专利名称：大豆锈病菌检测引物、试剂盒及实时荧光pcr检测方法
技术领域：
本发明包含酶或微生物的测定或检验方法，特别是涉及一种大豆锈病菌检测引 物、试剂盒及实时荧光PCR检测方法。
背景技术：
2004年，大豆锈病菌(Phakopsora pachyrhizi Sydow)引发的大豆锈病被美国大 豆种植业者列为“头号敌人”首次在美国本土发现，美国农业部海外农业局和动植物检疫局 及时将该病害的发生情况通报给我国，要求我国关注该病害。美国农业部所作的风险分析 报告认为，如果大豆锈病到达美国，第一年将损失6-13亿美元，如果得不到有效控制，将会 对美国的大豆种植业产生重创，因此美国很可能对进口美国的大豆或豆粕采取限制措施， 这可能给世界大豆市场尤其是中国的大豆进口和食品安全带来严重影响。大豆锈病菌主要为害叶片、茎杆和叶柄，感染大豆种子。大豆锈病严重影响大豆的 产量，全世界大豆产区的产量因大豆锈病损失可达10% 80%不等，早期发病甚至造成绝 收。目前该病在亚洲产区的为害日益猖獗，在南美和北美，也给大豆生产造成了极大威胁。 美国发生的大豆锈病与中国本土的未必是同一种，中国是世界头号大豆进口国，我国的大 部分地区属于温带气候，尤其是我国沿海各地常年雨量丰沛，气候湿润，非常适合大豆锈病 菌的生长，这极大的增加了大豆锈病中一些我国尚未发现的生理小种或新种传入我国的可 能性。因此需加强对该病的检疫，防止此病传入、传出是当前保护我国大豆生产和贸易的一 个非常重要而又迫切需要解决的新任务，而建立该病菌的快速检测方法是加强口岸检疫的 首要前提条件。国内对大豆锈病的鉴定通常利用它们的冬孢子进行比较，但大豆锈病的冬孢子阶 段在田间经常观察不到。此外，早期大豆锈病菌的形态很容易和其它的病害相混淆，我国国 内尚未有针对该病害的快速检测方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是弥补上述现有技术的不足，提出一种大豆锈病菌 检测引物。本发明所要解决的另一个技术问题是弥补上述现有技术的不足，提出一种大豆 锈病菌检测试剂盒。本发明所要解决的再一个技术问题是弥补上述现有技术的不足，提出一种大豆 锈病菌实时荧光PCR检测方法。本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决一种大豆锈病菌检测引物，包括，SEQ ID NO 1 序列为 5，-CCATTTAATTGGCTCATTGATTGATA-3，的正向引物；SEQ ID NO 2 序列为 5，-TGATTAATAGGTGGGTTGCAGCTT-3，的反向引物。一种大豆锈病菌检测试剂盒，包括引物和探针，
所述引物包括SEQ ID NO 1 序列为 5，-CCATTTAATTGGCTCATTGATTGATA-3，的正向引物；SEQ ID NO 2 序列为 5，-TGATTAATAGGTGGGTTGCAGCTT-3，的反向引物；所述探针包括SEQ ID NO 3 序列为 5，-FAM-ATCTTTGGGCAATGGT-MGB-3，的探针，其中，FAM 为荧 光分子，MGB为另结合了 Minor Groove binder结合物。本发明的技术问题通过以下进一步的技术方案予以解决所述引物和探针包含在实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCR Master Mix。优选的技术方案中，所述实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCR Master Mix体积为5 u L，所述 引物浓度为0. 9 ii M/5 u L，所述探针浓度为0. 2 ii M/5 u L。一种大豆锈病菌实时荧光PCR检测方法，依次有以下步骤1)待测物中加入引物和探针，2)扩增反应，3)报告检测结果；所述步骤1)的引物包括SEQ ID NO 1 序列为 5，-CCATTTAATTGGCTCATTGATTGATA-3，的正向引物；SEQ ID NO 2 序列为 5，-TGATTAATAGGTGGGTTGCAGCTT-3，的反向引物；所述步骤1)的探针包括SEQ ID NO 3 序列为 5，FAM-ATCTTTGGGCAATGGT-MGB-3，，其中，FAM 为荧光分子， MGB 为另结合了 Minor Groove binder 结合物。本发明的技术问题通过以下进一步的技术方案予以解决所述步骤1)加入的引物和探针包含在实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCRMaster Mix，所述实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCR Master Mix体积为 5ii L，所述引物浓度为0. 9iiM/5ii L，探针浓度为0. 2iiM/5ii L。优选的技术方案中，所述步骤2)扩增反应是对大豆锈病菌的荧光PCR扩增体系进行扩增反应，所述 扩增体系的总体积为10 iiL，其中所述实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCRMaster Mix体积为5 u L，所述引物浓度为0. 9 u M/5 u L，所述探针浓度为0. 2 u M/5 u L，所述待测物 为 1 y L0
所述步骤2)扩增反应依次有以下子步骤 2. 1)在50°C下持续2分钟； 2 2)在95°C下持续10分钟；
2 3)在95°C下持续15秒；在63°C下持续1分钟，为一个反应区间，重复进行40次。所述步骤3)报告检测结果的判定标准为，如果待测物的报告荧光信号有增加，判 定待测物是大豆锈病菌；如果待测物的报告荧光信号没有增加，判定待测物是非大豆锈病 菌。进一步优选的技术方案中，所述步骤1)中还包括配置浓度为lO-lOOng/ u L的大豆锈病菌DNA模板；所述步 骤2)中还包括在含大豆锈病菌DNA模板的阳性对照组中加入试剂盒中的试剂，等待扩增步 5骤，并检测扩增过程中阳性对照组的荧光信号；在不含大豆锈病菌DNA模板的阴性对照组 中加入试剂盒中的试剂，等待扩增步骤，并检测扩增过程中阴性对照组的荧光信号；在空白 对照组中加入试剂盒中的试剂，等待扩增步骤，并检测扩增过程中空白对照组的荧光信号； 所述步骤3)为根据阳性对照组、阴性对照组、空白对照组和待测物的报告荧光信号综合判 定报告检测结果。本发明与现有技术对比的有益效果是本发明提出了一种大豆锈病菌检测引物、试剂盒及实时荧光PCR检测方法，能对 实际检疫和田间调查过程中所发现的病组织进行大豆锈病菌分子生物学鉴定或检测，克服 了现有形态学鉴定大豆锈病方法时检测周期长、需要丰富经验的缺点，也克服了现有分子 检测方法操作复杂或检测灵敏度不高、或特异性不强、或重复性不好的缺点。本发明检测快 速、特异性强，特别适用于口岸检疫等时效性要求特别强的场合使用。
附图是本发明具体实施方式
的样品特异性检测示意图。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
并对照附图对本发明做进一步详细说明。一种大豆锈病菌检测引物，包括SEQ ID NO 1 序列为 5，-CCATTTAATTGGCTCATTGATTGATA-3，的正向引物；SEQ ID NO 2 序列为 5，-TGATTAATAGGTGGGTTGCAGCTT-3，的反向引物。检测试剂盒包括引物和探针，引物包括SEQ ID NO 1 序列为 5，-CCATTTAATTGGCTCATTGATTGATA-3，的正向引物；SEQ ID NO 2 序列为 5，-TGATTAATAGGTGGGTTGCAGCTT-3，的反向引物；探针包括SEQ ID NO 3 序列为 5，-FAM-ATCTTTGGGCAATGGT-MGB-3，的探针，其中，FAM 为荧 光分子，MGB为另结合了 Minor Groove binder结合物。上述引物和探针包含在实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCR Master Mix，实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCR Master Mix的体积为5 ii L，引物浓度为 0. 9u M/5 u L,探针浓度为 0. 2 ii M/5 u L。检测方法，包括如下步骤1)将待测物的浓度配置为lO-lOOng/y L ；准备如下试剂实时荧光反应混合液 TaqMan Universal PCR Master5yL。其中，实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCR Master Mix是使用ABI公 司出品的型号为4304437的实时荧光反应混合液，其中包含以下引物和探针，引物浓度为 0. 9u M/5 u L,探针浓度为 0. 2 ii M/5 u L。引物包括SEQ ID NO 1 序列为 5，-CCATTTAATTGGCTCATTGATTGATA-3，的正向引物；SEQ ID NO 2 序列为 5，-TGATTAATAGGTGGGTTGCAGCTT-3，的反向引物；
探针包括SEQ ID NO 3 序列为 5，FAM-ATCTTTGGGCAATGGT-MGB-3，，其中，FAM 为荧光分子， MGB 为另结合了 Minor Groove binder 结合物。2)在待测物中加入步骤1)中的试剂，进行扩增反应，并检测扩增过程中待测物的
荧光信号。其中，反应的体系总体积为10 PL，各成分为实时荧光反应混合液 TaqManUniversal PCR Master Mix 5 ii L，弓| 物 0. 9 ii M/5 ii L，探针 0. 2 ii M/5 ii L，待测物 luL；扩增反应依次有以下子步骤2 1)在50°C下持续2分钟；2 2)在95°C下持续10分钟；2 3)在95°C下持续15秒；在63°C下持续1分钟，为一个反应区间，重复进行40 次；3)根据待测物的报告荧光信号判定待测物是否为大豆锈病菌。如果待测物的报告 荧光信号有明显增长，判定待测物是大豆锈病菌；如果待测物的报告荧光信号没有明显增 长，判定待测物是非大豆锈病菌。进一步地，可以设置对照组，通过对照组的荧光信号综合判定待测物是否大豆锈 病菌，提高检测准确度。设置的对照组包括三组含大豆锈病菌DNA模板的阳性对照组、不含大豆锈病 菌DNA模板的阴性对照组和空白对照组。检测时，配置三组对照组的DNA模板浓度为 10-100ng/ u L，在三组对照组中同样加入步骤A中的试剂，且同时保证对照组和待测组的 反应条件一样。检测对照组的荧光信号，综合分析待测物和三组对照组的报告荧光信号来 判定待测物是否为大豆锈病菌。判定标准为1)若定量PCR仪检测到以大豆锈病菌DNA为 模板的阳性对照报告荧光有明显信号增长，阴性对照和空白对照的报告荧光没有荧光信号 增长，而待测物的检测结果是报告荧光信号有明显增长，则表示待测物是大豆锈病菌；2) 若定量PCR仪检测到以大豆锈病菌DNA为模板的阳性对照报告荧光有明显信号增长，阴性 对照和空白对照的报告荧光没有荧光信号增长，而待测物的检测结果是报告荧光也没有荧 光信号增长，则表示待测物不是大豆锈病菌。如图1所示，为采用本发明的试剂盒和检测方法对于大豆锈病菌进行检测的样品 的特异性检测示意图。其中，横坐标表示循环个数，纵坐标表示荧光信号的增加值。从图1中可得，当反应扩增40个循环后，PP1-1、PP2_3和PP3-3样品有荧光信号增 加，曲线有扩增，说明PP1-1、PP2-3和PP3-3样品是大豆锈病菌；而其余样品，如UA16、U17 和water没有荧光信号增加，曲线没有扩增，说明UA16、U17不是大豆锈病菌。从检测结果可见，采用本发明的方法检测大豆锈病菌比传统形态学方法更加快 速、准确，且易于推广应用。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下做出若干替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为 属于本发明的保护范围。
权利要求
一种大豆锈病菌检测引物，其特征在于包括，SEQ ID NO1序列为5’-CCATTTAATTGGCTCATTGATTGATA-3’的正向引物；SEQ ID NO2序列为5’-TGATTAATAGGTGGGTTGCAGCTT-3’的反向引物。
2.一种大豆锈病菌检测试剂盒，其特征在于包括引物和探针， 所述引物包括SEQ ID NO 1 序列为 5，-CCATTTAATTGGCTCATTGATTGATA-3，的正向引物； SEQ ID NO 2 序列为 5，-TGATTAATAGGTGGGTTGCAGCTT-3，的反向引物； 所述探针包括SEQ ID NO 3 序列为 5，-FAM-ATCTTTGGGCAATGGT-MGB-3，的探针，其中，FAM 为荧光分 子，MGB为另结合了 Minor Groove binder结合物。
3.如权利要求2所述的用于检测大豆锈病菌的试剂盒，其特征在于所述引物和探针包含在实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCR Master Mix。
4.如权利要求2或3所述的用于检测大豆锈病菌的试剂盒，其特征在于所述实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCR Master Mix体积为5 μ L，所述引物 浓度为ο. 9 μ Μ/5 μ L，所述探针浓度为0. 2 μ Μ/5 μ L。
5.一种大豆锈病菌实时荧光PCR检测方法，其特征在于依次有以下步骤待测物中加 入引物和探针，2)扩增反应，3)报告检测结果；所述步骤1)的引物包括SEQ ID NO 1 序列为 5，-CCATTTAATTGGCTCATTGATTGATA-3，的正向引物； SEQ ID NO 2 序列为 5，-TGATTAATAGGTGGGTTGCAGCTT-3，的反向引物； 所述步骤1)的探针包括SEQ ID NO 3 序列为 5，FAM-ATCTTTGGGCAATGGT-MGB-3，，其中，FAM 为荧光分子，MGB 为另结合了 Minor Groove binder结合物。
6.如权利要求5所述的大豆锈病菌实时荧光PCR检测方法，其特征在于所述步骤1)加入的引物和探针包含在实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCRMaster Mix，所述实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCR Master Mix体积为 5 μ L，所述引物浓度为0. 9 μ Μ/5 μ L，探针浓度为0. 2 μ Μ/5 μ L。
7.如权利要求6所述的大豆锈病菌实时荧光PCR检测方法，其特征在于所述步骤2)扩增反应是对大豆锈病菌的荧光PCR扩增体系进行扩增反应，所述扩增 体系的总体积为10 μ L，其中所述实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCRMaster Mix 体积为5 μ L，所述引物浓度为0. 9 μ Μ/5 μ L，所述探针浓度为0. 2 μ Μ/5 μ L，所述待测物为 IyL0
8.如权利要求5所述的大豆锈病菌实时荧光PCR检测方法，其特征在于 所述步骤2)中的扩增反应依次有以下子步骤2 · 1)在50°C下持续2分钟； 2 · 2)在95°C下持续10分钟；2 · 3)在95°C下持续15秒；在63°C下持续1分钟，为一个反应区间，重复进行40次。
9.如权利要求5所述的大豆锈病菌实时荧光PCR检测方法，其特征在于所述步骤3)报告检测结果的判定标准为，如果待测物的报告荧光信号有增加，判定待测物是大豆锈病菌；如果待测物的报告荧光信号没有增加，判定待测物是非大豆锈病菌。
10.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中还包括配置浓度为 10-100ng/ u L的大豆锈病菌DNA模板；所述步骤2)中还包括在含大豆锈病菌DNA模板的 阳性对照组中加入试剂盒中的试剂，等待扩增步骤，并检测扩增过程中阳性对照组的荧光 信号；在不含大豆锈病菌DNA模板的阴性对照组中加入试剂盒中的试剂，等待扩增步骤，并 检测扩增过程中阴性对照组的荧光信号；在空白对照组中加入试剂盒中的试剂，等待扩增 步骤，并检测扩增过程中空白对照组的荧光信号；所述步骤3)为根据阳性对照组、阴性对 照组、空白对照组和待测物的报告荧光信号综合判定报告检测结果。
全文摘要
本发明公开了一种大豆锈病菌的检测引物、试剂盒及检测方法，所述引物、试剂盒及检测方法均包括序列为5’-CCATTTAATTGGCTCATTGATTGATA-3’的正向引物；序列为5’-TGATTAATAGGTGGGTTGCAGCTT-3’的反向引物；其中，试剂盒和检测方法中还包括序列为5’-FAM-ATCTTTGGGCAATGGT-MGB-3’的探针，其中，FAM为荧光分子，MGB为另结合了Minor Groove binder结合物。本发明克服了现有形态学鉴定时检测周期长、检测灵敏度不高、或特异性不强、或重复性不好缺点。本发明检测快速、特异性强，特别适用于口岸检疫等时效性要求特别强的场合使用。
文档编号C12Q1/04GK101875968SQ20091024640
公开日2010年11月3日 申请日期2009年11月19日 优先权日2009年11月19日
发明者仲建忠, 康林, 李芳荣, 王颖, 程颖慧, 章桂明, 陈枝楠 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心