专利名称：氩离子激光诱变木霉hzt06提高葡聚糖酶活力的方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物或酶，具体是一种氩离子激光诱变木霉HZT06提高葡聚糖酶活力的方法。
背景技术：
中国专利文献CN1793356A公开了一种"激光诱变玫瑰孢链霉菌选育达托霉素高产菌株的方法"，它在室温下，取斜面孢子用无菌水制成孢子悬液，将悬液分装于无菌石英槽内，采用He-Ne激光辐照一定时间，然后把经激光辐照处理的孢子悬液经无菌水稀释后，涂布于高氏一号培养基平板中培养，从中获得诱变的遗传性状稳定的纯玫瑰孢链霉菌，选取纯菌株转接于液体发酵培养基中培养后选取遗传性状稳定的高产菌株。上述文献使用的He-Ne激光属于可见光激光器，其波长630nm左右，功率一般不超过lmw，由于自身的特点，所以He-Ne激光处理材料需要的时间较长，短则十几分钟，长则几个小时，诱变处理时间较长，而且效果也不是很理想。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是，縮短诱变时间，确定具体参数，经过激光诱变的木霉HZT06葡聚糖的酶活力有显著提高。 本发明的氩离子激光诱变木霉HZT06提高葡聚糖酶活力的方法，其特征在于按如下步骤 1)活化、复壮；按现有公开技术进行。 例如，挑取斜面保藏木霉HZT06的绿色孢子在空白PDA斜面培养基上划线接菌，置于恒温培养箱中3(TC培养4 7天，待绿色孢子长出后，再进行第二次斜面转接和相同条件培养，最后在超净工作台中，用2ml左右的灭菌生理盐水将孢子洗涤下来，取0. 5ml孢子悬浮液，采用平板涂布法涂布至9cm培养皿中，总共涂布3块，仍然在3(TC培养2 3天。待孢子均匀长满整个平板后，停止培养，将平板上的孢子用3 5ml生理盐水洗涤下来，在超净台中用无菌生理盐水梯度稀释，对EP管中所装的孢子悬液用血球计数板计数，选取孢子数为108数量级的浓度备用。
2)孢子涂片；按现有公开技术进行。 例如，用打孔器在与载玻片大小尺寸接近一致的标签纸上打出直径为0. 6cm的多个多个圆孔，然后贴在干净载玻片上，编号后，置于紫外灯下照射20 30分钟。取第1步中准确计数的孢子液，以孢子悬浮液0. 05m1/孔的剂量均匀涂布到灭菌载玻片的圆孔中，在超净台无菌环境下干燥4 6小时。
3)氩离子激光诱变 预先启动90mw的氩离子激光，待性能稳定后，在距光源80cm处，固定载玻片，使其与光源方向垂直，涂布木霉HZT06孢子的圆孔正面正对光斑，使激光依次照射载玻片上的2 4个孔各30秒；然后即刻在超净台中将每个小孔中经激光诱变后的孢子用O. 1 0. 5ml无菌生理盐水洗涤下来，梯度稀释后，选取稀释至10—4的孢子悬液，取0. 1 0. 2ml涂布平板，每个孔的样品涂布1 2块平板，然后置于3(TC恒温培养箱中培养2 3天，即得到葡聚糖酶活力有提高的木霉HZT06。 本发明采用氩离子激光，它属于紫外激光波长可以在360nm以下，功率可达到90mw以上，紫外光又是生物敏感光源，容易使细胞产生诱变，而且诱变时间非常短，在几秒钟就可以完成，所以诱变实验比较高效。 使用本发明的方法，诱变时间短，木霉HZT06的产孢子能力，新生菌丝抱团能力较强，葡聚糖的酶活力有显著提高。
图1是诱变前后木霉HZT06产孢子能力比较图片；
图2是诱变前后木霉HZT06菌丝体形态比较图片。
具体实施例方式
以下通过实施对本发明进行具体描述，有必要指出的是以下实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述发明的内容做出一些非本质的调整。 —、主要材料 1、产葡聚糖酶木霉HZT06菌株。 二、设备
设备名称生产厂家
VS-840K-U超净台苏州安泰空气技术有限公司
722S可见分光光度计上海棱光技术有限公司
TGL-16G台式高速离心机湖南星科科学仪器有限公司
GZX-9240MBE数显鼓风干燥箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂
ZHWY-2102C恒温摇床培养箱上海智诚分析仪器制造有限公司
HH-2数显恒温水浴锅上海常思工贸有限公司
PGX多段光照培养箱宁波莱福科技有限公司
BCD-215MBE冷藏柜青岛海尔股份有限公司
氩离子激光器美国Coherent I皿ova308C
三、实施例1 1)斜面保藏木霉HZT06的活化、复壮 挑取斜面保藏木霉HZT06的绿色孢子在空白PDA斜面培养基上划线接菌，置于恒温培养箱中3(TC培养5天，待绿色孢子长出后，再进行第二次斜面转接和相同条件培养，最后在超净工作台中，用2ml的灭菌生理盐水将孢子洗涤下来，取0. 5ml孢子悬浮液，采用平板涂布法涂布至9cm培养皿中，总共涂布3块，仍然在3(TC培养3天。待孢子均匀长满整个平板后，停止培养，将平板上的孢子用5ml生理盐水洗涤下来，在超净台中用无菌生理盐水梯度稀释，对EP管中所装的孢子悬液用血球计数板计数，选取孢子数为108数量级的浓度备用。 2)孢子涂片的制备 用打孔器在与载玻片大小尺寸接近一致的标签纸上打出直径为0. 6cm的3个圆
孔，然后贴在干净载玻片上，编号后，置于紫外灯下照射30分钟。取第l步中准确计数的孢
子液，以孢子悬浮液0. 05m1/孔的剂量均匀涂布到灭菌载玻片的圆孔中，在超净台无菌环
境下干燥4小时。 3)氩离子激光诱变 预先启动氩离子激光，待性能稳定后，在距光源80cm处，固定载玻片，使其与光源方向垂直，涂布木霉HZT06孢子的圆孔正面正对光斑。使激光依次照射载玻片上的3个孔各30秒。然后即刻在超净台中将每个小孔中经激光诱变后的孢子用0. 5ml无菌生理盐水洗涤下来，梯度稀释后，选取稀释至10—4的孢子悬液，取0. 2ml涂布平板，每个孔的样品涂布一块平板，然后置于3(TC恒温培养箱中培养3天，即得到葡聚糖酶活力有提高的木霉HZT06。
每块平板上随机选取10个单菌落(仍然是孢子)，待测其在液体发酵培养基中的酶活。 4)葡聚糖酶活的测定 用接菌环，将选定的10株孢子分别接入装有5ml灭菌液体发酵培养基(配制见附1)的大试管中，在恒温平面回转振动摇床中3(TC，180r/min，培养4天。
(1)取5ml发酵液于10ml离心管中，8000rmp，离心15min ; (2)取上清液稀释50倍；取稀释后的上清液0. 5ml加到25ml试管中，设置1个空白样(用水取代发酵液)，3个平行样，置于5(TC恒温水浴锅，预热5min ;
(3)加入1. 5ml已预热的底物(0. 01g/ml P -葡聚糖溶液，精确反应10min后加入2ml 10 %的NaOH溶液终止反应 (4)加入3mlDNS试剂(配制见附2)后立即放入沸水中，水浴7min后，立即冷却，加入8ml蒸馏水； (5)以空白调零，在520nm处进行比色测定(空白先加2ml 10X的NaOH溶液，再加底物)。 附l，液体发酵培养基配方(参考公开发行的文献)葡萄糖3% ;蛋白胨0.5% ;硫酸二氢钾0.2% ;硫酸镁O. 1%，自然pH，12rC，高压灭菌20min。 附2， DNS试剂配制3， 5_ 二硝基水杨酸10g溶于200ml， 2M的NaOH溶液中，再加入30g酒石酸钾钠，5(TC水浴搅拌溶解，贮存在棕色试剂瓶中置于4t:冰箱7天后再使用。
5)酶活单位定义
酶活力(U/ml)=[葡萄糖含量(mg) x反应总体积(ml) x稀释倍数x5. 56] / [反应液中酶液(发酵液)加入量(ml)x反应时间]。
四、诱变效果 1 、诱变后木霉HZT06产孢子能力变化 按以上方法诱变后，木霉HZT06的产孢子能力明显提高，原先经反复复壮后，才能得到产孢子的，诱变后孢子长出时间由原来的4 7天，縮短至2 3天，而且孢子数量较多(见图1)。 2 、诱变后木霉HZT06菌丝体形态变化 在液体发酵培养基中接种诱变后的孢子，新生菌丝抱团能力较强，形成均匀的0. 5cm直径大小的菌丝球，而诱变前的菌丝很难形成球状(见图2)。
3、产葡聚糖酶活性的提高 经诱变后，葡聚糖酶活力由原来的12U/mL，提高至43U/mL，比诱变前提高了258%。
权利要求
一种氩离子激光诱变木霉HZT06提高葡聚糖酶活力的方法，其特征在于按如下步骤1)活化、复壮；2)孢子涂片；3)氩离子激光诱变预先启动90mw的氩离子激光，待性能稳定后，在距光源80cm处，固定载玻片，使其与光源方向垂直，涂布木霉HZT06孢子的圆孔正面正对光斑，使激光依次照射载玻片上的2～4个孔各30秒；然后即刻在超净台中将每个小孔中经激光诱变后的孢子用0.1～0.5ml无菌生理盐水洗涤下来，梯度稀释后，选取稀释至10-4的孢子悬液，取0.1～0.2ml涂布平板，每个孔的样品涂布1～2块平板，然后置于30℃恒温培养箱中培养2～3天，即得到葡聚糖酶活力有提高的木霉HZT06。
全文摘要
本发明涉及一种氩离子激光诱变木霉HZT06提高葡聚糖酶活力的方法。它需要解决的技术问题是，缩短提供一种诱变时间，确定具体参数，氩离子激光诱变木霉HZT06提高葡聚糖酶活力的方法，经过激光诱变的木霉HZT06葡聚糖的酶活力有显著提高。其步骤是1)活化、复壮；2)孢子涂片；3)氩离子激光诱变预先启动90mw的氩离子激光，在距光源80cm处，使激光依次照射载玻片上的2～4个孔各30秒；然后洗涤孢子，梯度稀释后，涂布平板，恒温培养，即得到葡聚糖酶活力有提高的木霉HZT06。
文档编号C12N15/01GK101705223SQ20091030811
公开日2010年5月12日 申请日期2009年10月9日 优先权日2009年10月9日
发明者张拥军, 杨勇, 楼纪东, 洪治 申请人:中国计量学院