专利名称：一种生物转化生产d(-)-酒石酸的工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，涉及一种D(-)_酒石酸的生产工艺，尤其是涉及一种 利用环氧琥珀酸水解酶生物转化生产D(-)_酒石酸的工艺。
背景技术：
像L(+)_酒石酸有很多重要用途一样，D(-)_酒石酸在食品、医药、化工和轻工业 上都有不可替代的作用，D(-)_酒石酸有着比柠檬酸更强的酸味，因此可以用作食品酸味 剂，也可以用作稳定剂和防腐剂。左旋的光学活性使得D(-)_酒石酸可在制药工业和轻工 业行业中，充当手性拆分剂，目前已有很多这方面的报道。L(+)_酒石酸的生产方法已经研 究的相当透彻，利用生物转化生产L(+)_酒石酸的技术也已经非常成熟，大规模的工业化 生产已成为现实。而关于D (-)-酒石酸生产方法的研究却很少见报道，用化学拆分的方法 拆分消旋的酒石酸可以得到L (+)-酒石酸和D (-)-酒石酸，但此方法操作困难，成本也高。 生物转化不失为一种能源节约，环境友好的方法，目前发现的可以用生物转化的方法生产 D(-)_酒石酸的微生物已有多种。1996年，日本学者Yamagishi等从自然界中分离到一株 可以转化顺式环氧琥珀酸生成D (-)-酒石酸的菌株，对其生理生化特性的鉴定结果显示此 菌为Pseudomonas putida。2000年，日本学者Ikuta等又分离到一株产D (-)-酒石酸的菌 株，经过对其培养特性、生理生化特性、分类学特性进行鉴定和对16SrRNA的分析，认为此 菌是产碱杆菌(Alcaligenes)，Asai等将Alcaligenes sp.内的顺式环氧琥珀酸水解酶用 硫酸铵分级沉淀并以各种层析柱进行纯化，得到了分子量大小为80KDa的纯酶，此酶由分 子量大小分别为40和35Da的两个亚基组成。然而，到目前为止还没有一个有效的用于生 物法转化环氧琥珀酸为D (-)-酒石酸的生产工艺。
发明内容
针对现有技术中存在的上述不足，本发明提供一种生物转化生产D(-)_酒石酸的 工艺，该工艺能使环氧琥珀酸在温和的催化条件下转化成D (-)-酒石酸。本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的首先从能降解环氧琥 珀酸的微生物中提取顺式环氧琥珀酸水解酶，之后对纯化的酶进行固定化，以提高其稳定 性，以便反复使用。然后用固定化后的酶作为催化剂，催化水解环氧琥珀酸生产D(-)_酒石 酸。进一步具体的说本发明的目的是提供一种利用微生物所产生的环氧琥珀酸水解 酶进行D(-)_酒石酸的生产方法。在该方法中首先利用诱导培养的方法对产环氧琥珀酸水 解酶的菌株的环氧琥珀酸水解酶进行诱导，以提高酶的活性；之后对所产生的环氧琥珀酸 水解酶进行纯化，并将纯化后的酶制成固定化酶用于D(-)_酒石酸的生产。其中所用的产酶菌株可以是以现有报道的能降解环氧琥珀酸生产D(-)_酒石酸 的菌株，如前文所述的Alcaligenes和Pseudomonas putida，也可以是以这此野中菌株的 环氧琥珀酸水解酶基因克隆的工程菌。酶的纯化方法可以用现有的蛋白质纯化的方法。如最简单的硫酸铵沉淀，及各种柱层析法及超滤浓缩方法。酶的纯化纯度也可以根据需要进 行调整。纯化方案可以根据所需酶纯度的要求，采用以上提到的一步或几种方案的组合。酶的固定方法在下文的实施方案中以有详细说明。其中各组份的浓度可以根据实 际的需求进行适当的调整。催化D(-)_酒石酸反应的温度可以在5-65度的范围中选择。 其中的最佳反应温度为40-45度。酶催化反应的pH范围为5-10，其中的最佳反应pH为 6. 5-7. 50本发明由于采用了适当纯化后的酶进行固定化，催化剂的比活大大增加，使反应 时间与所需要的设备体积减少，从而可减少生产成本。本发明提供的固定化酶的方法，在该 方法中将具有较强的机械强度的卡拉胶固定法与具有较强的稳定性和轫性的蛋白质(明 胶与酶)共价交联法相结合，使固定化后的酶使用性能更佳，寿命更长，从而降低D (-)-酒 石酸的生产成本。
图1.各纯化过程中顺式环氧琥珀酸水解酶的聚丙烯酰氨凝胶电泳图，其中1 粗 酶液、2 硫酸铵分级沉淀部分、3 :DEAE-Cellul0Se层析部分、4 :Toyopearl HW-65疏水层析 部分、5 分子筛层析部分。
具体实施例方式实施例1、顺式环氧琥珀酸水解酶的提纯用一株产环氧琥珀酸水解酶的菌株(Bordetella sp. Strain 1-3)，在10升的发 酵罐中30°C发酵30h之后，8000rpm离心20min收集菌体，并用50mmol/l的pH 7. 5的磷酸 盐缓冲液洗涤细胞一次。发酵液的配方为酵母膏7.8g/l，顺式环氧琥珀酸9.8g/l，KH2P04 1. 12g/l，K2HP04 3H20 3g/l，MgS04 7H20 0. 625g/l，微量元素溶液 12. 5ml/l，pH 7. 0。之 后，将所得的菌体悬浮于2倍体积的50mmol/l的pH 7. 5的磷酸盐缓冲液中，用高压均质机 对菌体进行破壁，再以8000rpm离心20min去除细胞壁碎片，得到顺式环氧琥珀酸水解酶的 粗提液。粗提液中的顺式环氧琥珀酸水解酶经过硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素离子交换 柱、Toyopearl疏水层析柱和S印hadex G_75分子筛层析柱层析的纯化后，顺式环氧琥珀酸 水解酶的比活力达到50. 3U/mg，提纯倍数为177倍，得率为14. 4%，各步纯化结果见表1。 各步提取的酶样品用PAGE检测，结果见图1。SDS-PAGE及等电聚焦电泳的结果显示凝胶上 只出现一条单一的条带。此结果表明通过以上各步的分离，顺式环氧琥珀酸水解酶已得到 纯化。表1顺式环氧琥珀酸水解酶的纯化结果 2、酶的固定纯化后的顺式环氧琥珀酸水解酶经超滤浓缩到蛋白浓度为0. 左右，取此水解 酶浓缩液10毫升，与10毫升的质量浓度为1. 0%明胶溶液混合后于37°C水浴锅中保温，再 取80毫升质量浓度为2. 5 %的卡拉胶加热熔化后降温至37°C，然后将二者混勻滴入到质量 浓度为2 %的KCl溶液中，边滴边搅拌，颗粒形成后放置两个小时，使其充分硬化。之后将颗 粒以蒸馏水洗净，将其加入于质量浓度为0. 2%的戊二醛水溶液中反应30分钟，使颗粒中 的酶蛋白进行交联，以蒸馏水洗净后即得到了固定化酶。固定化酶整体呈胶体颗粒状，直径 约2. 0mm，乳白色半透明状态。3、D(_)_酒石酸的生物转化在装有玻璃温度计和搅拌装置的500ml的三口瓶中，加入IOOml水，开动搅拌装 置，加入纯碱27g，待其溶解后再逐渐加入顺酐50g，温度控制在40-50°C范围，加入钨酸 钠2. 5g，逐渐滴加质量分数27. 5 %的双氧水约87. 5g，控制温度在55-65°C间，加完后保 温1-1. 5小时，降温到10-20°C，保温搅拌半小时后，抽滤得顺式环氧琥珀酸一钠，烘干后为 72g。在装有玻璃温度计和搅拌装置的500ml三口瓶中，加入300ml水，开动搅拌装置， 加入46. 2g的上一步骤得到的顺式环氧琥珀酸一钠和16g的纯碱，升温到85-90°C，保持1 小时后降至室温，用NaOH调pH至7. 5待用，进入下一步生物转化。取20g直径约2. Omm的固定化酶，将其加入IOOmL的pH7. 5的IM顺式环氧琥珀酸 钠中，于40°C的摇床上进行生物转化，并定时测定溶液中酒石酸的浓度。在4个小时内，转 化率达95%。使用后的固定化酶可很方便的回收。经反复利用十多次后其催化活性没有明显降 低。向转化后的溶液中滴加过量的CaCl2,形成大量的酒石酸钙沉淀后将沉淀用蒸馏 水洗涤，之后加硫酸溶液，使悬浊液的PH达到1. 5，然后将此悬浊液于85°C水浴两个小时使 酒石酸钙充分转化成酒石酸。反应完成后，离心去掉沉淀并将上清用731阴离子交换柱进行分离，即得酒石酸溶液，蒸发除去溶液中的水份后，得到酒石酸的晶体9. 3克。经检测，晶体形状与标准D (-)-酒石酸一致，检测报告见附页。将其与标准酒石酸一起用红外光谱、核 磁共振及旋光度进行分析之后，发现二者的图谱具有高度的相似性，故可以断定，转化产物 为酒石酸。 应理解，以上实施个例仅用于说明本发明，而不是限制本发明的的应用范围。除本 实施例所用的产酶菌株可以是以现有报道的能降解环氧琥珀酸生产D (-)-酒石酸的菌株， 如前文所述的Alcaligenes和Pseudomonas putida，也可以是以这此野中菌株的环氧琥珀 酸水解酶基因克隆的工程菌。酶的纯化方法可以用现有的蛋白质纯化的方法。如最简单的 硫酸铵沉淀，及各种柱层析法及超滤浓缩方法。酶的纯化纯度也可以根据需要进行调整。纯 化方案可以根据所需酶纯度的要求，采用以上提到的一步或几种方案的组合。此外还应理 解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这 些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
一种生物转化生产D(-)-酒石酸的工艺，其特征在于包括如下步骤A、从能降解环氧琥珀酸的微生物中提取顺式环氧琥珀酸水解酶，对顺式环氧琥珀酸水解酶进行纯化；B、对纯化的顺式环氧琥珀酸水解酶进行固定化；C、用固定化的酶作为生物催化剂，催化水解环氧琥珀酸生产D(-)-酒石酸。
2.根据权利要求1所述的生物转化生产D(-)_酒石酸的工艺，其特征在于步骤C的 反应温度为40-45度，反应pH为6. 5-7. 5。
3.根据权利要求1或2所述的生物转化生产D(-)_酒石酸的工艺，其特征在于所述 的微生物是博德特菌(Bordetella sp. Strain 1-3)
4.根据权利要求1或2所述的生物转化生产D(-)_酒石酸的工艺，其特征在于所述 的步骤B的具体过程为步骤A得到的顺式环氧琥珀酸水解酶液经超滤浓缩，与等体积的质量浓度为1. 0%的 明胶溶液混合后于37°C水浴锅中保温，再取有效量的质量浓度为2. 5%的卡拉胶加热熔化 后降温至37°C，然后将二者混勻滴入到质量浓度为2 %的KC1溶液中，边滴边搅拌，颗粒形 成后放置两个小时，以蒸馏水洗净，将其加入于质量浓度为0. 2%的戊二醛水溶液中交联反 应30分钟，以蒸馏水洗净后即得到了固定化酶。
5.根据权利要求4所述的生物转化生产D(-)_酒石酸的工艺，其特征在于所述的顺 式环氧琥珀酸水解酶液经超滤浓缩到蛋白浓度为0. 1%。
全文摘要
本发明提供一种生物转化生产D(-)-酒石酸的工艺，其特征在于包括如下步骤A、从能降解环氧琥珀酸的微生物中提取顺式环氧琥珀酸水解酶，对顺式环氧琥珀酸水解酶进行纯化；B、对纯化的顺式环氧琥珀酸水解酶进行固定化；C、用固定化的酶作为生物催化剂，催化水解环氧琥珀酸生产D(-)-酒石酸。本发明由于采用了适当纯化后的酶进行固定化，催化剂的比活大大增加，使反应时间与所需要的设备体积减少，从而可减少生产成本。本发明提供的固定化酶的方法，在该方法中将具有较强的机械强度的卡拉胶固定法与具有较强的稳定性和轫性的蛋白质(明胶与酶)共价交联法相结合，使固定化后的酶使用性能更佳，寿命更长，从而降低D(-)-酒石酸的生产成本。
文档编号C12R1/01GK101845465SQ20091030806
公开日2010年9月29日 申请日期2009年9月30日 优先权日2009年9月30日
发明者宋苗根 申请人:浙江金伯士药业有限公司