专利名称：一种利用加入氧载体的培养基发酵提高氧化葡萄糖杆菌生物量的方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种利用加入氧载体的培养基发酵提高 氧化葡萄糖杆菌生物量的方法。
背景技术：
米格列醇(migliton)是拜耳公司在1997年度上市的新型抗糖尿病药物。它是从 杆菌肉汤培养基中发现的一种新型肠道α -葡萄糖苷酶抑制剂，是1-脱氧野尻霉素的母体 修饰产物，属于N-取代-1-脱氧野尻霉素类型，结构与葡萄糖相似。尽管用化学合成的方 法能够制备米格列醇，但化学全合成法制备米格列醇的步骤较多，米格列醇分子中含有的 四个手性中心也给化学合成带来了很大的困难。目前生产规模大多采用生物合成来制备米 格列醇。米格列醇的生物合成法据文献报道大致有二条路线一是先由野尻霉素或ι-脱 氧野尻霉素产生菌进行发酵，制备获得野尻霉素或ι-脱氧野尻霉素，然后再经过化学合成 方法获得米格列醇，这是最原始的途径；二是应用氧化葡萄糖酸菌转化制备米格列醇关键 中间体N-取代-1-脱氧野尻霉素，其主要通过化学合成-生物转化-化学合成的方法来制 备，工艺路线见说明书附图。US4266025, ΕΡ0477160, USP2001/0019837公布了另外的米格列醇的生产方法，即
化学合成结合生物催化的方法。但由于菌体活力不高，导致生物催化时间过长，造成生产成 本高，生产周期长，给工业化生产带来很大的障碍。由于微生物酶的高效专一性，省略了化学合成过程中为达到专一地改造某个目的 基团必须进行的加入和脱除保护基团的步骤，大大简化了制备过程，提高了反应收率。氧 化葡萄糖酸杆菌用于转化特定底物制备1-脱氧野尻霉素及其衍生物具有很多优点1)转 化液经离心除去菌体，无需分离纯化出中间体，就可进行下一步合成；2)无需基团保护， 成本大大降低，且避免因去除保护剂而造成的回收率下降；3)中间体6-(取代胺基)-6-脱 氧-α -L-山梨呋喃糖具有较高的溶解度和稳定性，不易被降解。但还没有对于转化机理的 报道，可以肯定是，氧化葡萄糖杆菌中含有参与该转化反应的生物酶或酶系，氧化葡萄糖杆 菌的催化能力与其含有的生物酶系的数量和活力有直接关系。目前，米格列醇虽然已经实现工业化生产，但由于菌种活力低，利用微生物将 1-羟乙胺基-1-脱氧-D-山梨醇转化为呋喃型葡萄糖胺时转化效率低，转化时间长，劳动强 度大，生产成本高。传统菌种选育主要采用诱变育种的方法，诱变的方法历史悠久，过去一 直依赖诱变的方法来提高产量，目前大多数生物发酵工业生产仍然在使用这些方法。但是 这种方法具有相当大的随机性，而且菌种若长期使用诱变剂处理，其活力会逐渐下降。目前，还没有利用加入氧载体的培养基发酵提高氧化葡萄糖杆菌生物量的方法的 相关文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用加入氧载体的培养基发酵提高氧化葡萄糖杆菌生 物量的方法，通过在培养基中加入合适的氧载体，提供一种氧载体发酵体系，在没有添加其 它物质，没有额外能源消耗的条件下，大幅提高了培养基中的溶解氧浓度，从而使发酵生物 量大幅度提高，并且并不会影响该菌种的催化能力。本发明采用氧化葡萄糖杆菌为微生物菌种，经过菌种培养、发酵培养离心分离得 到菌丝体，其特征是发酵培养基中添加氧载体、表面活性剂，其具体步骤如下具体步骤和方法如下⑴菌种培养将氧化葡萄糖杆菌菌种接种到pH为7. 0的种子培养基中，在20-30°C，150-220rpm 恒温振荡培养箱中培养20-30小时。其中，菌种培养基含有山梨醇50_80g/L，酵母膏10_40g/L，磷酸二氢钾0. 5_2g/ L0⑵发酵培养将经过培养得到的种子培养液接种到添加氧载体、表面活性剂的pH为7. 0的发酵 培养基中，在20-30 V，150-220rpm恒温振荡培养箱中培养36-48小时后，离心收集菌体。其 中，发酵培养基含有山梨醇50-80g/L，酵母膏10-40g/L，磷酸二氢钾0. 5_2g/L ；培养基中氧载体为正己烷或者正十二烷，氧载体与培养基的体积比为 5-50 1000。正己烷或正十二烷在这里是一种与水不互相溶解、对微生物没有毒害、具有 较高溶解氧能力的氧载体；同时为了降低培养基的粘度，进一步提高溶解氧的水平，本培养 基加入表面活性剂为吐温-80、硬脂酸、十二烷基苯磺酸钠中的一种或多种，每升培养基中 含有表面活性剂0. 2-2g，优选吐温-80。离心采用高速冷冻离心机，IOOOOrpm离心15分钟。对所得到的菌丝体进行生物催化验证将步骤⑵中得到的菌丝体以1 1的比例加入到pH为6. 0的6%的N-羟乙基 葡萄糖胺，在20°C，200rpm恒温振荡培养箱中转化15小时，取样，离心，上清液点硅胶板，在 甲醇乙醇氨水体积比为4 3 3的层析液中层析，吹干，在碘瓶中显色观察、分析结^ ο上述过程中，种子培养基和发酵培养基pH的调节均采用常用的5%氢氧化钠溶液 调节；由于催化的底物N-羟乙基葡萄糖胺为碱性，需要用浓盐酸调节pH至6. 0左右。本发明通过加入氧载体和表面活性剂，使发酵体系具有氧传递速度快，具有泡沫 生成少，剪切力小等优点，可以显著提高氧化葡萄糖杆菌的生物量，最高生物量可以达到未 加入氧载体发酵得到生物量的2倍，菌体的生物催化能力得到增强。
具体实施例方式实施例1(1)菌种培养将氧化葡萄糖杆菌菌种接种到pH为7. 0的种子培养基中，在25°C，150rpm恒温振荡培养箱中培养25小时。种子培养基的组成和含量为山梨醇50g/L，酵母膏20g/L，磷酸 二氢钾 0. 5g/L。(2)发酵培养将经过培养得到的种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为5%，发酵培养基的 组成和含量为山梨醇50g/L，酵母膏20g/L，磷酸二氢钾lg/L，pH为7. 0。发酵培养方式采 用摇瓶培养，即采用500毫升三角瓶，装液量为50毫升，在25°C，200rpm恒温振荡培养箱中 培养40小时后，用高速冷冻离心机，IOOOOrpm离心15分钟，收集菌体得到菌体4. 8克。(3)生物催化称取离心得到的菌丝体2克，称取N-羟乙基葡萄糖胺2克，以浓盐酸调节pH至 6. 0并加入纯化水33毫升，使浓度为6%左右，放入500毫升三角瓶中，在20°C，200rpm恒 温振荡培养箱中转化15小时，取样，离心，上清液点硅胶板，在甲醇乙醇氨水体积比为 4:3: 3的层析液中层析，吹干，在碘瓶中显色，结果显示，转化率约为70%。实施例2(1)菌种培养将氧化葡萄糖杆菌菌种接种到pH为7. 0的种子养基中，在25°C，150rpm恒温振荡 培养箱中培养25小时。种子培养基的组成和含量为山梨醇50g/L，酵母膏20g/L，磷酸二 氢钾 0. 5g/L。(2)发酵培养将经过培养得到的种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为5%，发酵培养基的 组成和含量为山梨醇50g/L，酵母膏20g/L，磷酸二氢钾lg/L，20ml/吐温-80L经过过滤除 菌的正己烷，PH为7. 0。发酵培养方式采用摇瓶培养，即采用500毫升三角瓶，装液量为50 毫升，在25°C，200rpm恒温振荡培养箱中培养40小时后，用高速冷冻离心机，IOOOOrpm离 心15分钟，收集菌体得到菌体7. 2克，比未加入氧载体的培养基发酵收集的菌体4. 8克多 50%。(3)生物催化称取离心得到的菌丝体2克，称取N-羟乙基葡萄糖胺2克，以浓盐酸调节pH至 6. 0并加入纯化水33毫升，使浓度为6%左右，放入500毫升三角瓶中，在20°C，200rpm恒 温振荡培养箱中转化15小时，取样，离心，上清液点硅胶板，在甲醇乙醇氨水体积比为 4:3: 3的层析液中层析，吹干，在碘瓶中显色，结果显示，转化率约为75%。实施例3(1)菌种培养将氧化葡萄糖杆菌菌种接种到pH为7. 0的种子培养基中，在30°C，200rpm恒温振 荡培养箱中培养20小时。种子培养基的组成和含量为山梨醇80g/L，酵母膏20g/L，磷酸 二氢钾2g/L。(2)发酵培养将经过培养得到的种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为5%，发酵培养基的 组成和含量为山梨醇60g/L，酵母膏20g/L，磷酸二氢钾lg/L，30ml/L经过过滤除菌的正 己烷，PH为7. 0。发酵培养方式采用摇瓶培养，即采用500毫升三角瓶，装液量为50毫升， 在30°C，220rpm恒温振荡培养箱中培养48小时后，用高速冷冻离心机，IOOOOrpm离心15分钟，收集菌体得到菌体7. 8克，比未加入氧载体的培养基发酵收集的菌体4. 8克多62. 5%。(3)生物催化称取离心得到的菌丝体2克，称取N-羟乙基葡萄糖胺2克，以浓盐酸调节pH至 6. 0并加入纯化水33毫升，使浓度为6%左右，放入500毫升三角瓶中，在20°C，200rpm恒 温振荡培养箱中转化15小时，取样，离心，上清液点硅胶板，在甲醇乙醇氨水体积比为 4:3: 3的层析液中层析，吹干，在碘瓶中显色，结果显示，转化率约为65%。实施例4(1)菌种培养将氧化葡萄糖杆菌菌种接种到pH为7. 0的种子培养基中，在30°C，200rpm恒温振 荡培养箱中培养20小时。种子培养基的组成和含量为山梨醇60g/L，酵母膏15g/L，磷酸 二氢钾 1. 5g/L。(2)发酵培养将经过培养得到的种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为5%，发酵培养基的 组成和含量为山梨醇60g/L，酵母膏15g/L，磷酸二氢钾1. 5g/L，0. 5g/L的吐温-80，40ml/ L经过过滤除菌的正己烷，pH为7. 0。发酵培养方式采用摇瓶培养，即采用500毫升三角瓶， 装液量为50毫升，在22°C，220rpm恒温振荡培养箱中培养38小时后，用高速冷冻离心机， IOOOOrpm离心15分钟，收集菌体得到菌体8. 1克，比未加入氧载体的培养基发酵收集的菌 体4. 8克多68. 8%。(3)生物催化称取离心得到的菌丝体2克，称取N-羟乙基葡萄糖胺2克，以浓盐酸调节pH至 6. 0并加入纯化水33毫升，使浓度为6%左右，放入500毫升三角瓶中，在20°C，200rpm恒 温振荡培养箱中转化15小时，取样，离心，上清液点硅胶板，在甲醇乙醇氨水体积比为 4:3: 3的层析液中层析，吹干，在碘瓶中显色，结果显示，转化率约为70%。实施例5(1)菌种培养将氧化葡萄糖杆菌菌种接种到pH为7. 0的种子培养基中，在30°C，200rpm恒温振 荡培养箱中培养20小时。种子培养基的组成和含量为山梨醇50g/L，酵母膏10g/L，磷酸 二氢钾 0. 5g/L。(2)发酵培养将经过培养得到的种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为5%，发酵培养基的 组成和含量为山梨醇50g/L，酵母膏10g/L，磷酸二氢钾0. 5g/L，lg/L的吐温-80，50ml/L 经过过滤除菌的正己烷，pH为7. 0。发酵培养方式采用摇瓶培养，即采用500毫升三角瓶， 装液量为50毫升，在22°C，220rpm恒温振荡培养箱中培养38小时后，用高速冷冻离心机， IOOOOrpm离心15分钟，收集菌体得到菌体6. 9克，比未加入氧载体的培养基发酵收集的菌 体4. 8克多44% ο(3)生物催化称取离心得到的菌丝体2克，称取N-羟乙基葡萄糖胺2克，以浓盐酸调节pH至 6. 0并加入纯化水33毫升，使浓度为6%左右，放入500毫升三角瓶中，在20°C，200rpm恒 温振荡培养箱中转化15小时，取样，离心，上清液点硅胶板，在甲醇乙醇氨水体积比为4:3: 3的层析液中层析，吹干，在碘瓶中显色，结果显示，转化率约为60%。实施例6(1)菌种培养将氧化葡萄糖杆菌菌种接种到pH为7. 0的种子培养基中，在30°C，200rpm恒温振 荡培养箱中培养20小时。种子培养基的组成和含量为山梨醇80g/L，酵母膏20g/L，磷酸 二氢钾2g/L。(2)发酵培养将经过培养得到的种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为5%，发酵培养基的 组成和含量为山梨醇80g/L，酵母膏20g/L，磷酸二氢钾2g/L，1. 5g/L的吐温-80，40ml/ L经过过滤除菌的正己烷，pH7. 0。发酵培养方式采用摇瓶培养，即采用500毫升三角瓶， 装液量为50毫升，在22°C，220rpm恒温振荡培养箱中培养38小时后，用高速冷冻离心机， IOOOOrpm离心15分钟，收集菌体得到菌体9. 9克，比未加入氧载体的培养基发酵收集的菌 体4. 8克多106%。(3)生物催化称取离心得到的菌丝体2克，称取N-羟乙基葡萄糖胺2克，以浓盐酸调节pH至 6. 0并加入纯化水33毫升，使浓度为6%左右，放入500毫升三角瓶中，在20°C，200rpm恒 温振荡培养箱中转化15小时，取样，离心，上清液点硅胶板，在甲醇乙醇氨水体积比为 4:3: 3的层析液中层析，吹干，在碘瓶中显色，结果显示，转化率约为75%。实施例7(1)菌种培养将氧化葡萄糖杆菌菌种接种到pH为7. 0的种子培养基中，在30°C，200rpm恒温振 荡培养箱中培养20小时。种子培养基的组成和含量为山梨醇70g/L，酵母膏20g/L，磷酸 二氢钾 1. 5g/L。(2)发酵培养将经过培养得到的种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为5%，发酵培养基的 组成和含量为山梨醇70g/L，酵母膏20g/L，磷酸二氢钾1. 5g/L，2. Og/L的吐温-80，50ml/ L经过过滤除菌的正己烷，pH为7. 0。发酵培养方式采用摇瓶培养，即采用500毫升三角瓶， 装液量为50毫升，在^°C，200rpm恒温振荡培养箱中培养45小时后，用高速冷冻离心机， IOOOOrpm离心15分钟，收集菌体得到菌体9. 4克，比未加入氧载体的培养基发酵收集的菌 体4. 8克多95. 8%。(3)生物催化称取离心得到的菌丝体2克，称取N-羟乙基葡萄糖胺2克，以浓盐酸调节pH至 6. 0并加入纯化水33毫升，使浓度为6%左右，放入500毫升三角瓶中，在20°C，200rpm恒 温振荡培养箱中转化15小时，取样，离心，上清液点硅胶板，在甲醇乙醇氨水体积比为 4:3: 3的层析液中层析，吹干，在碘瓶中显色，结果显示，转化率约为75%。
附图1应用氧化葡萄糖酸菌转化制备米格列醇关键中间体N-取代-1-脱氧野尻霉素 的工艺路线图，其中(I)为1-羟乙胺基-1-脱氧-D-山梨醇，(II)为呋喃型葡萄糖胺，(III) 为米格列醇。
权利要求
1.一种提高氧化葡萄糖杆菌生物量的发酵方法，以葡萄糖氧化杆菌为微生物菌种，经 过菌种培养、发酵培养离心分离得到菌丝体，其特征是发酵培养基中添加氧载体、表面活性 剂，其具体步骤如下(1)菌种培养将氧化葡萄糖杆菌菌种接种到pH为7. 0的种子培养基中，在20-30°C，150-220rpm恒 温振荡培养箱中培养20-30小时；(2)发酵培养将步骤(1)中得到的种子培养液接种到添加氧载体、表面活性剂的PH为7. 0的发酵培 养基中，在20 30°C，150 220rpm恒温振荡培养箱中培养36 48小时后，离心收集菌 体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于氧载体为正己烷或者正十二烷。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于氧载体与培养基的体积比为5-50 1000。
4.根据权利要求1步骤(1)所述的方法，其特征在于菌种培养基含有山梨醇 50-80g/L，酵母膏 10-40g/L，磷酸二氢钾 0. 5_2g/L。
5.根据权利要求1步骤( 所述的方法，其特征在于发酵培养基含有山梨醇50-80g/ L、酵母膏10-40g/L、磷酸二氢钾0. 5-2g/L。
6.根据权利要求1步骤( 所述的方法，其特征在于发酵培养基中加入表面活性剂为 吐温-80、硬脂酸、十二烷基苯磺酸钠中的一种或多种。
7.根据权利要求1步骤( 所述的方法，其特征在于每升培养基中含有表面活性剂 0.2-2g。
8.根据权利要求1步骤( 所述的方法，其特征在于其特征在于发酵培养基中加入表 面活性剂为吐温-80。
全文摘要
本发明涉及一种利用加入氧载体的培养基发酵提高氧化葡萄糖杆菌生物量的方法。通过在培养基中加入合适的氧载体，提供一种氧载体发酵体系，在没有添加其它物质，没有额外能源消耗的条件下，大幅提高了培养基中的溶解氧浓度，从而使发酵生物量大幅度提高。
文档编号C12N1/38GK102086445SQ200910246200
公开日2011年6月8日 申请日期2009年12月4日 优先权日2009年12月4日
发明者王钦超, 肖月华, 赵志全 申请人:山东新时代药业有限公司