用于检测腹膜透析溶液中的微生物污染物的方法和组合物的制作方法

专利名称：用于检测腹膜透析溶液中的微生物污染物的方法和组合物的制作方法
用于检测腹膜透析溶液中的微生物污染物的方法和组合物本申请是2006年8月16日提交的题目为“用于检测腹膜透析溶液中的微 生物污染物的方法和组合物”的中国专利申请200580005032. X (对应国际申请PCT/ US2005/005187)的分案申请。
背景技术：
本发明通常涉及革兰氏阳性微生物污染物的检测。更具体地说，本发明涉及在腹 膜透析溶液中使用肽聚糖检测的方法和组合物。肽聚糖是革兰氏阳性生物体的主要细胞壁 组分，并因此用作这些微生物的有效标记。由于疾病或损伤或其他的原因，肾系统可能衰竭。在所有起因的肾衰竭中，存在几 种生理学上的紊乱。水，矿物质(例如，Na, K，Cl，Ca, P，Mg，SO4,)，与固定离子每天新陈代 谢负荷量的排泄物的平衡，在肾衰竭中不再可能。在肾衰竭期间，氮代谢的有毒终产物(例 如，尿素，肌酸酐，尿酸，等)可能在血液和组织中积累。透析方法设计用于通过浓度梯度扩散通过半透膜(扩散溶质转运)分离溶液中的 成分。透析方法的例子包括血液透析，腹膜透析和血液过滤。血液透析治疗利用患者的血液从患者除去废物，毒素和过量水分。患者与血液透 析机器连接，患者的血液通过该机器泵出。导管或类似物插入到患者的静脉和动脉中，来使 血液流向或流出该血液透析机器。废物，毒素和过量水分从患者血液除去，血液再输回患 者。血液透析处理能够持续几个小时，而且通常在治疗中心每周进行大约3或4次。为了克服常常与传统血液透析相关的缺点，开发了其他的技术，如腹膜透析。腹膜透析利用患者自己的腹膜作为半透膜。腹膜是体腔的膜衬，由于具有大量的 血管和毛细血管，故能作为天然的半透膜。在腹膜透析中，利用导管或其类似物将无菌的透析溶液导入到腹膜腔中。在经过 一段足够的时间后，达到透析液与血液之间交换溶质的目的。通过提供从血液到透析液的 适合渗透压梯度，使水从血液中流出，从而除去液体。这使得血液回复到适当酸碱度、电解 质和体液平衡。而透析溶液通过导管从体腔中直接排出。不同类型腹膜透析的例子包括连 续的非门诊(ambulatory)腹膜透析，自动化腹膜透析和连续流动腹膜透析。标准的腹膜透析溶液包含右旋糖，以转运水和新陈代谢废物通过腹膜。虽然右旋 糖具有相对安全和便宜的优点，但是它有许多缺点。由于大小较小，右旋糖被迅速地转运通 过腹膜，从而导致在大约灌输2到4小时内，失去渗压梯度和超滤作用。已经建议通过用大 分子量的物质如葡萄糖聚合物代替右旋糖，能改善腹膜透析的超滤特性。新的高分子量试 剂的一个例子是艾考糊精(icodextrin)。含有艾考糊精的透析溶液可商业获得，而且已经 发现可用于治疗患有末期肾病的患者。腹膜炎是腹膜透析的一种主要并发症。腹膜炎的临床怀疑可由产生出现浑浊的 透析液，结合包括腹痛，恶心，呕吐，腹泻和发烧的可变临床表现来提示。参见，例如，Vas SI 腹膜炎(Peritonitis). In =NolphKD, ed.腹膜透析(Peritoneal Dialysis).第 3 版， Dordrecht，荷兰KluwerAcademic Publishers, 1989 :261_84。大多数腹膜炎事件是由腹膜 内细菌感染所引起的，而且通过透析液阳性培养物通常很容易诊断。然而，也详细记录过非
4传染性或无菌腹膜炎的几种起因。无菌性或无菌腹膜炎，其也被称作无菌性，化学的，或培 养物阴性的腹膜炎，一般由化学的或机体外来物刺激剂所引起。在腹膜透析的患者中无菌腹膜炎的一次重要爆发发生于1977年。这归因于透析 溶液的内在和隐藏的内毒素污染。腹膜透析液的怀疑刺激物的内毒素水平为2到2. 5内 毒素单位(EU)/mL。参加，例如，Karanicolas S, Oreopoulos DG, Izatt SH 在慢性腹膜 透析中由内毒素引起的无菌性腹膜炎的流行(Epidemic of aseptic peritonitis caused byendotoxin during chronic peritoneal dialysis), N Engl J Medl977 ;296 :1336_7。 1998年报道了在连续循环腹膜透析患者中由内毒素污染引起的无菌腹膜炎的类似流行病。 参见，例如，Mangram AJ,Archbald LK,Hupert M，连续循环腹膜透析患者中无菌腹膜炎的爆 发(Outbreak of sterile peritonitis among continuous cycling peritonealdialysis patients), Kidney Int 1988;54:1367-71。报道的无菌腹膜炎的其他起因包括腹膜内 给药的万古霉素(参见，例如，Smith Τ, Baile G，Eisele G 与腹膜内万古霉素相关的化 学性腹膜炎(Chemical peritonitisassociated with intraperitoneal vancomycin), Ann Pharm 1991 ;25 :602_3，和Chancy DI，Gouse SF 由腹膜内万古霉素引起的化学性腹 月莫炎(Chemical peritonitis secondary to intraperitoneal vancomycin) ,Am JKidney Dis 1991 ; 17 :76-9)，两性霉素 B(参见，例如，Benevent D, El AkounN, Lagarde C 在连 续非门诊腹膜透析中给药腹膜内两性霉素B的危险(Dangers of administration of intraperitoneal amphotericin B in continuousambulatory peritoneal dialysis)， Press Med 1984 ; 13 :1844)，和乙酸(参见，例如，Tuncer Μ, Sarikaya Μ, Sezer Τ，等 (与腹膜液高乙醛浓度相关的化学性腹膜炎)Chemical peritonitis associated with high dialysateacetaldehyde concentrations, Nephrol Dial Transplant 2000 ； 15 2037-40)。无菌腹膜炎的唯一形式，嗜酸性腹膜炎，是腹膜透析起始之后不久可能存在的一 种更常见的疾病形式。参见，例如，Gokal R，Ramos JM, Ward MK，等嗜曙红细胞的腹膜炎 (Eosinophilic peritonitis) ‘ in CAPD，Clin Niiphrol 1981 ；15 :328_330。如前面所论述的，葡萄糖聚合物，如艾考糊精，可用于在腹膜透析溶液中代替右旋 糖。艾考糊精是来源于玉米淀粉水解的葡萄糖的聚合物。它的分子量为12-20，000道尔顿。 含有艾考糊精作为渗透剂的腹膜透析溶液，通常，用于长时间驻留(>4小时)的交换。艾 考糊精中的大多数葡萄糖分子用α (1-4)糖苷键线性连接(>90%)，而小部分(<10% ) 通过α (1-6)键连接。英国于1994年将艾考糊精引入到临床实践中，在其他的欧洲国家开始于1996 年。艾考糊精的长时间驻留的临床优点，特别是在患有高的平均转运状态与丧失超滤 的患者中，被广泛接受，并促进了它的全球流行。参见，例如，Wilkie ME, Plant MJ, Edwards L，等等超滤失败的患者中7. 5 %艾考糊精透析溶液(葡萄糖聚合物)延伸 技术存活(icodextrin 7.5 % dialysate solution(glucose polymer)in patients withultrafiltration failure -extension of technique survival), Perit Dial Intl997 ;17 :84-7 ；Wolfson 3M，Piraino B, Hamburger RJ，Morton AR，对于艾考糊精研究 组随机控制的试验以评价艾考糊精在腹膜透析中的效力和安全性(for the icodextrin Study Group :A randomized controlledtrial to evaluate the efficacy and safety of icodextrin in peritonealdialysis)，Am J Kidney Dis 2002 ；40 1055-65 ；禾口MujaisS, Nolph K, Gokal R，等腹膜透析中超滤问题的评价和管理(Evaluation andmanagement of ultrafiltration problems in peritoneal dialysis),Pent DialInt 2000 ；20 (Suppl 4) :S5-S21o自从引入艾考糊精用于腹膜透析溶液，已经报道了无菌腹膜炎的零星案例。参见， 例如，Pinerolo MC, Porri MT, D' Amico G 在用艾考糊精处理的开始复发无菌性腹膜炎 (Recurrent sterile peritonitis atonset of treatment with icodextrin),Pent Dial Int 1999 ;19 :491-2 ;WilliamsPF 及时启动透析(Timely initiation of dialysis). Am J Kidney Dis34 :594-595,1999 ；Williams PF, Foggensteiner L :CAPD 患者中与艾考糊 精有关的无菌性 / 过敏性腹膜炎(Sterile/allergic peritonitis withicodextrin in CAPD patients), Perit Dial Int 2002 ；22 89~90 ；FoggensteinerL, Bayliss J, Moss H, 等在39例开始腹膜透析的患者中及时启动透析-单交换的经验(Timely initiation of dialysis-single-exchangeexperiences in 39 patients starting peritoneal dialysis), Perit Dial Int2002 ；22 471-6 ；Heering P, Brause Μ, Plum J,^ =CAPD 性患者中对艾考糊精的腹膜反应(Peritoneal reaction to icodextrin in a female patienton CAPD). Perit Dial Int 2001 ；21 321-2 ；Del Rosso G， Di Liberato L, Pirilli A，等在腹膜透析患者中对艾考糊精的一种新形式的急性负面反应(A new form of acute adverse reaction to icodextrin in peritonealdialysis patient),Nephrol Dial Transplant 2000 ；15 :927_8 ；Goffm Ε, Scheiff JM 在使用艾考糊精的 CAPD 患者 中的暂时无菌性化学性腹膜炎(Transient sterile chemical peritonitis in a CAPD patient usingicodextrin), Perit Dial Int 2002 ；22 :90_1 ；Tintillier Μ, Pochet JM, Christophe几，Scheiff JM，等与艾考糊精有关的暂时无菌性化学性腹膜炎临床 表现，流行禾口文献综述(Transient sterile chemical peritonitiswith icodextrin clinical presentation, prevalence, and literature review), Perit Dial Int 2002 ； 22 :534-7 ；和 Gokal R 艾考糊精相关的无菌性腹膜炎(icodextrin-associated sterile peritonitis), Perit Dial Int 2002;22:445-8。这些患者一般都呈现浑浊的透析液，没 有腹痛，而且透析液细胞计数从300到3500/mm3不等，具有不同百分含量的嗜中性白细胞， 淋巴细胞与巨噬细胞。一般而言，在超滤模式或溶质的腹膜渗透性方面没有变化。培养物 不变地是阴性的，没有腹膜或外周血液嗜曙红细胞的证据。而且，所有的溶液组分与内毒素 水平适合产品规格，基于艾考糊精的腹膜透析溶液符合全部的当前药典标准。在这些报道 的推动下，2001年，含有艾考糊精的溶液的制造商(BAXTER HEALTHCAREC0RP0RATI0N)把产 品特性概述(SPC)修改为包括浑浊的流出物作为艾考糊精的“不希望的副作用”。胃肠外药物产品要求没有污染物质，如可能引起发烧的物质。因为来源于革兰氏 阴性细菌的内毒素是胃肠外产品中最常见的污染物，关注的历史上著名的热原是LPS。当 前的药典标准是的热原性污染物的两种检验之一被用于胃肠外产品。这些检验是兔热原 试验与LAL分析。虽然通常是可靠的，但是两个检验都具有缺点。兔检验依赖发热反应， 而发热反应取决于热原性细胞因子的加工(elaboration)。如果热原的浓度太低不能诱 导全身反应，但是其量足以产生局部炎性反应时，兔热原试验可能是假阴性的。接着，更敏 感的LAL检验不能检测除LPS以外的热原。LAL检验也不能检测下列热原，如病毒，真菌， DNA，格兰氏阳性外毒素，或来自革兰氏阳性细菌的细菌细胞壁组分如肽聚糖等。参见，例
6如，Dinarello CA, O' Conner JV, LoPreste G 在通过重组大肠杆菌生产的生长激素中 检测热原物质的人白细胞热原检测(Human leukocyte pyrogen test for detection of pyrogenic material ingrowth hormone produced by recombinant Escherichia coli),J CHnMicrobiol 1984 ；20 :323_9 ；Poole S, Thorpe R, Meager A，等通过细胞因子释放检测 热原(Detection of pyrogen by cytokine release), Lancetl988 ； 1 (8577) 130 ；Ray A, Redhead K, Selkirk S，等百日咳薄德特氏菌相变体LPS组成，抗原性和反应原性的可变性 Variability in LPScomposition,antigenicity and reactogenicity of phase variants ofBordetella pertussis, FEMS Microbiol Lett 1991 ；63 211-7 ；Taktak YS, Selkirk S，Bristow AF，等通过从单核细胞系释放的白介素_6分析热原(Assay of pyrogens by interleukin-6 release from monocytic cell lines), J Pharm Pharmacol 1991 ；43 578-82 ；和Fennrich S，Fischer M，Hartung T，等使用人全血检测内毒素和其他热原 (Detection of endotoxins andother pyrogens using human whole blood)， Dev Biol Standl999 ；101 :131_9。如上所述对基于艾考糊精的腹膜透析溶液观察到的无菌腹膜炎的全球爆发，为具 有微生物，非内毒素污染物的现代胃肠外产品是如何在药典标准下可能被认为安全的，但 是引起有害的临床作用的标志性例子。因此，需要提供提高的标准用于胃肠外产品，其使用 检测方法以更好的保证胃肠外产品有效地免除污染物质。发明概述本发明通常涉及革兰氏阳性微生物污染物的检测。具体地，本发明涉及在腹膜透 析溶液中使用肽聚糖检测的方法与组合物。发明人意外地发现无菌腹膜炎一与透析溶液 的革兰氏阳性微生物污染相关的无菌腹膜炎的新起因。肽聚糖是革兰氏阳性细菌细胞壁的 主要组分，因此可用作革兰氏阳性细菌的标记。因此，肽聚糖检验可用于在使用腹膜透析溶 液的患者中有效地预防腹膜炎，上述透析溶液如含有包括艾考糊精等的葡萄糖聚合物的腹 膜透析溶液。艾考糊精来源于玉米淀粉，一种天然产物。天然来源的产品熟知被多种微生物 污染。发明人发现一些天然产品，如玉米淀粉，含有嗜酸性嗜热细菌，如热脂环酸杆菌 (Alicyclobacillus acidocaldariuos)。后面的生物体普遍存在于食品工业中，尤其是酸 性饮料中。脂环酸杆菌(Alicyclobacillus)能产生愈创木酚，其是引起“异”味橘子汁的物 质。参见，例如，Matsubara H，Goto K，Matsumara T，等等 Alicyclobacillusacidiphilus sp. Nov.，一种从酸性饮料中分离的新的，嗜热嗜酸的，含ω脂环族脂肪酸的细菌(a novel thermo—acidophilic，omega-alieye1ic fattyacid-containing bacterium isolated from acidic beverages). Int J Syst EvolMicrobiol 2002 ；52 :1681-5。腹膜透析溶液与胃肠外溶液通常不认为已经被这种生物体或它的降解产物污染。 这主要是因为当前用于腹膜透析溶液与胃肠外溶液的微生物污染的检验方法，通常不能检 测这种有机体或它的降解产物。为此，在一个实施方案中，本发明提供了一种制备腹膜透析溶液的方法。该方法包 括提供基于葡萄糖聚合物的溶液；添加一种试剂到该基于葡萄糖聚合物的溶液中，其中该 试剂能与肽聚糖反应；使用该试剂测定肽聚糖的量；如果确定存在足够低水平的肽聚糖， 使用该基于葡萄糖聚合物的溶液提供腹膜透析溶液。
在一个实施方案中，反应引发了丝氨酸蛋白酶级联反应。在一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶级联反应包括前酚氧化酶级联反应。在一个实施方案中，试剂来源于蚕幼虫血浆。在一个实施方案中，根据肽聚糖与试剂之间的反应，肽聚糖的量更进一步地通过 比色测量进行测定。在一个实施方案中，足够低水平的肽聚糖为大约lOng/mL或更少。在一个实施方案中，基于葡萄糖聚合物的溶液包括艾考糊精。在一个实施方案中，试剂添加到原料形式的用于制备基于葡萄糖聚合物的溶液的 艾考糊精中。在另一个实施方案中，本发明提供了给患者提供腹膜透析的方法。该方法包括利 用试剂制备腹膜透析溶液，以确保该腹膜透析溶液具有足够低水平的肽聚糖，以便在患者 中预防腹膜炎；并提供该腹膜透析溶液给患者。在一个实施方案中，该腹膜透析溶液包括基于艾考糊精的溶液。在一个实施方案中，腹膜透析包括自动化腹膜透析，连续非门诊腹膜透析等。在一个实施方案中，在腹膜透析期间对患者进行腹膜炎监控。例如，从患者收集透 析流出物，来测定与腹膜炎发病相关的IL-6应答。在一个实施方案中，试剂用于在腹膜透析期间，测定腹膜透析溶液使用之前肽聚 糖的量是否超过大约lOng/mL。在另一个实施方案中，本发明提供了 一种测试腹膜透析溶液的肽聚糖的量超过足 以引起腹膜炎的水平的方法。该方法包括添加一种试剂到腹膜透析溶液中，其中该试剂能 与肽聚糖反应，以引发丝氨酸蛋白酶级联反应；并测定肽聚糖的量。例如，可检测基于艾考 糊精的溶液以确定肽聚糖的量是否超过大约lOng/mL。在另一个实施方案中，本发明提供了一种艾考糊精组合物，其包括能与肽聚糖反 应的试剂。在一个实施方案中，可以确定肽聚糖的水平，高于该水平产品将产生无菌腹膜炎。在一个实施方案中，使用具有能结合肽聚糖的树脂的亲和层析柱，可用于使葡萄 糖聚合物中肽聚糖的污染最小化。本发明的一个优点是提供了改良的腹膜透析溶液。本发明的另一个优点是提供了制备和使用腹膜透析溶液的改良方法，其应用检测 规程来确定腹膜透析溶液中肽聚糖的存在。本发明的另一个优点是提供了改良的检测方法，其可用于在接受腹膜透析治疗的 患者中预防腹膜炎。本发明的另一个优点是提供了一种改良的艾考糊精组合物，其在制备该组合物过 程中利用检测过程来确定肽聚糖的存在。本发明的其它的特征和优点描述于，并显而易见于，以下的发明详细描述和附图。附图简述

图1举例说明了 PBMC分析中IL-6反应与艾考糊精中肽聚糖浓度之间的相关性。 在从健康志愿者新鲜分离的单核细胞中测定IL-6反应。每个符号与线条表示来自单个供 体的数据。
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图2举例说明了肽聚糖对大鼠腹膜液中嗜中性白细胞浸润的影响。在单次注射包 含肽聚糖的艾考糊精(35mL/kg)以后6小时收集腹膜液。图3举例说明了肽聚糖对大鼠腹膜液中TNF-α的影响。图4举例说明了肽聚糖对大鼠腹膜液中IL-6的影响。图5举例说明了报道的使用艾考糊精的无菌腹膜炎的频率(％ )。发明详述本发明通常涉及革兰氏阳性生物体及其片段的检测。特别地，本发明涉及在腹膜 透析溶液中使用肽聚糖检测的方法与组合物。发明人意外地发现无菌腹膜炎一与透析溶 液的革兰氏阳性微生物污染相关的无菌腹膜炎的新起因。肽聚糖是革兰氏阳性细菌细胞壁 的主要组分，因此可用作革兰氏阳性细菌的标记。在这点上，肽聚糖检验可用于在使用腹膜 透析溶液的患者中有效地预防腹膜炎，如含有包括艾考糊精等的葡萄糖聚合物的腹膜透析 溶液。与基于艾考糊精的腹膜透析溶液相关的无菌腹膜炎，被认为是报道的由于微生物 来源的污染物导致的腹膜透析溶液最大的负面事件。根据如下所详细描述的实验研究，表 明基于艾考糊精的腹膜透析溶液中的肽聚糖是无菌腹膜炎的致病因素。更进一步地，如下 详述的药物警戒(pharmacovigilence)数据支持了纠正措施与生产筛选程序以预防腹膜 炎出现的有效性。这些发现说明了，虽然内毒素当然地是一种可能给患者导致副作用的更 令人烦恼的细菌产物，但是它不是唯一的一种。在这点上，非内毒素热原，如肽聚糖，其以前 没有被鉴定，能产生临床上显著的炎症。因此，这证明通过法定检验(compendial test)并 因此符合药典标准的胃肠外药剂，可能仍然需要更进一步水平的检验，以有效地确定有效 并安全使用这种产品，来更好的确保与使用其相关的生活问题的质量。本发明中，非LPS热原污染物被认为是一个问题，因为腹膜透析交换容许直接 观测肽聚糖诱导的原位炎症。肽聚糖是由β (1-4)连接的N-乙酰胞壁酸与通过肽桥交 联的N-乙酰-D-葡糖胺残基形成的杂聚物。参见，例如，Royce CL, Pardy RL 共生的真 —β舌參录■白勺个生M (Endotoxin-like properties of an extract from a symbiotic, eukaryotic cholerella-like green algae), J Endotoxin Res 1996 ；3 437-44。聚糖主链是化学上同质的，而交联糖的肽是不同的。肽聚糖占据革兰氏阳性细胞 壁重量的大约40%，但是占革兰氏阴性细胞壁总重量的大约1-10%。Royce CL,Pardy RL: 共生的真核霍乱病毒样绿藻的内毒素样性质Endotoxin-like properties of an extract from a symbiotic, eukaryotic cholerella-like green algae, J Endotoxin Res 1996 ； 3 :437-44。肽聚糖与另一种细胞壁成分脂胞壁酸(lipoteichoic acid)，实际上包括革兰氏 阳性细胞壁的所有主要发炎诱导组分。参见，例如，Sriskandan S,Cohen J :Gram-positive sepsis, In :0pal SM, Cross AS，编辑，细菌脓血症和脓血症休克(Bacterial Sepsis and Septic Shock), Philadelphia :ff.B.Saunders Company，1999 :397_412。如同内毒素一样，肽聚糖可能在多种细胞中诱导细胞因子产生，并已经长时 间被认为具有免疫调节作用。参见，例如，Garner RE，HudsonJA 静脉内注射假丝酵 母衍生的甘露聚糖导致血清中肿瘤坏死因子α水平升高(Intravenous injection of candida-derived mannan results inelevated tumor necrosis factor alpha levels in serum), Infect Immunl996 ;64 :4561_6 ；和 Schwab J:来自致病性细菌和定殖于人体的正常菌群细菌的肽聚糖-多糖聚合物的热素性质(Phlogistic properties ofpeptidoglycan-polysaccharide polymers from cell walls of pathogenic andnormal flora bacteria which colonize humans)，Intect Immunl993 ；61 :4535_9。然而，作为这 些生物学作用的剌激物，肽聚糖比内毒素的效力低几个数量级。参见，例如，Henderson B， Poole S, Wilson M 细菌调节素一类通过诱导合成细胞因子而导致宿主组织病理新的毒 力因子(Bacterial modulins :a novel class of virulence factors which causehost tissue pathology by inducing cytokine synthesis),Microbiol Revl996 ；60 316-41 ； 和Nakagawa Y,Maeda H,Murai T 基于从人单核细胞释放的致炎细胞因评价体外热原检验 系统与人全血培养检验系统和兔热原检验比较(Evaluation of the in vitro pyrogen test system basedon proinflammatory cytokine release from human monocytes Comparisonwith a human whole blood culture test system and with the rabbit pyrogentest),Clin Diag Lab Immunol 2002;9:588-97。例如，兔中肽聚糖的最低热原性 剂量为7. Syg/kg，而内毒素的最低热原性剂量为0.00271^/1^。参见，例如，Henderson B, Poole S, Wilson M 细菌调节素一类通过诱导合成细胞因子而导致宿主组织病理新 的毒力因子(Bacterial modulins :a novel class of virulence factors which cause hosttissue pathology by inducing cytokine synthesis), Microbiol Revl996 ；60 316-41。除了缺乏含有热原的物质外，胃肠外产品的安全性通常通过药典检验确定，以确 定它们的无菌程度。细菌培养通常在中性PH进行培养，使用20-35°C的培养温度。这低于 嗜热，嗜酸微生物如酸热脂环酸杆菌(alicyclobacillus acidocaldarius)生长最佳条件， 这些微生物的生长需要酸性培养基与高温。因此 ，通常使用的“无菌定义”与支持分析，可 能不能检测在常规条件下不能生长的微生物。本申请的一个实施方案中，高温进行酸水解 用于淀粉水解以产生艾考糊精。这些制备条件适于酸热脂环酸杆菌的生长，但是与那些用 于根据生物负载确定无菌的条件不一致。如上述引证的，根据本发明的实施方案通过举例而非限制性实施方案的方式，下 面提供了研究发现的详细说明化学与物理研究艾考糊精中的大多数葡萄糖分子是用α (1-4)糖苷键线性连接的(> 90% )，而 一小部分是通过α (1-6)键连接的(< 10% )。艾考糊精的分子量分布可通过凝胶渗透层 析进行确定。艾考糊精中α (1 — 6)与α (1 — 4)糖苷连接的分布可通过核磁共振谱法进 行评估。挥发性与半挥发性有机杂质可通过高效液相色谱法与质谱法进行检测。透析液流出物分析分析来自患者的透析液流出物样品的艾考糊精代谢产物，甘油三酸酯，总 蛋白与选择性热原性细胞因子(IL-6，IL-I β与TNF-α)。使用高效阴离子交换色 谱与脉冲电流计检测，分析艾考糊精代谢产物。参见，例如，Burke RA, Hvizd MG, Shockley TR 使用高效阴离子交换色谱与脉冲电流计检测直接测定血浆中多聚葡萄 糖代谢物(Directdetermination of polyglucose metabolites in plasma using anion-exchangechromatography with pulsed amperometric detection)， J Chromatogr B1997 ；693 :353_7。甘油三酸酯与蛋白质分析使用BoehringerMmmheim/Hitachi 911化学分析仪进行。细胞因子测定使用ELISA试剂盒(R&D Systems, Minneapolis, MN)进行。热原测定艾考糊精溶液中的内毒素浓度通过定点生色LAL测试进行测定。参见，例如， Weary M, Dubczak J, Wiggins J，等确认LAL生色底物热原检测用于大体积肠胃外 药物(Validating an LAL chromogenicsubstrate pyrogen test for large volume parenterals), In =Watson Sff, LevinJ，Novitsky TJ，编辑，用鲎内毒素试验检测细菌内毒 素Detection ofbacterial endotoxin with limulus amebocyte lysate test. New York Alan R.Liss，1987:307-22。兔热原试验法根据欧洲药典提供的指南进行。欧洲药典，热 原，第 4 版，Strasbourg，France :Council of Europe，2002 131-2。暴露于测试物质之后， 在新鲜分离的外周血单核细胞(PBMC)中测定IL-6应答的离体热原试验法，被用于定量非 内毒素热原。参见，例如，Dinarello CA, 0' Conner JV, LoPreste G 在通过重组大肠杆 菌产生的生长激素中检测热原材料的人白细胞热原试验(Human leukocytepyrogen test for detection of pyrogenic material in growth hormoneproduced by recombinant Escherichia coli), J CHn Microbioll984 ;20 :323_9 ；禾口 Poole S, Thorpe R, Meager A，等通过细胞因子释放检测热原(Detection of pyrogen by cytokine release), Lancetl988 ； 1 (8577) :130。肽聚糖测定使用蚕幼虫血浆(SLP)测试进行肽聚糖(PG)定量(Wako PureChemical Industries, Ltd. , Osaka, Japan)。参见，例如，Tsuchiya Μ, Asahi N, Suzouki F 用香 幼虫血菜测试检测肽聚糖和B聚糖(Detectionof peptidoglycan and B-glucan with silkworm larvae plasma test), FEMSImmunol Medical Micrbiol 1996 ;15 :129_34 ；禾口 U.S.专利No. 4，970，152。SLP包含前酚氧化酶(PPO)级联反应的所有因子，上述反应是昆 虫的自卫机制。PPO级联反应由肽聚糖起始，其中PPO最终被激活成酚氧化酶。酚氧化酶活 性用3，4_ 二羟苯丙氨酸作为底物进行比色检测。发现艾考糊精溶液中肽聚糖的检测极限 是7.4ng/mL。SLP测试不能检测内毒素。如美国专利4，970，152中完全公开的，例如，肽聚糖(或β _G)的检测可以如下进 行。含有肽聚糖的样品与包括能与肽聚糖(“PG”)特异性反应的级分的试剂充分混合，来 制备反应溶液。一段时间以后，反应溶液中的酶活性，例如，BAEE酶，PPAE, PO等的活性，可 以通过常规方法进行测定，并与以前使用已知浓度的PG标准溶液获得的标准曲线进行比 较，来确定PG的量。可选择地，应用激活PO所需的时间取决于样品中PG的浓度的现象是可能的。也 就是说，在存在PO的底物时，混合PG试剂与样品以后，测定达到一定量的由PO产生的反应 产物所需的时间。通过举例而非限制的方式，利用SLP测试的试验方法可以根据本发明如下的实施 方案进行。肽聚糖(PG)与(1，3)-D_葡聚糖(BG)分别是革兰氏阳性细菌与真菌细胞壁的组 分。PG与BG用蚕幼虫血浆(SLP)测试进行测定。SLP测试包含前酚氧化酶(PPO)级联反 应的全部因子，所述级联反应是昆虫的重要自卫机制。PPO级联由肽聚糖起始，其中PPO把 3，4_ 二羟苯丙氨酸(DOPA)转换成黑色素。得到的黑色素的形成使用标准读板器于650nm进行比色检测。原料艾考糊精未稀释进行测定，而且检测极限(LOD)为0. 74ng/ml(最低的 可检测标准点)。成品，如EXTRANEAL，在稀释十倍以后进行测定，以减少由于电解质存在所 引起的基质抑制。样品稀释步骤导致1 10稀释的修正以后，得到了 7.4ng/ml的L0D。动物研究在大鼠模型中测定艾考糊精中肽聚糖的无可见作用剂量水平(NOEL)。总共45只 体重为 255-280g 的雄性 Sprague-Dawley 鼠(HarlanInc ；Indianapolis，IN，USA)，被分成 9 个相等的组。每个组以35mL/kg的剂量，接受具有0，1，5，10，50，100，500，1000或5000ng/mL 肽聚糖的艾考糊精的单次腹膜内注射。来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 的肽聚糖(Toxin Technology Inc.，Sarasota，FL，USA)用于这些实验。注射6小时以后， 处死大鼠，通过测定重量与体积来定量收集腹膜腔中的液体。分析腹膜液的有核细胞计数 与差示计数，总蛋白，以及IL-6与TNF-α浓度。统计分析对2000年7月与2002年9月之间制备的几百批艾考糊精的售后监测数据进行分 析，以测定肽聚糖水平与无菌腹膜炎发病率之间的相关性。为了积累足够的投诉频率，以 有效地显示每百万的投诉比例(CPM)，把数据分为对数级别的肽聚糖水平，也即彡7. 4，> 7. 4-15，> 15-30，> 30-60，与彡60ng/mL。对于每个肽聚糖浓度范围，计算总的投诉与总的 销售单位。按总的投诉除以总的销售单位，再乘以一百万，来计算CPM单位。负二项回归用 于评估CPM与肽聚糖水平之间的相关性。使用SAS方法GENM0D(SAS Institute,Cary,NC, USA)进行统计分析。临床案例根据2000年BAXTER HEALTHCARE CORPORATION全球药物警戒体系收到的报道，无 菌腹膜炎的频率[(投诉数量+治疗的患者数)xl00]为0.095%。2001年报道的案例稳 定增加，在2002年3月达到1. 04%的峰值频率。患者看上去很少发热或中毒；腹痛为适度 的到缺乏；透析液浑浊，用透析液细胞计数细胞为300到3500/mm3 (百分比可变的嗜中性白 细胞，淋巴细胞，和巨噬细胞，没有嗜酸性粒细胞)。不同于细菌性腹膜炎，小的溶质的超滤 或腹膜渗透性方面没有变化。血液和透析液培养物总是阴性的。抗生素可由当地医生可变 地确定。所有的临床征象由于停止艾考糊精而解决。在一些病例中，艾考糊精被重新启动， 无菌腹膜炎复发。BAXTER HEALTHCARE CORPORATION在2002年5月开始在世界范围内主动 召回几百批艾考糊精。艾考糊精的化学与物理研究对召回的艾考糊精批量进行了广泛的化学和物理研究。这些分析显示，与无菌腹 膜炎相关的批次和不与负面的临床事件相关的批次之间，艾考糊精的分子量分布，糖苷键 的分支百分数，或微量挥发性和半挥发性有机杂质没有任何差异。包含艾考糊精的透析液 的投诉批次的全部溶液组分都在产品规格范围内，并符合当前药典标准。透析液流出物分析相较于对照流出物，患有无菌腹膜炎的患者的透析液流出物中观察到IL-6浓度 显著上升(分别为> 5000对59pg/mL)。相对于对照，用投诉样品观察到蛋白质浓度的增 加(分别为236mg/dL对125mg/dL)。投诉样品与对照样品之间，艾考糊精与它的代谢产物 (聚合度为2到7的葡萄糖聚合物)没有差异。这些结果表明，艾考糊精或它的代谢产物都
12不可能是无菌腹膜炎的起因。艾考糊精的热原分析发现与无菌腹膜炎相关的所有艾考糊精样品中内毒素水平，处于如通过LAL测试 测定的产品限制范围内(< 0. 25EU/mL)。在兔热原测试中，使用投诉或者非投诉艾考糊精 批次的温度没有增加。不过，如下表1所举例的，用投诉的含有艾考糊精的透析液批次与用 于制备投诉批次的腹膜透析液的艾考糊精原料，在体外PBMC分析中都观察到IL-6应答的 增加表1 :PBMC分析中投诉与非投诉批次艾考糊精的IL-6应答。在该分析中，大于 500pg/mL的IL-6应答认为是阳性的热原性原性反应。 a是具有补充组分的Eagle最低限度必需培养基，b是Baxter实验产品，c是含有 葡萄糖的标准腹膜透析溶液在存在多粘菌素B时，投诉样品中激发IL-6的物质未受影响，这表明它不是LPS。 参见，例如，Pool EJ, Johaar G，James S，等在人白蛋白溶液中使用离体全血培养分析 区分内毒素禾口毒素热原(Differentiation between endotoxin and non-endotoxin pyrogens in humanalbumin solutions using an ex vivo whole blood culture assay)， JImmunoassay 1999 ；20 :79_89。在一个使用30kD截留分子量滤器的过滤实验中，在存留物 中发现PBMC分析中产生炎性反应的污染物，这表示该物质的分子量为>30kD，也即大于艾 考糊精。LPS分析阴性，但是PBMC IL-6反应阳性表明，无菌腹膜炎可能的起因是用于制备 最终的腹膜透析溶液的艾考糊精原料中的一种非内毒素，热原污染物。肽聚糖与微生物分析对几百批召回的艾考糊精进行分析表明，批次中41%的艾考糊精被肽聚糖污染， 肽聚糖通过SLP分析检测到。肽聚糖浓度范围为从7.4ng/mL的检测极限到303ng/mL。由于从麦芽糖糊精制备艾考糊精需要加热与酸化，进行了存在需要特殊营养的微生物的微生 物学研究。艾考糊精的早期阶段发现被嗜热，嗜酸性，革兰氏阳性生物，酸热脂环酸杆菌污 染。脂环酸杆菌是肽聚糖污染的来源。应用于接近最终产品的加热与无菌过滤方法消除了 细菌，而不是肽聚糖污染物。发现艾考糊精中的肽聚糖水平与PBMC分析中观察到的IL-6 应答之间存在正相关(参见，图1)。在不同供体之间观察到的IL-6应答相当的变异性，表 明了对肽聚糖的灵敏度的范围。动物研究研究了大鼠中肽聚糖的腹膜内给药的作用，以确定NOEL。这可用于确定艾考糊 精制备的调节规格标准。相较于接受艾考糊精而没有肽聚糖的对照大鼠，艾考糊精+肽聚 糖-处理的大鼠的腹膜液中总蛋白，白细胞与嗜中性白细胞增加。显示了 NOEL在IOOng/ mL处时，腹膜液中嗜中性白细胞浸润的剂量依赖性增加(参见，图2)。两种炎性细胞因子 都显示对TNF- α而言当NOEL值为lOng/mL时的剂量依赖性增加，(参见，图3)，和对IL-6 而言NOEL值为lOOng/mL时的剂量依赖性增加(参见，图4)。对于TNF- α反应，肽聚糖的 NOEL 最低，其为 10ng/mL。肽聚糖与无菌腹膜炎之间的相关性如下表2所示，发现艾考糊精中的肽聚糖浓度与CPM之间存在正相关表2 每百万销售单位投诉(CPM)与艾考糊精溶液中肽聚糖浓度之间的相关性 a按总投诉除以总的销售单位，再乘以一百万，来计算每百万销售单位的投诉 (CPM)。当肽聚糖水平低于检测极限7. 4ng/mL时，基线CPM是18. 2。相反，当肽聚糖水 平等于或大于60ng/mL时，CPM是252. 9。CPM与肽聚糖之间的相关性是高度显著的(ρ < 0. 0001)。纠正措施以后无菌腹膜炎的发病率2002年5月，BAXTER HEALTHCARE CORPORATION召回了所有被的肽聚糖污染浓度 > 10ng/mL的艾考糊精批次(batch)，以及在召回时没有分析肽聚糖的所有批次(lot)。此 外，执行低于分析的检测极限(<7.4ng/mL)的肽聚糖的内部调节规格，用于产品发行。对 肽聚糖与嗜热细菌进行常规的，连续监控。所有最新制备的批次中肽聚糖的浓度低于SLP测试的检测极限，而且通过PBMC分析没有引发IL-6的因子。图5显示了从2001年9月开始到2003年1月逐月的无菌腹膜炎发病率。执行纠 正措施后，投诉的频率从2002年3月的峰值1. 04%降低到2003年1月的0. 013%。在这 期间使用来自BAXTERHEALTHCARE CORPORATION的称为EXTRANEAL的商业可获得的腹膜透 析溶液的患者的数目保持在大约7，000。这些结果表明，纠正措施已经有效的预防了由于含 有艾考糊精的透析溶液中肽聚糖污染而致的过多的无菌腹膜炎的投诉。如前面所述，本发明涉及在腹膜透析溶液中使用肽聚糖检测的方法和组合物。这 允许测试细菌片段，因为肽聚糖是革兰氏阳性有机体的主要细胞壁组分。在这方面，肽聚糖 检测可有效地用于在使用腹膜透析溶液的患者中预防腹膜炎，如包含含艾考糊精等的葡萄 糖聚合物等的腹膜透析溶液。应该理解，根据本发明的实施方案，组合物，腹膜透析溶液及其制备和使用方法可 以任何适合的方式提供。在一个实施方案中，本发明提供了生物负载(bioburden)测试，如 根据各种药典所述的标准方法用于检测嗜酸嗜热生物体的生物负载测试。除了通过前面所 述的肽聚糖检测来检测细菌片段以外，这类检测可用作增加水平的检测。在一个实施方案中，本发明提供了制备腹膜透析溶液的方法。该方法包括任何适 合数量和种类的处理阶段。例如，该方法包括提供葡萄糖聚合物；添加试剂到该葡萄糖聚合 物中，其中该试剂能与肽聚糖反应；测定肽聚糖的量；如果确定葡萄糖聚合物中存在足够 低水平的肽聚糖，就使用葡萄糖聚合物来制备腹膜透析溶液。如果肽聚糖或其类似物的量 超过该例如大约lOng/mL或更低水平，，可以对葡萄糖聚合物进行更进一步处理，以除去肽 聚糖或其类似物，以使其水平足够低。葡萄糖聚合物可以任何适合的方式进行更进一步地 处理。在一个实施方案中，葡萄糖聚合物可以用任何适合数量和种类的分离装置，如亲合力 装置和/或类似装置进行处理。在一个实施方案中，本发明提供了可用于制备腹膜透析溶液的组合物，如葡萄糖 聚合物组合物。各种不同的和种类的组合物以及含有该组合物的溶液都可以使用。例 如，组合物以及含有组合物的溶液的种类可见于美国专利4，761，237，名称为“含有糖聚 合物的腹膜透析溶液”；美国专利4，886，789，名称为“腹膜透析和其中使用的组合物”；美 国专禾Ij 6，077，836，名称为“腹膜透析和其中使用的组合物”；和美国专利6，248，726 Bi， 名称为“使用葡萄糖聚合物溶液进行腹膜透析的方法”，以其公开的全部内容引入这里作 为参考。组合物以及含有组合物的溶液的其它例子可见于美国专利申请10/327,264，名 称为含有艾考糊精的生物相容的透析液，申请日为2002年12月20日；和美国专利申请 09/206，063，名称为“含有修饰的艾考糊精的腹膜透析溶液”，申请日为1998年12月4日， 以其公开的全部内容引入这里作为参考。在一个实施方案中，腹膜透析溶液可包括BAXTER HEALTHCAREC0RP0RATION 的 EXTRANEAL，或其合适的修饰物。在一个实施方案中，本发明包括提供腹膜透析的方法，如连续的非门诊腹膜透析 和自动化腹膜透析。在连续的非门诊腹膜透析中，患者白天进行几个排出，填充和驻留循 环，例如每天大约4次。每个处理循环，包括排出，填充和驻留，花费大约4小时。自动化腹膜透析类似于连续的非门诊腹膜透析，因为该透析处理包括排出，填充 和驻留循环。不过，透析机器自动执行3个或多个腹膜透析处理循环，一般是患者睡眠的同 时整夜进行。
对于自动化腹膜透析，自动化透析机器与植入的导管或其类似物流体连接。自动 化透析机器也与新鲜的透析溶液来源或袋进行流体连接，并与液体引流管连接。透析机器 从腹膜腔抽出使用过的透析溶液，通过导管，到达引流管。透析机器然后从来源抽出新鲜的 透析溶液，穿过导管，并进入患者的腹膜腔。自动化机器允许透析溶液驻留在腔内，以便从 患者的血液传递废物，毒素和过量水分到透析溶液中。用电脑控制自动化透析机器，以便当 患者与透析机器连接时，例如，当患者睡眠时，透析处理自动发生。在这方面，透析系统自动 地并连续地泵入液体到腹膜腔中，允许驻留，从腹膜腔泵出液体，并重复该过程。处理期间将发生几个排出，填充和驻留循环。并且，一般在自动化透析处理的结尾 使用终体积“最后的填充”，其当患者脱离透析机器当天，保留在患者的腹膜腔中。自动化腹 膜透析使患者免于当天必须人工地进行排出，驻留和填充步骤。在一个实施方案中，自动化 腹膜透析可以使用混合装置进行，如BAXTER HEALTHCARECORPORATION的ADMIX H0MECH0ICE 或其合适的改进装置。在一个实施方案中，本发明提供了一种测试，来测定腹膜透析溶液，如基于艾考糊 精的溶液，是否包括超过足以在使用该溶液的患者中引起腹膜炎的水平的肽聚糖。本发明 提供了一种检测规程，其使用试剂，这种试剂来源于蚕幼虫血浆，用于上述目的。应该理解， 该检测过程可以在使用腹膜透析溶液之前的任何合适阶段进行。例如，可以添加原料形式的该试剂到葡萄糖聚合物组合物中，如艾考糊精组合物， 以测定肽聚糖的存在。如果肽聚糖的水平处于足够低的水平，那么该组合物可用于制备腹 膜透析溶液。在另一个实施方案中，该试剂可以在如灭菌处理以后以成品形式添加到腹膜 透析溶液中。例如，试剂可以添加到包含于任何合适的溶液袋如单腔溶液袋或多腔溶液袋 中的腹膜透析溶液中。美国专利5，431，496中提供了多腔溶液袋或容器的例子，以其公开 的全部内容引入这里作为参考。如这里所述的，所有的专利申请和出版物包括专利出版物，都以其全部内容引入 这里作为参考。应当理解，对这里所述的目前优选的实施方案进行的各种改变和修饰，对于本领 域技术人员来说都是显而易见的。进行的这种改变和修饰不背离本发明的精神和范围，而 且不削弱本发明预期的优点。因此附加的权利要求覆盖了这种改变和修饰。
权利要求
一种制备透析溶液的方法，该方法包括以下步骤提供葡萄糖聚合物；在葡萄糖聚合物上进行改良的生物负载检验来检测酸热脂环酸杆菌(Alicyclobacillus acidocaldariuos)的污染；用来源于蚕幼虫血浆的试剂检验葡萄糖聚合物，其中所述试剂与葡萄糖聚合物中的任一肽聚糖反应来确定肽聚糖的浓度；和如果确定的肽聚糖浓度为大约10ng/mL或者更少，使用葡萄糖聚合物制备透析溶液。
2.权利要求1的方法，包括用来源于蚕幼虫血浆的试剂检验透析溶液，其中所述试剂 与透析溶液中的任一肽聚糖反应，来确定透析溶液中的肽聚糖浓度是否小于大约lOng/mL 或者更少。
3.权利要求1的方法，其中与试剂的反应启动丝氨酸蛋白酶级联反应。
4.权利要求1的方法，其中经比色计测量确定肽聚糖浓度。
5.权利要求1的方法，其中改良的生物负载检验包括在小于大约5.O的pH检验酸热脂 环酸杆菌。
6.权利要求1的方法，其中改良的生物负载检验包括在小于50至60°C的温度检验酸 热脂环酸杆菌。
7.权利要求1的方法，其中葡萄糖聚合物包括艾考糊精。
8.检验葡萄糖聚合物被肽聚糖污染的方法，该方法包括 提供葡萄糖聚合物；在葡萄糖聚合物上进行改良的生物负载检验来检测热脂环酸杆菌，所述热脂环酸杆菌 是肽聚糖的来源；以及用来源于蚕幼虫血浆的试剂检验葡萄糖聚合物，其中所述试剂与葡萄糖聚合物中的任 一肽聚糖反应来确定葡萄糖聚合物中肽聚糖的浓度。
9.权利要求8的方法，包括制备含有葡萄糖聚合物的透析溶液以及用来源于蚕幼虫血 浆的试剂检验透析溶液，其中所述试剂与透析溶液中的任一肽聚糖反应，来确定透析溶液 中的肽聚糖浓度是否小于大约lOng/mL或者更少。
10.权利要求8的方法，其中与试剂反应启动丝氨酸蛋白酶级联反应。
11.权利要求8的方法，其中丝氨酸蛋白酶级联反应包括前酚氧化酶级联反应。
12.权利要求8的方法，其中改良的生物负载检验包括在小于大约5.O的pH检验热脂 环酸杆菌。
13.权利要求8的方法，其中改良的生物负载检验包括在小于50至60°C的温度检验酸 热脂环酸杆菌。
14.权利要求8的方法，其中的葡萄糖聚合物包括艾考糊精。
15.给患者提供透析的方法，该方法包括 制备透析溶液，包括提供葡萄糖聚合物；在葡萄糖聚合物上进行改良的生物负载检验来检测酸热脂环酸杆菌的污染； 用来源于蚕幼虫血浆的试剂检验葡萄糖聚合物，其中所述试剂与肽聚糖反应来确定肽 聚糖的浓度；以及如果确定的肽聚糖浓度为大约lOng/mL或者更少，使用葡萄糖聚合物来制备透析溶 液；以及给患者施用透析溶液。
16.权利要求15的方法，包括在给患者施用透析溶液之前用来源于蚕幼虫血浆的试剂 检验透析溶液，其中所述试剂与透析溶液中的任一肽聚糖反应来确定透析溶液中的肽聚糖 浓度是否小于大约lOng/mL或者更少。
17.权利要求15的方法，其中透析溶液是腹膜透析溶液。
18.权利要求15的方法，其中在从选自自动化腹膜透析和连续的腹膜透析的腹膜透析 期间提供腹膜透析溶液。
19.权利要求15的方法，其中改良的生物负载检验包括在小于大约5.O的pH检验热脂 环酸杆菌。
20.权利要求15的方法，其中改良的生物负载检验包括在小于50至60°C的温度检验 热脂环酸杆菌。
全文摘要
提供了用于检测腹膜透析溶液中微生物污染物的方法和组合物。提供了一种无菌腹膜炎的新起因-与透析溶液的革兰氏阳性微生物污染物相关的无菌腹膜炎。肽聚糖是革兰氏阳性细菌细胞壁的主要组分，因此可用作革兰氏阳性细菌的标记。在这点上，肽聚糖测试可用于在使用腹膜透析溶液的患者中有效地预防腹膜炎，所述透析溶液如含有包括艾考糊精等的葡萄糖聚合物的腹膜透析溶液。
文档编号C12Q1/37GK101879181SQ200910246399
公开日2010年11月10日 申请日期2005年2月18日 优先权日2004年2月27日
发明者利奥·马尔蒂斯, 小威廉·F·欧文, 杰奎琳·A·金茨勒, 梅于尔·帕特尔, 约瑟夫·A·吉耶季赫, 詹姆士·W·蒙格文 申请人:巴克斯特国际公司;巴克斯特医疗保健股份有限公司