的离心管内，放入 GloMax 20/20 Iuminometer 化学发光检测仪，加入20 μ L的细胞裂解液于离心管中，发光仪测读10s。检测完成后，再加 入100 μ L的IXMop & Glo Reagent，发光仪测读IOsec。记录检测数据。表1是不同质粒转染MKN45细胞后的萤火虫荧光素酶活性的比较结果。表 1.
_Group_Firefly_Renilla_Fire/ren
6895647 3.69799E-05 7889634 4.3855E-05 6564728 3.01612E-05 7564325 0.029699544 8232194 0.028787465 8896532 0.029857927 7648734 0.030823009 9003772 0.032791368 8230694 0.032639653实施例3稳定表达C0X-2基因和荧光素酶报告基因的重组人肠癌HCT-116ωχ_2细 胞株的建立采用脂质体转染法稳定转染pGL4. 17-C0X-2重组质粒进人肠癌HCT-116细胞，通 过G418药物加压筛选，建立稳定表达C0X-2基因和荧光素酶报告基因的重组人肠癌细胞株 HCT-116g°x_2。具体方法如下细胞转染前先进行G418药物浓度的筛选，将培养于含有10%新生牛血清、100U/ mL青霉素、100 μ g/mL链霉素RPMI-1640完全培养基中人肠癌HCT-116细胞株，按1 X IO4/ 孔的量在M孔板中接种对数生长期的细胞，在37°C 5% CO2培养箱中过夜培养。第二天吸 除培养板中的旧培养液，分别加入500 μ L的0、100、200、300、400、500、600、700 μ g/mL的含 G418的RPMI-1640完全培养基，复3孔，每天观察细胞的生长状态，3-5天换液一次。14天 时，观察细胞全部死亡的最低浓度孔，在300 μ g/mL，做稳定转染时选用的400 μ g/mL。转染前，在60mm的培养皿中接种8 X IO5个细胞，加入5ml完全培养基，37°C，5 % CO2培养，至转染时要求细胞40% -80%汇合。通过分光光度计测定pGL4. 17-C0X-2重组质 粒的浓度，用不含血清、抗生素的培养基稀释5 μ g的pGL4. 17-C0X-2至总体积500 μ L，稀 释后应颠倒几次离心管以混勻混合物，静置5min。另取一新的1. 5mL的离心管，用不含血 清、抗生素的培养基500 μ L稀释10 μ L转染脂质体(Transfectamine Reagent)，稀释后应 颠倒几次离心管以混勻混合物，静置5min将两者混合在一起，在室温下Q0-25°C)孵育混 合物20分钟，使其充分形成质粒DNA/脂质体复合物。在孵育的同时，吸出培养皿中的培养 基，用PBS液洗涤一次，加入3ml的无血无抗生素培养基。孵育完成后吸除培养基，将DNA/ 脂质体复合物全部加入60mm的培养皿中，轻轻摇动培养皿以混勻。37°C、5%C02培养，在细胞汇合度不超过50%时加入400μ g/mL的G418进行筛选。 注意，转染时转染两组细胞，组一在转染后细胞汇合度不超过50%时(一般是Mh)加入 G418进行筛选；组二 在转染后待细胞汇合度达到80%时1/4000、1/1000、1/300分别接种
pGL4.1权利要求
1.一种建立高效表达人环氧合酶2的重组人肠癌细胞株的方法，其特征在于，包括如 下步骤1)构建稳定表达人环氧合酶2基因和荧光素酶报告基因的重组质粒PGL4-C0X-2，通过提取人环氧合酶2基因启动子，以含荧光素酶报告基因的PGL4系列质粒为载体，插入人环氧合酶2基因启动子，构建含人环氧合酶2基因启动子和荧光素酶报告基因的 PGL4-C0X-2重组质粒；2)建立高效表达人环氧合酶2的重组人肠癌细胞株HCT-116ωχ_2稳定转染含人环氧合酶2基因启动子和荧光素酶报告基因的PGL4-C0X-2重组质粒到 人肠癌HCT-116细胞株，通过药物加压筛选、基因扩增后，获得高效表达人环氧合酶2基因 的克隆细胞株HCT-I 16g°x_2 ；所述的细胞株同时高效表达人环氧合酶2和荧光素酶活性。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重组质粒中所含的载体质粒为含稳 定转染抗生素筛选基因的质粒，其包括Hygrc/、Neor和Pure/。
3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重组质粒中包含多酶切位点和内 酰胺酶基因。
4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重组质粒中所包含的载体质粒和人 环氧合酶2基因启动子均含有BglII和Hind III双酶切位点。
5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的荧光素酶报告基因选自萤火虫荧光 素酶或海肾荧光素酶基因。
6.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的人环氧合酶2基因启动子序列，其长 度为 250-700 bp，序列中包含 NF-k B、NF-IL6、SP-l、AP-2、CRE、E-BoX 转录位点和 TATA 框。
7.按权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的人环氧合酶2基因启动子序列，其长 度为56^p。
8.按权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的萤火虫荧光素酶或海肾荧光素酶基 因包括 luc2、luc2P、luc2CP 和 hRluc、hRlucP 和 hRlucC。
9.按权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中构建重组质粒PGL4-C0X-2，通过以 下步骤1)制备含有C0X-2基因启动子目的序列(1)提取含有C0X-2基因启动子人基因组DNA；(2)PCR扩增、纯化C0X-2基因启动子目的序列；2)大量制备pGL4.17载体质粒3)构建稳定表达C0X-2基因启动子的重组质粒(DC0X-2基因启动子目的序列和pGL4. 17载体质粒的双酶切；(2)C0X-2基因启动子目的序列和pGL4. 17载体质粒连接；(3)连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，含Amf的琼脂平板筛选阳性克隆；(4)阳性克隆单菌落的PCR鉴定，剔除假阳性菌落；(5)挑取阳性克隆单菌落摇菌，大量扩增提取制备重组质粒；(6)PCR、双酶切及测序鉴定重组质粒。
10.按权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中建立高效表达人环氧合酶2的重组细胞株HCT-116 X_2通过以下步骤1)确定G418的筛选HCT-116细胞的最低筛选浓度；2)pGL4.17-C0X-2重组质粒稳定转染HCT-116细胞；3)G418筛选稳定转染后的HCT-116细胞；(1)重组质粒转染HCT-116细胞24h后加入G418筛选；(2)阳性单克隆细胞簇接种及传代培养；(3)RT-PCR或Wfestern Blot鉴定单克隆细胞株的真阳性；4)稳定传代培养的细胞进行荧光素酶活性检测。
11.权利要求1制得的人肠癌细胞株HCT-116 X-2在抗肿瘤药物的筛选和评价中的应用。
12.按权利要求11的应用，其特征在于所述的抗肿瘤药物以人环氧合酶2基因为靶点。
13.按权利要求11的应用，其特征在于所述的抗肿瘤药物为抗肿瘤的化学药物、生物 类药物，中药复方、中药单体或单味中药提取物。
全文摘要
本发明属基因工程制药技术及应用领域，涉及一种建立高效表达人环氧合酶2的重组人肠癌细胞株HCT-116COX-2的方法及应用。本发明方法通过建立稳定转染含人环氧合酶2基因启动子编码序列和荧光素酶报告基因序列的永生化哺乳动物细胞系，经压力筛选和基因扩增后，获得稳定、灵敏、高效表达人环氧合酶2的肿瘤克隆细胞株，并将该细胞株应用于以人环氧合酶2基因为靶点的抗肿瘤药物的筛选及评价。本发明建立的重组人肠癌细胞株具有靶向性强、高效快速、反应灵敏等优点，具有可观的应用前景。
文档编号C12N5/10GK102115762SQ20091024752
公开日2011年7月6日 申请日期2009年12月30日 优先权日2009年12月30日
发明者刘宣, 周利红, 李琦, 王炎, 范忠泽 申请人:上海中医药大学附属普陀医院