专利名称：大豆锈病菌的检测引物、试剂盒以及实时pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及包含酶或微生物的测定或检验方法，特别是涉及一种大豆锈病菌的检测引物、试剂盒以及实时PCR检测方法。
背景技术：
大豆锈病菌(Phakopsora pachyrhizi Sydow)，又名豆薯多层锈菌，是危害豆科经济作物的专性寄生的气传真菌，属担子菌亚门真菌。寄主范围目前认为仅限于豆科植物，主 要侵染大豆叶片和叶柄，严重时茎杆和豆荚也能受害，属于主权国家禁止入境的植物检疫 危险性有害生物。有必要建立大豆锈病菌的快速检测方法，加强口岸检疫有效防止大豆锈 病菌进境，以保护本国大豆生产。通常采用的现有聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，缩略为PCR)的分子 诊断方法，可以基本满足部分植物病原微生物的准确快速检疫、检测和鉴定要求，但是，将 EvaGreen染料用于实时PCR和高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting，缩略为HRM) 分析进行植物病原真菌的检测在国内外还是处于起步阶段。EvaGreen染料是一种DNA结合 染料，非常稳定且无致突变性和细胞毒性。通过有选择的结合双链DNA，EvaGreen在实验中 可以使用较高的浓度，对PCR的抑制作用很低，对低熔点的DNA链也可以检测到。而HRM是 一种遗传学分析手段，它通过实时监测升温过程中DNA染料与PCR扩增产物的结合情况的 独特的熔解曲线形状，特别是其中的产物峰，就可以对不同的核酸片段进行区分，而且具有 很高的特异性、稳定性和重复性。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是弥补上述现有技术的不足，提出一种大豆锈病 菌的检测引物。本发明所要解决的另一个技术问题是弥补上述现有技术的不足，提出一种大豆锈 病菌的检测试剂盒。本发明所要解决的再一个技术问题是弥补上述现有技术的不足，提出一种大豆锈 病菌的实时PCR检测方法。对于本发明所要解决的大豆锈病菌检测引物，采用以下技术方案予以解决这种大豆锈病菌的检测引物，包括正向引物Rs-F和反向引物Rs-R，所述正向引物Rs-F的序列是SEQ ID NO 1 :PPSG2FP_F :5，-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3，；所述反向引物Rs-R的序列是SEQ ID NO 2 :PPSG2RP_R :5’ -ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3，。优选地，所述正向引物Rs-F具有如下的核酸序列PPSG2FP-F :5，-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3，SEQ ID NO :1。优选地，所述反向引物Rs-R具有如下的核酸序列
PPSG2RP-R :5，-ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3，SEQ ID NO :2。对于本发明所要解决的大豆锈病菌的检测试剂盒，采用以下技术方案予以解决这种大豆锈病菌的检测试剂盒包含一对引物，所述一对引物是正向引物Rs-F和反向引物Rs-R，所述正向引物Rs-F的序列是SEQ ID NO 1 :PPSG2FP_F :5，-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3，；所述反向引物Rs-R的序列是SEQ ID NO 2 :PPSG2RP_R :5’ -ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3‘。优选地，所述正向引物Rs-F具有如下的核酸序列PPSG2FP-F :5，-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3，SEQ ID NO :1。优选地，所述反向引物Rs-R具有如下的核酸序列PPSG2RP-R :5，-ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3，SEQ ID NO :2。对于本发明所要解决的大豆锈病菌的实时PCR检测方法，采用以下技术方案予以 解决这种大豆锈病菌的实时PCR检测方法，依次有以下步骤1)合成引物，2)待测物中加入引物，3)扩增反应。这种大豆锈病菌的实时PCR检测方法的特点是所述步骤1)合成引物，是一对由特异性正向引物Rsf-F、特异性反向引物Rsf-R组 成的一对特异性引物，再按照特异性正向引物Rsf-F、特异性反向引物Rsf-R的序列分别合 成特异性引物备用；所述正向引物Rs-F的序列是SEQ ID NO 1 :PPSG2FP_F :5，-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3，；所述反向引物Rs-R的序列是SEQ ID NO 2 :PPSG2RP_R :5’ -ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3，。对于本发明所要解决的大豆锈病菌的实时PCR检测方法，采用以下进一步的技术 方案予以解决所述步骤2)待测物中加入引物，是对大豆锈病菌的PCR扩增体系进行扩增反应。所述扩增体系包含浓度为10 IOOng/ μ L的1 μ L大豆锈病菌基因组DNA模板、 1 μ M备用的特异性引物、EvaGreen反应混合液EvaGreen Master Mix 12. 5 μ L，总体积为 25 μ L0所述步骤3)扩增反应依次有以下子步骤3 · 1)在 95°C下预变性 15min ；3 · 2)在95°C下反应15s、在60°C下反应60s，为一个反应区间，重复进行40次；3 · 3)对PCR仪自动记录的反应结果进行HRM分析，95°C持续15秒，60°C持续15 秒，95 °C持续15秒。所述HRM分析是对反映大豆锈病菌基因组DNA为模板与PCR扩增产物反应结果的 熔解曲线进行分析。所述分析的判定标准是如果阳性对照有明显的产物峰，阴性对照和空白对照没 有产物峰，而样品的检测结果有产物峰，判定待测物为大豆锈病菌；如果阳性对照有明显的产物峰，阴性对照和空白对照没有产物峰，而样品的检测结果没有产物峰，判定待测物为非 大豆锈病菌。 本发明与现有技术对比的有益效果是提出了适用于大豆锈病菌EvaGreen PCR快速检测的引物和试剂盒。检测方法具 有检测简单、快速、准确、特异性强、灵敏度高、重复性好、易于推广应用的优点，可以广泛用 于对实际检疫和田间调查过程中所发现的病组织进行大豆锈病菌分子生物学鉴定或检测， 特别适用于口岸检疫等时效性要求特别强的场合使用。
附图是本发明具体实施方式
的PCR扩增反应的特异性试验结果示意图。
具体实施例方式下面将结合具体实施方式
并对照附图对本发明作进一步说明。一种大豆锈病菌的实时PCR检测方法，采用检测试剂盒中的检测引物，包括正向 引物Rs-F和反向引物Rs-R，正向引物Rs-F的序列是SEQ ID NO 1 :PPSG2FP_F :5，-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3，；具有如下的核酸序列PPSG2FP-F :5，-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3，SEQ ID NO 1；反向引物Rs-R的序列是SEQ ID NO 2 :PPSG2RP_R :5’ -ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3，。具有如下的核酸序列PPSG2RP-R :5，-ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3，SEQ ID NO :2。具体检测依次有以下步骤1)合成引物先设计一对由特异性正向引物Rsf-F、特异性反向引物Rsf-R组成的 一对特异性引物，再按照特异性正向引物Rsf-F、特异性反向引物Rsf-R的序列分别合成特 异性引物备用；正向引物Rs-F的序列是SEQ ID NO 1 :PPSG2FP_F :5，-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3，；反向引物Rs-R的序列是SEQ ID NO 2 :PPSG2RP_R :5’ -ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3，。2)待测物中加入引物，对大豆锈病菌的PCR扩增体系进行扩增反应。扩增体系 包含浓度为10 lOOng/μ L的IyL大豆锈病菌基因组DNA模板、1μ M备用的特异性引 物、EvaGreen反应混合液EvaGreen Master Mix 12. 5 μ L(超世生物公司出品，型号为 H30102)，总体积为 25 μ L03)扩增反应依次有以下子步骤3 · 1)在 95°C下预变性 15min ；3 · 2)在95°C下反应15s、在60°C下反应60s为一个反应区间，重复进行40次；3 · 3)对PCR仪自动记录的反应结果进行HRM分析，95°C持续15秒，60°C持续15秒，95 °C持续15秒。对反映DNA染料与PCR扩增产物反应结果的熔解曲线进行分析的判定标准是如果以大豆锈病菌基因组DNA为模板的阳性对照有明显的产物峰，阴性对照和空白对照没有 产物峰，而样品的检测结果有产物峰，则判定所检测的真菌为大豆锈病菌；如果以大豆锈病 菌基因组DNA为模板的阳性对照有明显的产物峰，阴性对照和空白对照没有产物峰，而样 品的检测结果没有产物峰，则判定所检测的真菌为非大豆锈病菌。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下做出若干等同替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当 视为属于本发明的保护范围。0910206ST-大豆锈病菌的检测引物、试剂盒以及实时PCR检测方法-序列表.SEQ序列表<110>深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心<120>大豆锈病菌的检测引物、试剂盒以及实时PCR检测方法<130)0910206 ST<160>2<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>1gtgcacttta ttgtggctca aaact25<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>2atgattaata ggtgggttgc age2权利要求
一种大豆锈病菌的检测引物，包括正向引物Rs-F和反向引物Rs-R，其特征在于所述正向引物Rs-F的序列是SEQ ID NO1PPSG2FP-F5’-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3’；所述反向引物Rs-R的序列是SEQ ID NO2PPSG2RP-R5’-ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3’。
2.如权利要求1所述的大豆锈病菌的检测引物，其特征在于 所述正向引物Rs-F具有如下的核酸序列PPSG2FP-F 5' -GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3’ SEQ ID NO :1。
3.如权利要求2所述的大豆锈病菌的检测引物，其特征在于 所述反向引物Rs-R引物具有如下的核酸序列 PPSG2RP-R 5' -ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3’ SEQ ID NO :2。
4.一种大豆锈病菌的检测试剂盒，包含一对引物，所述一对引物是正向引物Rs-F和反 向引物Rs-R，其特征在于所述正向引物Rs-F的序列是SEQ ID NO 1 :PPSG2FP-F :5’ -GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3’ ； 所述反向引物Rs-R的序列是SEQ ID NO 2 :PPSG2RP-R :5’ -ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3，。
5.一种大豆锈病菌的实时PCR检测方法，依次有以下步骤1)合成引物，2)待测物中 加入引物，3)扩增反应，其特征在于所述步骤1)合成引物，是先设计一对由特异性正向引物Rsf-F、特异性反向引物Rsf-R 组成的一对特异性引物，再按照特异性正向引物Rsf-F、特异性反向引物Rsf-R的序列分别 合成特异性引物备用；所述正向引物Rs-F的序列是SEQ ID NO 1 :PPSG2FP-F :5’ -GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3’ ； 所述反向引物Rs-R的序列是SEQ ID NO 2 :PPSG2RP-R :5’ -ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3，。
6.如权利要求5所述的大豆锈病菌的实时PCR检测方法，其特征在于所述步骤2)待测物中加入引物，是对大豆锈病菌的PCR扩增体系进行扩增反应。
7.如权利要求4所述的大豆锈病菌的实时PCR检测方法，其特征在于所述扩增体系包含浓度为10 IOOng/ μ L的1 μ L大豆锈病菌基因组DNA模板、1 μ M 备用的特异性引物、EvaGreen反应混合液EvaGreen Master Mix 12. 5 μ L，总体积为25 μ L。
8.如权利要求7所述的大豆锈病菌的实时PCR检测方法，其特征在于 所述步骤3)扩增反应依次有以下子步骤3 · 1)在95°C下预变性15min ；3 · 2)在95°C下反应15s、在60°C下反应60s，为一个反应区间，重复进行40次； 3 · 3)对PCR仪自动记录的反应结果进行HRM分析，95°C持续15秒，60°C持续15秒， 95°C持续15秒。
9.如权利要求8所述的大豆锈病菌的实时PCR检测方法，其特征在于所述HRM分析是对反映大豆锈病菌基因组DNA为模板与PCR扩增产物反应结果的熔解曲线进行分析判定。
10.如权利要求9所述的大豆锈病菌的实时PCR检测方法，其特征在于 所述分析判定的标准是如果阳性对照有明显的产物峰，阴性对照和空白对照没有产 物峰，而样品的检测结果有产物峰，判定待测物为大豆锈病菌；如果阳性对照有明显的产物 峰，阴性对照和空白对照没有产物峰，而样品的检测结果没有产物峰，判定待测物为非大豆 锈病菌。
全文摘要
一种大豆锈病菌的检测引物、试剂盒以及实时PCR检测方法，引物包括正向引物Rs-F和反向引物Rs-R，正向引物的序列是5’-GTGCACTTTATTGTGGCTCAAAACT-3’；反向引物的序列是5’-ATGATTAATAGGTGGGTTGCAGC-3’。检测方法依次有合成引物、待测物中加入引物、扩增反应包括预变性、重复进行一个反应区间、对PCR仪自动记录的反应结果进行HRM分析。具有检测简单、快速、准确、特异性强、灵敏度高、重复性好、易于推广应用的优点，可广泛用于对实际检疫和田间调查过程中所发现的病组织进行大豆锈病菌分子生物学鉴定或检测，特别适用于口岸检疫等时效性要求特别强的场合使用。
文档编号C12N15/11GK101798593SQ20091024640
公开日2010年8月11日 申请日期2009年11月19日 优先权日2009年11月19日
发明者仲建忠, 康林, 李芳荣, 王颖, 程颖慧, 章桂明, 陈枝楠 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心