专利名称：特异性调节pokemon基因表达的反义寡核苷酸及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种特异性调节POKEMON基因表达的反义寡核苷酸及其应用。
背景技术：
POKEMON是一种新发现的致癌基因，它能够导致其它致癌基因发作，最终促使肿瘤 形成。POKEMON可以使癌细胞获得抗老化和死亡的能力，因此被称为癌症的"总开关"。非 常重要的一点是细胞内Pokemon的缺失不会对细胞的正常生长造成影响，这就为设计低副 作用的特异性抗癌药物提供了可能。 Izant和Weintraub于1984年首次提出反义技术，所谓反义技术就是根据核酸间 结合碱基互补原理，用人工合成或生物合成的特定互补的反义核酸或它们的化学修饰物与 细胞内的核酸相互作用以抑制或封闭其表达。恶性肿瘤的发生与细胞内某些癌基因的激活 或某些抑癌基因的失活或缺失有关。反义核酸能特异地阻断癌基因激活后的过度表达而不 影响其他基因的正常功能，目前利用反义技术设计出与有害基因、突变基因、非正常表达基 因及其mRNA互补的反义核酸，以封闭这些基因或抑制其表达。而反义核酸治疗肿瘤的研究 主要在肿瘤细胞株、荷瘤动物和肿瘤患者三个水平上进行应用。目前ISIS3521、ISIS5132、 ISIS2503、G3139、GEM231等已进入临床试验阶段。 天然寡核苷酸在血清中不能稳定存在，在几分钟内就会完全被降解，因此，天然寡 核苷酸不能作为反义治疗的药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性调节POKEMON基因表达的反义寡核苷酸及其应 用。 本发明所提供的反义寡核苷酸是，其分子式为下述式I至式IV中之一
5， CxCxAxCxGyCyCyGyCyCyGyGyCyCyAxTxCxTx 3，(式I);
5， CxGxCxTxGyAyCyGyAyAyGyTyCyGyAxTxCxTx 3，(式II);
5， GxGxCxCxCyGyGyCyCyCyAyTyAyGyAxAxGxTx 3，(式III);
5， TxTxCxAxGyGyTyCyGyTyAyGyTyTyGxTxGxGx 3，(式IV); 其中，式I至式IV中，x均指硫代磷酸酯核苷间键(硫代磷酸酯键)；y均指磷酸 二酯核苷间键(磷酸二酯键)；A均指2'-脱氧腺苷；T均指2'-胸苷；C均指2'-脱氧胞 苷；G均指2'-脱氧鸟苷。 本发明所提供的上述反义寡核苷酸的应用，是其在制备对POKEMON基因表达进行 调节、调整或抑制的药物，特别是治疗POKEMON基因过表达所引起的疾病(如恶性肿瘤)的 药物中的应用。
所述药物以上述反义寡核苷酸为有效成分。
所述药物可通过经脉或皮下给药治疗；所述药物可通过局部给药治疗。
所述给药治疗可与放射疗法结合或与化学疗法结合治疗疾病。
所述给药治疗的用药剂量范围是50nmol/L—-100nmol/L。 本发明的反义寡核苷酸可特异性抑制POKEMON基因的表达；本发明的反义寡核苷 酸进行了硫代磷酸酯键的修饰，其在血清和细胞那的稳定性都大大提高，并且毒副作用很 小。本发明的反义寡核苷酸可作为有效成分用于制备治疗POKEMON高表达引起的疾病的的 基因治疗药物。
具体实施例方式
实施例1、特异性调节P0KEM0N基因表达的反义寡核苷酸的获得
1、 P0KEM0N基因二级结构的预测和反义寡核苷酸的设计利用工作站(www.bioinfo.rpi.edu.cn/applications/mfold)对P0KEM0N基因
(NM_015898)的mRNA的二级结构进行了预测。针对P0KEM0N基因的阅读框架，结合其二级
结构设计了四条含有18-mer的硫代反义寡核苷酸AS1 AS4 (下述式I-式IV)。并以与人
任何基因都不具有同源性的18个核苷酸序列AS5作为对照。 AS1 :5， CxCxAxCxGyCyCyGyCyCyGyGyCyCyAxTxCxTx 3，(式I); AS2 :5， CxGxCxTxGyAyCyGyAyAyGyTyCyGyAxTxCxTx 3，(式II); AS3 :5， GxGxCxCxCyGyGyCyCyCyAyTyAyGyAxAxGxTx 3，(式III); AS4 :5， TxTxCxAxGyGyTyCyGyTyAyGyTyTyGxTxGxGx 3，(式IV); AS5 :5， AxTxGxTxAyGyTyCyGyTyCyTyGyCyCxTxAxGx 3，(式V) 其中，式I至式IV中，x均指硫代磷酸酯键；y均指3， 5磷酸二酯键；A均指2'-脱
氧腺苷；T均指2'-胸苷；C均指2'-脱氧胞苷；G均指2'-脱氧鸟苷。AS1 AS4可以与POKEMON基因的mRNA形成DNA/RNA杂化双链，其可以被RNase
H酶识别、降解，从而抑制POKEMON基因的表达。 2、固相合成POKEMON基因硫代反义寡核苷酸 根据上述反义寡核苷酸AS1、AS2、AS3、AS4、AS5的分子式，用ABI391DNA自动合成 仪，按照通常的硫代寡核苷酸合成方法合成了硫代反义寡核苷酸AS1 AS5，将上述制备得 到的硫代反义寡核苷酸AS1 AS5，经HPLC纯化，经紫外分光光度计定量，具体方法为用贝 克曼库尔特(Beckmancoulter)公司的DU800紫外分光光度计精确测定寡核苷酸的浓度，光 径10mm的比色杯中，单链寡核苷酸在260nm处的消光系数是20iig/ml/10D.在光径10mm 的100 ii 1微量比色杯，加入98 ii 1纯净水，在260nm和280nm两个波长处的定零，然后加 入2 iil寡核苷酸并混匀，在260nm和280nm两个波长处测溶液的光吸收，纯的寡核苷酸的 A260/A280的比值在1. 8至2. 0之间，此时在260nm所测的OD值就是寡核苷酸的浓度(P g/ iU)。上述硫代反义寡核苷酸AS1 AS5可向上海生工生物工程技术服务有限公司订做按 照上述AS1、AS2、AS3、AS4、AS5的分子式，由上海生工生物工程技术服务有限公司以a位 带硫代磷酸酯键的dNTP作为原料，用标准的DNA自动合成仪合成硫代反义寡核苷酸AS1 AS5。 用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测寡核苷酸的纯度，实验采用的条件是缓冲溶液为Tris(三羟甲基氨基甲烷)一硼酸-EDTA，及凝胶浓度30 %的变性聚丙酰胺凝胶，通过分 子筛效应电泳分离合成的寡核苷酸及其合成失败的序列，采用银染色法显色呈现分离的图 谱，该电泳分离方法可以分离仅有一个核苷酸差异的寡核苷酸序列，加上灵敏的银染色法 显色技术，能够有效地检测到合成失败的序列.结果显色图谱上仅有一条显色条带，表明 纯化后的反义寡核苷酸纯度均高于99%。 实施例2、反义寡核苷酸对P0KEM0N-pEGFP融合蛋白的抑制效果实验
1 、 POKEMON与pEGFP的融合质粒的构建 从人宫颈癌HeLa细胞(购自美国典型培养物保藏中心，ATCC)中克隆得到 POKEMON的阅读框架片断，将其亚克隆到pEGFP-N2报告质粒中，使其可以在哺乳动物细胞中 可以表达POKEMON-EGFP融合蛋白。
1)细胞培养 人子宫癌(Hela)细胞(购自美国典型培养物保藏中心，ATCC number :CCL_2)用 含体积分数为10%的胎牛血清，lOOu/ml青霉素和lOOu/ml链霉素及0. 2% NaHC03的DMEM 培养液，在37t:、体积分数为5%的C02条件下常规培养。 DMEM(Dulbecco' s Modified Eagle Medium)培养液非常适合于许多哺乳动物细 胞培养，是由无机盐组分、氨基酸组分、维生素组分等组成，其具体配方为每L培养基中含 有200. OOmg CaCl2，0. 10mg Fe (N03) 3 *9H20， 400. OOmg KCl， 97. 67mgMgS04， 6400. OOmg NaCl， 3700. OOmg NaHC03， 125. OOmg NaH2P04_H20， 4500mg葡萄糖，15. OOmg酚红(Phenol red)， llOmg丙酮酸钠(Sodium Pyruvate) ， 84. OOmgL-精氨酸盐酸盐(L-Arginine-HCl) ， 63. OOmg L-胱氨酸二盐酸盐(L-Cystine 2HC1) ， 584. OOmg L_谷氨酰胺(L-Glutamine) ， 30. OOmg
甘氨酸(Glycine) ，42. OOmg L_半胱氨酸盐酸盐水合物(L-Histidine HC1-H20)， 105.OOL-异亮氨酸(L-Isoleucine)，105. OOmg L_亮氨酸(L-Leucine)，146. OOmg赖 氨酸盐酸盐(L-Lysine-HCl)，30. OOmg L_蛋氨酸(L-Methionine) ，95. OOmg L-苏氨酸 (L-Threonine)，16. OOmg L_色氨酸(L-Tryptophan)，104. OOmg L-Tyrosine2Na 2H20， 94. OOmg L-缬氨酸(L-Valine) ，4. OOmg D-泛酸牵丐(D_Ca pantothenate) ， 4. OOmg氯化胆碱 (Choline Chloride) ， 4. OOmg叶酸(Folic Acid) ， 7. 20mg肌醇(i-Inositol) ， 4. OOmg烟酰 胺(Niacinamide) ， 4. OOmg维生素B6 (盐酸妣多辛，PyridoxineHCl) ， 0. 40mg维生素B2 (核 黄素，O. 40) ，4. OOmg盐酸硫胺(Thiamine HC1) ， pH值7. 2-7. 4。
2)细胞总RNA的提取 取出步骤1)培养得到的人子宫癌(Hela)细胞，吸去培养液(悬浮细胞需要离 心)，用适量PBS洗涤，加入1ml TRizol液，混匀，室温放置5min，吸出培养瓶内的液体转移 到1. 5ml无Rase酶EP管内，每管加入0. 2ml氯仿，剧烈震荡15s，混匀，室温放置2_3min。 在12， 000g(2-8°C )离心15min。吸取水相于另一只1. 5ml的EP管内，加入等体积的异丙 醇，室温放置lmin。在12，000g(2-8°C )离心10min，此时有RNA沉淀产生，弃去上清，加 200-500ul 70X乙醇洗涤后，在7500g(4t:)离心5min.吸掉乙醇，用小Tip吸干液体。沉 淀自然干燥5-10分钟，DEPC处理水20-30ul加入，用枪打匀，55-6(TC水浴10分钟让总RNA 完全溶解，测OD值得到人子宫癌(Hela)细胞总RNA。
3) RT-PCR克隆Pokemon 以步骤2)得到的人子宫癌(Hela)细胞总RNA进行反转录，反应体系20ul，包括
5Oligo(dt)lul，人子宫癌(Hela)细胞总RNA lug， DEPC水，置于7(TC 5min，然后置于冰上 5min，加入DEPC水，5x缓冲液4ul， 25mM MgCL24ul，加入10mMdNTPlul， RNA酶抑制剂20U和 反转录酶lul，25。C 5min，42。C 60min，于70°C 15min终止反应，得到cDNA。结束后以cDNA 作为模版进行PCR。 Pokemon基因上游引物5 ' -CTTAAGCTTGCCACCATGGCCGGCGGCGTGG-3 '，下游引 物5 ' -CATGATATCGGCGAGTCCGGCTGTGAAGTTAC-3 ' 。 PCR反应体系为Pokemon上、下游引 物各10翻1/L， 5X缓冲溶液10ul， 2mM dNTP 5ul，甜菜碱禾口 DMSO各5ul， lul cDNA， 2. 5U/ LPrimer star聚合酶lul，总体系50ul。 PCR循环条件98。C变性10s，70。C复性10s，72。C 延伸lmin，40个循环。 把所得PCR产物在70v，进行琼脂糖电泳，30min后，胶置于紫外灯下照射，小心把 DNA片段切下转入到1.5ml EP管内，称重EP管，近似确定体积。假设胶的密度为lg/ml，于 是凝胶的体积可通过如下方法的得到如凝胶薄片质量为0. 2g，则体积为0. 2ml，然后加入 等体积的NJ缓冲液，把混合物置于55-65t:水浴中lOmin.，至胶完全溶解混合均匀。将胶 溶解后转移到胶回收柱内，8000g离心lmin，用SPW缓冲液重复洗涤2次，最后加入DNA洗 脱液将PCR产物洗下，10， OOOg离心lmin。 DNA产量计算把抽提样品稀释20倍，在260nm 和280nm下测OD值。DNA浓度=A26。X50X稀释倍数。
4) POKEMON与pEGFP的融合质粒的构建 将步骤3)得到的PCR产物用EcoRV和Hindi 11双酶切，克隆进pEGFP_N2质粒的 Hindlll和Sma I酶切位点，得到pEGFP-N2_P0KEM0N融合质粒；具体方法如下所示
①将步骤3)得到的PCR产物的酶切PCR产物的酶切为45ul体系，回收 DNA25ii 1(0. 4iig)，4. 5ul lOXbuffer K，O. 15ul Hindlll (15U/ii 1) ， 0. 15ul EcoRV(15U/ ii 1)，15. 2ulH20，37t:酶切3小时。 ②pEGFP-N2质粒酶切和产物纯化回收取12 pEGFP-N2质粒， 6ii 110XbufferM，6ii 1 Hindlll， 5 yl NaAc (3mM PH5. 2) ， 150ul乙醇于-20 °C 10min， 10，000g离心5min，弃上清，沉淀加入55iU TE溶解。结束后再加入55iU TE溶解液， 8iillOXbuffer T，8iU BSA，6iU Sma I，lyl磷酸酶(CIAP) ， 37。C酶切3小时酶切。酶 切结束后，加入等体积NJ缓冲液，8000g， lmin，再加入SPW液8000g， lmin重复一次，最后加 入DNA洗脱液，10， OOOg， lmin.最后得酶切纯化产物。 ③酶切纯化PCR产物和质粒pEGFP-N2的连接连接体系为40ul， 2 ii 1 pEGFP-N2(Hindl11， Sma I) ，34ii 1PCR纯化产物(HindIII， EcoRV)，置于56。C水浴4min，冰 上5min.再加入2iU T4连接缓冲液，1 yl 50mM ATP，O. 5iU T4连接酶，16。C连结过夜。
④感受态细胞的制备及连接产物的转化取过夜JM109菌液800ul，3000g离心 5min，弃上清，加入50iil新鲜LB培养基，用枪吹打均匀，然后加入2ia质粒液(ly g/yl) 和2iU的CaCl2，冰上放置30min，42。C水浴热休克60-120s，结束后，放置于冰上2-3min， 加入lmlLB液，然后再摇床上摇45min，结束后，在3000g离心5min，除去部分上清液，剩余 大约100 ii 1左右液体，加入12 ii 1 AMP，滴加平板上进行涂布，正向平板放置30min，然后倒 置平板7-8小时。 ⑤挑克隆并小提阳性克隆细胞在20个LB平板底部标上1，2，3，4....20。取20 只中型离心管，每管加入1.5ML含有(60i!g/mL)卡那霉素的LB培养基，用已经灭菌的牙
6签分别挑取上述连接产物转化后长出的不同菌落在标有数字的平板上划线(必须一一对 应)，划线后的牙签放置于中型的离心管内(也必须是管号和平样板上的数字一一对应)， 划线后的培养皿37t:过夜或放置10小时，中型离心管摇床上过夜(37°C )或者把摇床上培 养过夜的液体转移到新的小离心管内，在3000g离心6min，弃上清液体，沉淀提取质粒，用 BamH I酶切鉴定，筛选连接正确的质粒。将BamH I酶切鉴定正确的质粒进行测序结果表 明，我们已经克隆得到P0KEM0N阅读框架序列，并正确地装进pEGFP-N2质粒中，将测序表明 正确的含有P0KEM0N片段的重组质粒命名为pEGFP_N2-P0KEM0N。 pEGFP_N2-P0KEM0N在细胞 中，可表达Pokemon-GFP融合蛋白。 2、反义寡核苷酸AS1、 AS2、 AS3、 AS4对P0KEM0N-GFP融合蛋白的抑制效果 [OO53] 以脂质体Lipofectamine 2000 (Invitrogen)作为转染试齐U，将反义 寡核苷酸ASl(式I)、AS2(式11)、 AS3(式III)、AS4(式IV)和对照寡核苷酸 AS5 (ATGTAGTCGTCTGCCTAG)(浓度均为40nmol/L)与融合质粒pEGFP—N2-P0KEM0N共转染猴 肾成纤维C0S-7细胞(购自美国典型培养物保藏中心，ATCC皿mber :CRL_1651) ， 24h检测荧 光强度。具体方法如下所述 1) pEGFP-N2-P0KEM0N质粒和反义核苷酸共转染 取指数生长期的C0S-7细胞，于37t:，包含有10%胎牛血清，青霉素100mg/ml和 链霉素100mg/ml的DMEM培养基，5X C02的培养箱中培养。细胞转染前一天，细胞用胰酶 消化并用无抗生素的培养基悬浮，以每孔1 X 105个COS-7细胞的密度铺入24孔板内继续 培养24小时。 培养24小时后，将实施例1制备的反义核苷酸AS1、AS2、AS3、AS4和AS5分别以终 浓度均为40nmol/L力B入50 ii 1无双抗的优化培养基(Opti-MEM IReduced-Serum Medium, GIBCO/BRL公司产品)中混匀静止5min得到浓度均为40nmol/L的AS1、 AS2、 AS3、 AS4和 AS5溶液，同时取2. 5 ill脂质体Lipof ectamine-2000加入另外一个含有48. 5 无双抗的 优化培养基(Opti-MEM I Reduced-SerumMedi咖，GIBCO/服L公司产品)中混匀静止5min， 结束后将上述配制的稀释后的脂质体分别与反义苷酸AS1、 AS2、 AS3、 AS4或AS5溶液等体 积混合，分别同时补加0. 4 ii g的pEGFP-N2-P0KEM0N质粒，然后分别将混和液按照100 y 1/ 孔的量加入到上述铺入C0S-7细胞的24孔板内，以AS5与pEGFP-N厂POKEMON质粒共转染 细胞做对照组，检测上述实验组和对照组培养24h后的荧光强度。 上述步骤1)的处理和步骤2)的处理的实验结果如
图1所示，其中，图1中A为对 照(AS5)与pEGFP-N2-P0KEM0N质粒共转染结果，B为AS 1与pEGFP-N2-P0KEM0N质粒共转 染结果，C为AS2与pEGFP-N2-P0KEM0N质粒共转染结果，D为AS3与pEGFP_N2-P0KEM0N质 粒共转染结果，E为AS4与pEGFP-N厂POKEMON质粒共转染结果。结果表明，在C0S-7细胞 内，共转染pEGFP-N厂POKEMON和AS1、 AS2、 AS3或AS4反义核苷酸。通过荧光显微镜观察， 发现四种的反义核苷酸对Pokemon的抑制存在显著差异。从图1中可看到AS2(图1中C) 和AS4 (图1中E)荧光强度弱于AS1 (图1中B)和AS3 (图1中D)的荧光强度，这说明AS2 和AS4抑制效率比AS1和AS3的抑制效率高。使用Image-pro plus v 5. 02对荧光强度进 行分析计算，AS2和AS4对pEGFP-N2-P0KEM0N表达的P0KEM0N-GFP融合蛋白的抑制效率分 别是74%和78% ，同样说明，AS2和AS4对P0KEM0N-GFP融合蛋白的抑制效率比AS1和AS3 的抑制效率高，并且AS4抑制效率最高，结果表明AS4可以作为治疗Pokemon表达引发的疾病的药物，如癌症等。
权利要求
一种特异性调节POKEMON基因表达的反义寡核苷酸，其分子式如式II所示5’CxGxCxTxGyAyCyGyAyAyGyTyCyGyAxTxCxTx 3’(式II)；其中，式II中，x均指硫代磷酸酯核苷间键；y均指磷酸二酯核苷间键；A均指2’-脱氧腺苷；T均指胸苷；C均指2’-脱氧胞苷；G均指2’-脱氧鸟苷。
2. 权利要求1所述的反义寡核苷酸在制备对POKEMON基因表达进行调节、调整或抑制 药物中的应用。
3. 权利要求1所述的反义寡核苷酸在制备治疗P0KEM0N基因过表达所引起的疾病的药 物中的的应用。
4. 根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于所述药物是以权利要求1所述的反 义寡核苷酸为有效成分。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述药物通过经脉或皮下给药治疗。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述药物通过局部给药治疗。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述给药治疗与放射疗法结合。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述给药治疗与化学疗法结合。
全文摘要
本发明公开了一种特异性调节POKEMON基因表达的反义寡核苷酸及其应用。该反义寡核苷酸，为下述化学式所示物质之一CxCxAxCxGyCyCyGyCyCyGyGyCyCyAxTxCxTx；CxGxCxTxGxAyCyGyAyAyGyTyCyGyAxTxCxTx；GxGxCxCxCyGyGyCyCyCyAyTyAyGyAxAxGxTx；TxTxCxAxGxGyTyCyGyTyAyGyTyTyGxTxGxGx；TxTxCxAxGyGyTyCyGyTyAyGyTyTyGxTxGxGx。x指硫代磷酸酯核苷间键。本发明的反义寡核苷酸可作为用于制备治疗POKEMON高表达引起的疾病的的基因治疗药物。
文档编号C12N15/113GK101792763SQ20091024707
公开日2010年8月4日 申请日期2008年4月15日 优先权日2007年4月20日
发明者张楠, 蒋宇扬, 谢振华 申请人:清华大学深圳研究生院