专利名称：用于蛋白生产: ca2+ atp酶过表达的改良的载体和酵母菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含一种或多种编码Ca2+ ATP酶、内质网凝集素分子伴侣(例如，钙网蛋白 (CRT)或钙联接蛋白(CRX)和/或ERp57蛋白)的核酸分子的宿主细胞，和它们用于生产具有减少的O-糖基化的重组糖蛋白的应用。(2) 相关领域的描述
糖蛋白介导人和其它哺乳动物中的很多重要功能，包括催化作用、信号传递、细胞一细胞通讯以及分子识别和结合。糖蛋白组成真核生物中的大多数非胞质蛋白(Lis和amron， Eur. J. Biochem. 218: 1-27 (1993))。为治疗目的已经开发了很多糖蛋白，在过去20年中，天然存在的糖蛋白的重组形式已经成为生物技术工业的重要部分。用作治疗剂的重组糖基化蛋白的实例包括促红细胞生成素(EPO)、治疗性单克隆抗体(mAb)、组织纤溶酶原激活物(tPA)、干扰素-β (IFN- β )、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) 5和人绒毛膜促性腺激素(hCH) (Gumming 等人，Glycobiology 1:115-130 (1991))。重组生产的糖蛋白的糖基化模式的变化最近已经成为科学领域的很多关注的话题，作为接近临床的潜在预防剂和治疗剂而生产的重组蛋白。一般而言，糖蛋白的糖基化结构寡糖随用于生产它们的细胞的宿主种类而改变。 在非人宿主细胞中产生的治疗性蛋白可能含有非人糖基化，其可能在人体中引发免疫应
答-例如酵母中的高甘露糖基化(Ballou, Methods Enzymo 1. 185:440-470 (1990))；
植物中的 α (1, 3)-岩藻糖和 β (1,2)-木糖(Cabanes-Macheteau 等人，Glycobiology 9: 365-372 (1999))；中国仓鼠卵巢细胞中的N-羟乙基神经氨酸(Noguchi等人，J. Biochem. 117: 5-62 (1995))和小鼠中的 Gal α-1，3Gal 糖基化(Borrebaeck 等人， Immunol. Today, 14: 477-479 (1993))。因为由非人哺乳动物细胞生产的糖蛋白的寡糖结构倾向于与人糖蛋白的寡糖结构更密切相关，所以大多数商业化的糖蛋白是在哺乳动物细胞中生产。但是，哺乳动物细胞作为蛋白生产的宿主细胞具有一些重要的缺点。除了费用高以外，在哺乳动物细胞中生产蛋白的过程会产生异质性的糖形群体，具有低的体积测定滴度(volumetric titers)，并且需要不断进行的病毒抑制和大量时间来产生稳定的细胞系。直到约2000年，适用于生产具有人样糖基化模式的重组糖蛋白的低等真核生物宿主细胞才成为可能。从那时起， Gerngross在美国专利号7，029，872中公开了制备重组低等真核生物宿主细胞的方法，所述细胞能生产具有人样N-糖基化模式的糖蛋白。因而，现在非常关注使用低等真核生物宿主细胞来生产重组糖蛋白。尽管连接的糖基化的途径已经成为许多分析的主题，但是0-连接的糖基化的过程和功能仍然未被理解。已知，不同于连接的糖基化，糖基化是一个翻译后事件， 其发生在顺式-高尔基体(cis-Golgi)中(Varki, Glycobiol.，3: 97-130 (1993))。尽管0-连接的糖基化的共有受体序列(象N-连接的糖基化的共有受体序列一样)似乎不存在，但是几种糖蛋白的大量O-连接的糖基化位点周围的氨基酸序列的比较证实在位-1位和+3位的脯氨酸残基的频率比糖基化残基增加，且丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸残基显著增加 (Wilson等人，Biochem. J., 275: 529- 534 (1991))。糖蛋白中的丝氨酸和苏氨酸残基段也可能是糖基化的潜在位点。已经证实，酵母-衍生的重组蛋白经常携带与它们的天然对应物相比额外的非天然的聚糖(Van den Steen等人，Crit. Reviews in Biochem. 和Mole. Biol. 33: 151-208，(1998))。这些非天然的聚糖可以产生具有不希望的免疫原性或异常的活性的蛋白。因而，需要开发在具有减少的或没有糖基化的酵母和其它低等真核生物中生产蛋白的方法。Tanner等人在美国专利号5，714，377中描述了酿酒酵母的/W/7和/WU基因以及制备具有减少的0-连接的糖基化的重组蛋白的方法，所述方法使用真菌细胞，所述真菌细胞中的一个或多个/^r基因已经被遗传修饰，从而生产具有减少的连接的糖基化的
重组蛋白。Ng等人在美国公开的专利申请号20020068325中公开了通过使用反义或共抑制或通过酵母宿主菌株的工程化来抑制O-糖基化，所述菌株具有与O-连接的糖基化有关的基因(具体地，一个或多个/ 厂基因)中的功能突变的缺失。Clausen在美国公开的专利申请号20030186850中公开了 GalNAc-β -苄基的用途用于选择性地抑制多肽GalNAc-转移酶的凝集素，且不用作参与聚糖生物合成的其它糖基转移酶的底物，从而抑制O-糖基化。Orchard等人在美国专利号7，105，554中描述了亚苄基噻唑烷二酮和它们作为抗霉菌剂的用途，例如，Bobrowicz等人在W02007061631中证实的抗真菌剂可以以对宿主细胞非致死的方式使用，所述宿主细胞用于生产具有减少的O-连接的糖基化的重组蛋白。Konrad等人在美国公开的专利申请号20020U8235中公开了治疗或预防糖尿病的方法，其通过药理学地抑制组织或细胞中的O-连接的蛋白糖基化来进行。Kojima等人在美国专利号5，沈8，364中公开了用于抑制糖基化的治疗组合物，其中使用诸如苄基-α "N-乙酰基半乳糖胺等化合物，其会抑制O-糖基化的延伸，导致 O- α -GalNAc的积累，以阻断白细胞或肿瘤细胞对SLex或Slea的表达，从而抑制这些细胞与内皮细胞和血小板的粘附。Boime等人在美国专利号6，103，501中公开了激素的变体，其中通过修饰在糖基化位点处的氨基酸序列，改变了 O-连接的糖基化。但是，即使考虑上述生产重组宿主细胞(其生产具有减少的或没有&糖基化的蛋白)的尝试，仍然需要能够生产具有减少的&糖基化的重组蛋白的宿主细胞。
发明内容
发明人已经发现，通过在重组宿主细胞中过表达内源或外源Ca2+ATP酶，可以在重组宿主细胞中实现表达具有减少的&糖基化的重组蛋白。与不过表达Ca2+ ATP酶的相同细胞相比，过表达内源或外源Ca2+ ATP酶的宿主细胞生产具有减少的O-糖基化的重组蛋白。如在实施例中所证实的，包含编码异源或内源Ca2+ATP酶的表达盒的重组宿主低等真核生物宿主细胞能生产重组蛋白，其中&聚糖占据(occupancy)与不过表达内源或外源Ca2+ ATP酶的细胞相比减少了直至4倍。
因而，本发明提供了低等真核宿主细胞，其中编码至少一种内源或外源Ca2+ATP酶的核酸分子被导入宿主细胞中并在其中表达，其中Ca2+ ATP酶的表达是异位的。在具体的方面，Ca2+ATP酶由可操作地连接到异源调节序列上的开放读码框编码，所述异源调节序列可以提供Ca2+ATP酶的组成性的或可调节的表达，且可在宿主细胞中工作。在其它方面，低等真核宿主细胞是酵母或丝状真菌宿主细胞。在还另外的方面，所述宿主细胞是甲基营养酵母，例如巴斯德毕赤酵母O0ZcAia /^1Stori1Sh在具体的方面，所述Ca2+ATP选自巴斯德毕赤酵母/7MV和拟南芥Ura力ii/oAsis thaiiana) WAY。在其它方面，用重组载体进一步转化本发明的低等真核宿主细胞，所述重组载体包含源自低等真核宿主细胞的调节核苷酸序列和编码要由上述宿主细胞生产的选择的哺乳动物蛋白的编码序列。在某些方面，选择的哺乳动物蛋白是治疗蛋白，且可以是糖蛋白， 包括但不限于抗体。在其它实施方案中，所述宿主细胞可以是酵母或丝状真菌宿主细胞，诸如巴斯德毕赤酵母细胞，其中编码至少一种内源或外源Ca2+ ATP酶的载体被导入宿主细胞中并在其中表达，且所述宿主细胞另外表达导入宿主细胞中的核酸分子，所述核酸分子包含源自巴斯德毕赤酵母细胞或在其中有功能的调节核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地连接到编码人治疗糖蛋白(诸如抗体)的开放读码框上。还已经发现，在低等真核生物宿主细胞中过表达钙网蛋白和ERp57蛋白也会实现 &聚糖占据的减少。因而，也提供了低等真核生物宿主细胞，其包含一种或多种编码钙网蛋白和/或ERp57蛋白的核酸分子，其中所述蛋白被异位表达。在其它实施方案中，所述宿主细胞包括编码至少一种内源或外源Ca2+ATP酶的核酸分子，其中Ca2+ATP酶的表达是异位的。一般而言，低等真核生物宿主细胞另外包括编码重组蛋白的核酸分子，在具体的方面， 所述重组蛋白是糖蛋白，在其它方面，所述重组蛋白是抗体或其片段诸如Fc或Fab。在其它实施方案中，将上述宿主细胞中的任一种工程化化，以减少或消除编码蛋白化甘露糖基转移酶mn蛋白的至少一个内源巴斯德毕赤酵母基因的功能，从而提供与具有功能性/^r基因的宿主细胞相比，能生产具有减少的糖基化的重组蛋白的宿主细胞。在其它方面，所述/Wr蛋白选自:ΡΜΤ1.ΡΜΤ4。在其它方面，使所述宿主细胞进一步接触PMT基因表达或PMT蛋白功能的一种或多种抑制剂。在其它实施方案中，减少、删除或破坏编码内源分子伴侣蛋白的基因，并将编码异源分子伴侣蛋白的核酸分子导入所述细胞中。在具体的方面，所述分子伴侣蛋白是PDIl蛋白。在上述宿主细胞的其它方面，所述宿主细胞选自巴斯德毕赤酵母、芬兰毕赤酵母 iPichia finlandica)、喜海藻糖毕赤酵母 QPichia trehalophila )、Pichia 左oc/afflae、膜醭毕赤酵母(/"icAia membranaefaciens)^ Pichia minuta (Ogataea minuta.、 Pichia lindneri), Pichia opuntiae、Pichia thermo tolerans ^ 柳毕赤酵母 QPichia salic taria )、Pichia guercuum,皮杰普氏毕赤酵母{Pichia pijperi )、具柄毕赤酵母 {Pichia stiptisX 甲醇毕赤酵母 O0ZcAia eiAa/ o/ica)、毕赤酵母属的种 G0ZcAia sp.)、 酿酒酵母(Saccharomyces cere visiae )、酵母属的种(Saccharomyces sp.)、裂殖酵母属 ^tJ ft iSchizosacchromyces sp. )> ^Μ## {Schizosacchromyces 办e)、多形汉逊酵母Qbnsenula po^TBor/^a)、克鲁维酵母属的种(Z/wj^erofflj^^s sp.)、乳酸克鲁维酵母(,Kluyveromyces ^aciis)、白色假丝酵母菌 ipmdida albicans), I^JH {Aspergillus nidulans),黑曲毒(Aspergillus niger)、米曲 M ^Aspergillus oryzae),里氏木霉 (Trichoderma reesei), Chrysosporium Iucknowense^ IftifeliiMWft iFusarium sp. 赤 廉抱 iFusarium gramineum )、 廉抱霄 iFusarium venena turn ) ^Physcomi trella pa tens 禾口粗糙链孢霉(Afetfro1^ora crassa).毕赤酵母属的种、酵母属的任意种、多形汉逊酵母、克鲁维酵母属的任意种、曲霉菌属的任意种、里氏木霉、Chiysosporiim Iucknowense、镰孢菌属的任意种和粗糙链孢霉。其它实施方案包括生产与不包含本文公开的遗传修饰的重组糖蛋白相比具有减少的糖基化或&聚糖占据的重组蛋白的方法。重组蛋白包括治疗有关的蛋白和糖蛋白， 包括抗体和其片段。因而，提供了生产重组蛋白的方法，所述方法包括(a)提供低等真核生物宿主细胞，所述细胞包含编码内源或外源Ca2+ ATP酶的核酸分子，其中Ca2+ ATP酶在所述宿主细胞中的表达是异位的；(b)将核酸分子导入编码重组蛋白的宿主细胞中；和(C)在适合生产重组蛋白的条件下，培养所述宿主细胞。另外提供了生产重组蛋白的方法，所述方法包括(a)提供低等真核生物宿主细胞，所述细胞包含编码至少一种CRT或ERp57的核酸分子，其中CRT和/或ERp57在所述宿主细胞中的表达是异位的；(b)将核酸分子导入编码重组蛋白的宿主细胞中；和(c)在适合生产重组蛋白的条件下，培养所述宿主细胞。另外提供了生产重组蛋白的方法，所述方法包括(a)提供低等真核生物宿主细胞，所述细胞包含编码内源或外源Ca2+ ATP酶和至少一种CRT或ERp57的核酸分子，其中Ca2+ ATP酶在所述宿主细胞中的表达是异位的，且其中Ca2+ ATP酶、CRT和/或ERp57在所述宿主细胞中的表达是异位的；(b)将核酸分子导入编码重组蛋白的宿主细胞中；和(c)在适合生产重组蛋白的条件下，培养所述宿主细胞。在其它实施方案中，减少或消除编码蛋白甘露糖基转移酶蛋白的至少一个内源巴斯德毕赤酵母基因的功能，从而提供与具有功能性/ 厂基因的宿主细胞相比， 能生产具有减少的糖基化的重组蛋白的宿主细胞。在其它方面，所述/wr蛋白选自-MTi 和/W7￥。在其它方面，使所述宿主细胞进一步接触/W/基因表达或/W/蛋白功能的一种或多种抑制剂。在其它实施方案中，减少、删除或破坏编码内源分子伴侣蛋白的基因，并将编码异源分子伴侣蛋白的核酸分子导入所述细胞中。在具体的方面，所述分子伴侣蛋白是PDIl蛋白。在另外的方面，本文公开的宿主细胞中的任一种可以在有/W/基因的抑制剂存在下生长。本文的方法特别适用于生产具有治疗价值的蛋白，包括但不限于抗体。因而，提供了本文的任一种宿主细胞用于生产具有治疗价值的蛋白的应用。在具体的方面，提供了本文的任一种宿主细胞用于生产抗体的应用。在上述方法的其它方面，所述宿主细胞选自巴斯德毕赤酵母、芬兰毕赤酵母、喜海藻糖毕赤酵母、PicAia Aochfflae、膜醭毕赤酵母、/7ZcAia mi nut a (Ogataea minuta、 Pichia lindneri) ^ Pichia opuntiae^ Pichia thermo tolerans ^ 柳毕赤酵母、/"icAiaguercuum,皮杰普氏毕赤酵母、具柄毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、毕赤酵母属、酿酒酵母、酵母属、裂殖酵母属的种、裂殖酵母、多形汉逊酵母、克鲁维酵母属的种、乳酸克鲁维酵母、白色假丝酵母菌、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、里氏木霉、Chrysosporium A/chorease、镰孢菌属的种、禾赤镰孢、镰孢霉、patens和粗糙链孢霉。毕赤酵母属的种、 酵母属任意的种、多形汉逊酵母、克鲁维酵母属的任意种、曲霉菌属的任意种、里氏木霉、 Chrysosporium lucknowense,镰孢菌属的任意种和粗糙链孢霉。另外提供了由本文公开的宿主细胞生产的重组蛋白。在具体实施方案中，任一种前述宿主细胞可以另外包括遗传修饰，其能使所述宿主细胞生产糖蛋白，所述糖蛋白优势地具有在其上面的特定聚糖结构或在其上面的聚糖结构的特定混合物。例如，已经遗传地工程化所述宿主细胞，以生产具有 Man3GlcNAc2或Man5GlcNAc2核心结构的聚糖，其在具体方面包括在非还原端上的一个或多个额外的糖(诸如GlcNAc、半乳糖或唾液酸)和任选的在还原端处的GIcNAc上的岩藻糖。因而，聚糖包括双触角和多触角的糖形和二等分的糖形。聚糖的实例包括但不限于Man8GlcNAc2、Man7GlcNAc2, Man6GlcNAc2, Man5GlcNAc2, GlcNAcMan5GlcNAc2, GalGlcNAcMan5GlcNAc2, NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2, Man3GlcNAc2, GlcNAc(1_4)Man3GlcNAc2、 Gal (1_4)GlcNAc(1_4)Man3GlcNAc2、NANA(1_4)Gal (1_4)GlcNAc(1_4)Man3GlcNAc2。定义
除非本文另有定义，本发明相关使用的科学和技术术语具有本领域技术人员通常理解的含义。而且，除非上下文有其它规定，单数形式的术语应当包括复数，而复数形式的术语应当包括单数。通常，与本文记载相关使用的命名，以及本文记载的生物化学、酶学、 分子和细胞生物学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学及杂交技术是本领域中众所周知且普遍使用的。除非另有说明，本发明的方法和技术通常按照本技术领域中众所周知的以及如贯穿本说明书中所引用和讨论的各种一般性的以及更具体的参考文献中所记载的常规方法进行。参见，例如，Sambrook等人Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) ； Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates ((1992,以及 2002 ±曾干Ij )) ; Harlow 禾口 Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1990)； Taylor 禾口 Drickamer， Introduction to Glycobiology, Oxford Univ. Press (2003)； Vorthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol I, CRC Press (1976) ； Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol II, CRC Press (1976) ； Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)。本文所提及的所有出版物、专利和其它参考文献均通过引用整体并入。除非另有说明，下列术语应被理解成具有以下含义
本文使用的术语“N-聚糖”和“糖形”可以互换使用，是指连接的寡糖，例如，通过天冬酰胺-乙酰基葡糖胺键连接到多肽的天冬酰胺残基上的寡糖。连接的糖蛋白含有乙酰基葡糖胺残基，其连接到蛋白中的天冬酰胺残基的酰胺氮上。糖蛋白上占优势的糖是葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、#-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸(例如，乙酰基-神经氨酸(NANA))。在内质网(ER)腔中共翻译地发生糖基团加工，且在高尔基体中继续而成为N-连接的糖蛋白。N-聚糖含有共同的Man3GlcNAc2五糖核心(“Man”是指甘露糖；“Glc”是指葡萄糖；而“NAc”是指N-乙酰基；GIcNAC是指N-乙酰基葡糖胺)。N-聚糖的差别在于包含添加至Man3GlcNAc2 ( “Man/，)核心结构上的外周糖(例如，GlcNAc、半乳糖、岩藻糖和唾液酸)的分支(触角)的数目，所述核心结构也称作“三甘露糖核心”、“五糖核心”或“少甘露糖核心”。N-聚糖可根据其分支的组分进行分类(例如，高甘露糖、复合或杂合)。“高甘露糖”型N-聚糖含有五个或更多个甘露糖残基。“复合”型N-聚糖通常含有至少一个与1，3 甘露糖臂连接的GIcNAc和至少一个与“三甘露糖”核心的1，6甘露糖臂连接的GlcNAc。复合N-聚糖还可含有半乳糖(“(ial”)或N-乙酰基半乳糖胺(“felNAc”)残基，所述残基任选地被唾液酸或衍生物(如“NANA”或“NeuAc”，其中“Neu”是指神经氨酸，而“Ac”是指乙酰基)修饰。复合N-聚糖还可含有包含“二等分的”GlcNAc和核心岩藻糖(“Fuc”)的链内取代。复合N-聚糖还可含有在“三甘露糖核心”上多个触角，其通常被称为“多触角的聚糖”。“杂合” N-聚糖具有在三甘露糖核心的1，3甘露糖臂末端的至少一个GlcNAc，和在三甘露糖核心的1，6甘露糖臂上的零个或多个甘露糖。不同的聚糖也称作“糖形”。本文使用的缩写具有本领域的通用用法，参见例如，上述糖的缩写。其它通用的缩写法包括“PNG酶(PNGase)”，或“聚糖酶”或“葡萄糖苷酶”，它们都表示肽N-糖苷酶F (EC 3. 2. 2. 18) ο本文使用的术语“载体”用来指能转运与之连接的另一个核酸分子的核酸分子。载体的一种类型为“质粒载体”，指另外的DNA片段可以连接进入其中的环状双链DNA环。其他的载体包括粘粒、细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)。载体的另一种类型为病毒载体，其中另外的DNA片段可连接进入该病毒基因组(下文更详细地论述)。某些载体能在它所导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有在宿主细胞中起作用的复制起点的载体)。 其他的载体可在导入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组中，并且由此随着宿主基因组一起复制。此外，某些优选的载体能指导与之可操作连接的基因的表达。所述载体本文称为 “重组表达载体”(或简单地称为“表达载体”)。本文使用的术语“目标序列”或“目标基因”指核酸序列，一般编码通常不在宿主细胞中产生的蛋白。本文公开的方法允许稳定整合入宿主细胞基因组中的一个或多个目标序列或目标基因的有效表达。目标序列的非限制性例子包括编码具有酶活性的一种或多种多肽的序列，例如影响聚糖在宿主中合成的酶，如甘露糖基转移酶、N-乙酰基葡糖胺基转移酶、UDPtV-乙酰基葡糖胺转运蛋白、半乳糖基转移酶、UDPTV-乙酰基半乳糖基转移酶、 唾液酸转移酶、以及岩藻糖基转移酶。术语“标记序列”或“标记基因”是指能够表达允许对宿主细胞内序列的存在或不存在进行阳性或阴性选择的活性的核酸序列。例如，巴斯德毕赤酵母·^基因是一种标记基因，因为可以通过含有该基因的细胞在不存在尿嘧啶的条件下生长的能力而选择其存在。也可以通过含有该基因的细胞不能在5-F0A存在下生长而选择其存在。标记序列或基因不一定需要同时表现阳性和阴性选择性。来自巴斯德毕赤酵母的标记序列或基因的非限制性实例包括^^7、^ 似、#/似和URA3。对于抗生素抗性标记基因，常采用卡那霉素、新霉素、庆大霉素(或G418)、巴龙霉素和潮霉素抗性基因，以便允许在这些抗生素存在下生长。
“可操作地连接”表达控制序列指其中表达控制序列与目标基因相是相邻的以控制目标基因的连接，以及以反式或在一定的距离内作用而控制目标基因的表达控制序列。术语“表达控制序列”或“调节序列”可互换使用，并如本文所用指影响与之可操作连接的编码序列的表达所必需的多核苷酸序列。表达控制序列为控制核酸序列转录、转录后事件以及翻译的序列。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列； 有效的RNA加工信号如剪接和聚腺苷酸化信号；稳定胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(例如，核糖体结合位点)；增强蛋白稳定性的序列；以及当需要时，增强蛋白分泌的序列。 所述控制序列的性质因宿主生物体而不同；原核生物中，所述控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。术语“控制序列”意指包括，至少其存在是用于表达必不可少的所有组分，并且还可以包括其存在是有利的另外的组分，例如前导序列和融合配偶体 (partner)序列。本文使用的术语“重组宿主细胞”(“表达宿主细胞”、“表达宿主系统”、“表达系统” 或简称“宿主细胞”)意指其中已导入重组载体的细胞。应该理解的是所述术语不仅意指特定的主题细胞而且指所述细胞的子代。因为由于突变或者环境影响而造成某些修饰可能在继代中存在，实际上所述子代可能不同于亲本细胞，但仍然包括在本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞可以是分离的细胞或培养基中生长的细胞系，或可以是存在于活组织或生物体中的细胞。术语“真核”是指有核的细胞或生物，包括昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、动物细胞和低等真核细胞。术语“低等真核细胞”包括酵母和丝状真菌。酵母和丝状真菌包括、但不限于巴斯德毕赤酵母、芬兰毕赤酵母、喜海藻糖毕赤酵母、Pidia hchffl^、膜醭毕赤酵母、Pichia minuta (Ogataea minuta,Pichia lindneri) ^Pichia opuntiae^Pichia thermotolerans、 柳毕赤酵母、Pichia guercuum,皮杰普氏毕赤酵母、具柄毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、毕赤酵母属的种、酿酒酵母、酵母属的种、裂殖酵母属的种、裂殖酵母、多形汉逊酵母、克鲁维酵母属的种、乳酸克鲁维酵母、白色假丝酵母菌、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、里氏木霉、 Chrysosporium Iucknowense^ 廉抱菌属的禾中、禾赤 廉抱、 廉抱毒、Physcomi trella pa tens 和粗糙链孢霉、毕赤酵母属的种、酵母属的任意种、多形汉逊酵母、克鲁维酵母属的任意种、 曲霉菌属的任意种、里氏木霉、Chrysosporium lucknowense,镰孢菌属的任意种和粗糙链孢霉。在下述情况下称作编码蛋白的基因的功能被“减弱”所述基因已经被修饰，例如， 通过删除、插入、突变或置换一个或多个核苷酸，使得修饰的基因编码这样的蛋白，其在标准试验中测量时，与没有这种修饰的对应基因编码的蛋白相比，具有低至少20%_50%的活性，在具体的方面，低至少40%的活性或低至少50%的活性。在下述情况下称作编码蛋白的基因的功能被“消除”所述基因已经被修饰，例如，通过删除、插入、突变或置换一个或多个核苷酸，使得修饰的基因编码这样的蛋白，其在标准试验中测量时，与没有这种修饰的对应基因编码的蛋白相比，具有低至少90%-99%的活性，在具体的方面，低至少95%的活性或低至少99%的活性。除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明相关领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。以下描述了示例性的方法和材料，然而与本文描述的那些类似或等效的方法和材料也可以用于实践本发明，且是本领域技术人员显而易见的。本文提及的所有出版物和其它参考文献通过引用整体并入。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。材料、方法和实施例仅是说明性的，无意以任何方式进行限制。
图IA和IB显示了在用于解释本发明的实施例中描述的酵母菌株的系谱。图2解释了编码人PDIl (hPDI)且靶向巴斯德毕赤酵母彻/7基因座的质粒载体 PGLY642的构建。图3解释了编码人EROl α (hEROl α )且靶向巴斯德毕赤酵母/ 资7基因座的质粒载体PGLY2232的构建。图4解释了编码人GRP94且靶向巴斯德毕赤酵母/ 基因座的质粒载体 PGLY2233的构建。图5解释了编码里氏木霉α-1，2甘露糖苷酶(TrMNSl)和小鼠α _1，2甘露糖苷酶IA (FB53)且靶向巴斯德毕赤酵母/ 基因座的质粒载体pGLY1896和pGFI207t的构建。图6解释了编码里氏木霉α-1，2甘露糖苷酶(TrMNSl)且靶向巴斯德毕赤酵母 PRO基因座的质粒载体PGLY1162的构建。图7是编码抗-DKKl抗体重链(GFI710H)和轻链(GFI710L)并靶向巴斯德毕赤酵母TRP2基因座和靶向巴斯德毕赤酵母7 基因座的质粒载体PGLY2260和pGLY2261的图
■；並图8是编码巴斯德毕赤酵母PMV并靶向巴斯德毕赤酵母URA6基因座的质粒载体 PGLY3822的图谱。图9是编码拟南芥ECAl (AtECAl)并靶向巴斯德毕赤酵母URA6基因座的质粒载体PGLY3827的图谱。图10是编码人CRT (hCRT)和人ERp57 (hERp57)并靶向巴斯德毕赤酵母基因座的质粒载体PGLY1234的图谱。
具体实施例方式本发明提供了重组宿主细胞，其与没有如本文所述遗传工程化的宿主细胞相比， 能生产具有减少的&糖基化的重组蛋白。一般而言，提供了包含一种或多种内源或外源 Ca2+ ATP酶的异位表达的一种或多种核酸分子的重组宿主细胞，和所述重组宿主细胞用于生产具有减少的O-糖基化的糖蛋白的用途。我们已经发现，与不过表达内源或外源Ca2+ ATP酶的宿主细胞相比，内源或外源 Ca2+ ATP酶在重组宿主细胞中的过表达，能生产具有减少的O-糖基化的重组蛋白。如在实施例3和4中所证实的，与不表达任一种Ca2+ ATP酶的宿主细胞菌株相比，巴斯德毕赤酵母高尔基体Ca2+ATP酶WMRi)或拟南芥内质网Ca2+ATP酶(AtECAl)的过表达使聚糖占据减少了超过4-倍。因而，包含编码内源或外源高尔基体或内质网Ca2+ATP酶(其中所述 Ca2+ATP酶可操作地连接到异源启动子上)的一种或多种核酸分子的重组宿主细胞，会提供能生产具有减少的糖基化的重组糖蛋白的宿主细胞。这些宿主细胞可以用于生产重组
11蛋白，其中希望减少所述蛋白上的糖基化的量。合适的其它Ca2+ATP酶包括但不限于 人SERCA^蛋白(ATP2A2 ATP酶、Ca++运输蛋白、心肌、慢收缩2)和巴斯德毕赤酵母⑶似蛋白(酿酒酵母SPFl的类似物)。钙网蛋白(CRT)是一种多功能蛋白，其作为内质网腔中的主要CW2+)-结合(储存)蛋白。它也见于细胞核中，表明它可能在转录调节中起作用。钙网蛋白会结合合成肽 KLGFFKR (SEQ ID NO:47)，后者与细胞核受体超家族的DNA结合域中的氨基酸序列几乎相同。钙网蛋白会结合其含有抗-Ro/SSA抗体的全身性红斑狼疮和舍格伦综合征患者的某些血清中的抗体，它在物种之间是高度保守的，且位于内质网和肌质网中，它在这些地方可以结合钙。钙网蛋白会结合错误折叠的蛋白，并防止它们从内质网输出到高尔基体。合适的其它蛋白包括但不限于人UGGT (UDP-葡萄糖糖蛋白葡萄糖基转移酶)蛋白和人ERp27 蛋白。ERp57是内质网的一种分子伴侣蛋白，其与凝集素分子伴侣钙网蛋白和钙联接蛋白相互作用，以调控新合成的糖蛋白的折叠。该蛋白曾经被认为是磷脂酶；但是，已经证实， 该蛋白实际上具有蛋白二硫化异构酶活性。因而，ERp57是内质网(ER)的腔蛋白和蛋白二硫化异构酶(PDI)家族的成员。认为的是凝集素和该蛋白的复合物通过促进它们的糖蛋白底物中的二硫键形成来介导蛋白折叠。不同于原始型蛋白二硫化异构酶，ERp57特异性地与新合成的糖蛋白相互作用。我们另外已经发现，与不表达hCRT和hERp57的菌株相比，人CRT和人ERp57在巴斯德毕赤酵母中的过表达使&聚糖占据减少约1/3。因而，另外提供了重组宿主细胞，其包含编码钙网蛋白和/或ERp57蛋白的一种或多种核酸分子，用于在宿主细胞中异位表达。这些宿主细胞可以用于生产重组蛋白，其中希望减少蛋白上的O-糖基化的量。当所述宿主细胞另外包括编码内源或异源Ca2+ ATP酶的一种或多种核酸分子时，这些宿主细胞具有糖基化的进一步减少。如在实施例4中所证实的，提供过表达内源Ca2+ ATP酶或外源Ca2+ ATP酶、并过表达人钙网蛋白和人ERp57蛋白的重组宿主细胞，会进一步减少由所述宿主细胞生产的重组蛋白的O-糖基化。因而，另外提供了重组宿主细胞，其包含编码内源或异源Ca2+ ATP酶的一种或多种核酸分子和编码钙网蛋白和/或ERp57蛋白的一种或多种核酸分子。这些宿主细胞可以用于生产具有减少的 O-糖基化的糖蛋白。分子伴侣在抗体的折叠和分泌中起关键作用。一种分子伴侣蛋白(具体地，蛋白二硫化异构酶(PDI))的功能是催化连接抗体重链和轻链的链间和链内二硫键形成。与非催化反应相比，蛋白二硫化异构酶(PDI)可以造成含有二硫键的蛋白的回收率大量增加或大量减少；内质网(ER)中高浓度的蛋白二硫化异构酶是含有二硫键的蛋白的表达所必需的 (Puig 和 Gilbert, J. Biol. Chem. 269: 7764-7771 (1994))。如在实施例中所证实的， 其中已经用人PDI分子伴侣基因替换内源PDIl分子伴侣基因的细胞具有减少的糖基化。当这些细胞另外包括内源或外源Ca2+ ATP酶和/或CRT和/或ERp57蛋白的异位过表达时，O-糖基化会进一步减少(参见实施例3和4)。因而，另外包括异位表达CA2+ ATP酶和/或CRT和/或ERp57蛋白的宿主细胞，且其中编码内源分子伴侣蛋白的一个或多个基因已经被删除或破坏，且编码异源分子伴侣蛋白的核酸分子已经被导入，用于分子伴侣蛋白的异位表达。其它实施方案包括这样的上述细胞，其中在所述细胞中也表达额外的异源共分子伴侣蛋白，诸如ER0-1 α和/或GRP94蛋白。诸如酿酒酵母、白色假丝酵母和巴斯德毕赤酵母等低等真核细胞含有称作蛋白甘露糖基转移酶mn的基因家族，所述甘露糖基转移酶参与甘露糖向分泌蛋白的
丝氨酰基和苏氨酰基残基的转移。我们发现，已经遗传地改变成表达一个或多个人源化的或嵌合的分子伴侣基因的巴斯德毕赤酵母细胞系，能更好地耐受一个或多个/^r基因的删除，对细胞生长或蛋白表达几乎没有影响或无影响。可以删除的/ ^基因包括/W77、/W7^、 ΡΜΤ4、ΡΜΤ5.ΡΜΤ6。一般而言，其中删除了 OCHl基因和/W/基因的巴斯德毕赤酵母宿主细胞要么生长较差，要么根本不生长。OCHl基因的删除或功能敲除是构建可以生产具有人样聚糖的人糖蛋白的重组巴斯德毕赤酵母宿主细胞所必需的。因为希望生产不具有或具有减少的O-糖基化的人糖蛋白，已经需要发现减少重组巴斯德毕赤酵母宿主细胞中的O-糖基化的方法，其也能生产具有人样聚糖的人糖蛋白。因而，在其它实施方案中，提供了宿主细胞，其另外包括一个或多个/^r基因的删除或破坏。在其它方面，过表达的基因产物是分泌的基因产物。技术人员可容易地得到观察过表达的基因产物是否分泌的方法。例如，Goeddel，(编)1990，Gene Expression Technology, Methods in Enzymology, Vol 185, Academic Press禾口 Sambrook等人 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第 1-3 卷，Cold Spring Harbor Press, N. Y.，提供了检测分泌的基因产物的方法。为了分泌过表达的基因产物，在足以分泌过表达的基因产物的条件下，培养宿主细胞。这样的条件包括允许细胞分泌的温度、营养和细胞密度条件。此外，这样的条件是细胞可以执行基础细胞功能(转录、翻译和蛋白在细胞区室之间传递)的条件，且是技术人员已知的。此外，如技术人员已知的，在用于维持或培养本发明的宿主细胞的培养基中，可以检测分泌的基因产物。通过已知的方法，例如，离心或过滤，可以使培养基与宿主细胞分离。 然后可以利用过表达的基因产物特有的已知性质，检测无细胞的培养基中的过表达的基因产物。这样的性质可以包括过表达的基因产物的独特的免疫学、酶学或物理性质。例如，如果过表达的基因产物具有独特的酶活性，可以在宿主细胞使用的培养基上进行该活性的测定。此外，当可以得到可与给定的过表达的基因产物反应的抗体时，这样的抗体可以用于在任意已知的免疫学试验中检测基因产物(参见Harlowe等人，1988，Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press)。另外，分泌的基因产物可以是融合蛋白，其中基因产物包括促进基因产物的分泌的异源信号或先导肽。分泌信号肽是分离的氨基酸序列，其造成宿主细胞指导基因产物穿过内细胞膜和外细胞膜，并进入胞外环境。分泌信号肽存在于要分泌的新生多肽基因产物的末端。沿着基因产物的多肽链也可以存在其它的真核分泌信号，其是连接到特定氨基酸上的碳水化合物的形式，即糖基化分泌信号。末端信号肽包括约10至约30个氨基酸的疏水结构域，其前面可以有约2至约10个氨基酸的带电荷的短结构域。此外，信号肽存在于要分泌的基因产物的末端。 一般而言，信号序列的具体序列不是关键性的，但是信号序列富含疏水氨基酸，诸如丙氨酸 (Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(He)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、蛋氨酸(Met)等。许多信号肽是已知的(Michaelis等人，Ann. Rev. Microbiol. 36: 425 (198 。例如，酵母酸性磷酸酶、酵母转化酶和酵母α-因子信号肽已经被连接到异源多肽编码区上，并成功地用于异源多肽的分泌(参见例如，&ito等人Gene 83: 355-365 (1989) ； Chang等人 Mol. Cell. Biol. 6: 1812-1819 (1986)；和Brake等人 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4642-4646 (1984)。因此，技术人员可以容易地设计或得到这样的核酸分子，其编码过表达的基因产物的编码区，所述基因产物也具有在5’-端的信号肽。优选地通过本方法分泌的过表达的基因产物的实例包括哺乳动物基因产物，诸如酶、细胞因子、生长因子、激素、疫苗、抗体等。更具体地，过表达的基因产物包括但不限于 基因产物诸如促红细胞生成素、胰岛素、垂体生长激素、生长激素释放因子、血小板衍生的生长因子、表皮生长因子、转化生长因子α.、转化生长因子β、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子II、凝固因子VIII、超氧化物歧化酶、α-干扰素、Y -干扰素、白介素-1、白介素-2、白介素-3、白介素-4、白介素-5、白介素_6、粒细胞集落刺激因子、多谱系集落刺激活性、粒细胞-巨噬细胞刺激因子、 巨噬细胞集落刺激因子、T细胞生长因子、淋巴毒素、免疫球蛋白、抗体等。另外包括融合蛋白，包括但不限于与免疫球蛋白或抗体的恒定区融合的肽和多肽。特别有用的过表达的基因产物是人基因产物。术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括通过重组DNA技术生产的任意重组单克隆抗体， 且进一步意在包括人源化的和嵌合的抗体。本方法可以容易地适用于增强任意过表达的基因产物的分泌，所述基因产物可以用作疫苗。可以用作疫苗的过表达的基因产物包括哺乳动物病原体的任意结构性的、 膜-连接的、膜-结合的或分泌的基因产物。哺乳动物病原体包括可以感染或攻击哺乳动物的病毒、细菌、单细胞或多细胞的寄生虫。例如，病毒疫苗可以包括针对下述病毒的疫苗诸如人免疫缺陷病毒(HIV)、立氏立克次体、牛痘、志贺菌属、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、登革热病毒、日本乙型脑炎病毒、水痘带状疱疹病毒、 巨细胞病毒、甲型肝炎病毒、轮状病毒，以及针对下述病毒病的疫苗如莱姆病、麻疹、黄热、 腮腺炎、狂犬病、疱疹、流感、副流感等。细菌疫苗可以包括针对下述细菌的疫苗诸如霍乱弧菌、伤寒沙门菌、百日咳杆菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、破伤风梭菌、白喉棒状杆菌、麻风分枝杆菌、淋病奈瑟球菌、脑膜炎奈瑟球菌、粗球孢子菌等。一般而言，重组地表达本发明的过表达的蛋白(例如，Ca2+ ATP酶、ERp57、钙网蛋白)和重组蛋白，也就是说，通过把编码过表达的蛋白或重组蛋白的核酸分子放入表达盒中。这样的表达盒最少含有调节序列，当所述序列可操作地连接到编码蛋白的核酸分子上时，其影响蛋白的表达。然后将所述表达盒插入载体中，诸如也含有额外元件的质粒，所述额外元件如复制起点、选择标记、转录或终止信号、着丝粒、自主复制序列等，以提供表达载体。表达载体可以是可复制的或不可复制的表达载体。可复制的表达载体可以独立于宿主细胞染色体DNA而复制，或因为这样的载体已经整合进宿主细胞染色体DNA。整合表达载体包含靶向序列，其将表达载体靶向宿主细胞基因组中的特定位置，然后所述载体在这里整合。在整合进宿主细胞染色体DNA后，这样的表达载体可以丧失一些结构元件，但是保留编码过表达的或重组的蛋白的核酸分子和可以影响过表达的或重组的蛋白的表达的区段。因此，本文的表达载体可以是整合染色体的或不整合染色体的表达载体。在另一个实施方案中，通过将整合或不整合表达载体导入宿主细胞中，在宿主细胞中过表达一种或多种过表达的或重组的蛋白。在导入编码至少一种过表达的或重组的蛋白的至少一种表达载体后，然后通过诱导编码基因产物的内源基因的表达，或通过将编码基因产物的表达载体导入宿主细胞，过表达基因产物。在另一个实施方案中，建立组成地或诱导地表达至少一种异源分子伴侣蛋白的细胞系。将编码要过表达的基因产物的表达载体导入这样的细胞系，以实现增加的过表达的基因产物的分泌。本发明的表达载体可以是在一个宿主细胞类型(例如，大肠杆菌)中可复制的，且在另一个宿主细胞类型(例如，真核宿主细胞)中经历极少的复制或无复制，只要表达载体允许过表达的或重组的蛋白的表达，由此促进这样的基因产物在选择的宿主细胞类型中的分泌。本文所述的表达载体包括已经为目标基因(也就是说，编码过表达的或重组的蛋白的基因)的受控表达而工程化的DNA或RNA分子。这样的载体也编码核酸分子区段，其可操作地连接到编码过表达的或重组的蛋白的核酸分子上。“可操作地连接”在该上下文中是指，这样的区段可以影响编码过表达的或重组的蛋白的核酸分子的表达。这些核酸序列包括启动子、增强子、上游控制元件、转录因子或抑制物结合位点、终止信号和可以控制在预见到的宿主细胞中的基因表达的其它元件。优选地，所述载体是载体、噬菌体、粘粒或病毒。
本发明的表达载体在酵母或哺乳动物细胞中起作用。酵母载体可以包括酵母2 μ 环及其衍生物、编码酵母自主复制序列的酵母载体、酵母微型染色体、任意的酵母整合载体等。在Parent等人(Yeast 1: 83-138 (1985))中，提供了酵母载体的许多类型的综合列表。能影响基因产物的表达的元件或核酸调节序列包括启动子、增强子元件、上游活化序列、转录终止信号和多腺苷酸化位点。预见到所有这样的启动子和转录调节元件(单独地或组合地)用于本发明的表达载体。此外，本文也预见到遗传地工程化的和突变的调节序列。启动子是用于控制基因表达的DNA序列元件。具体地，启动子指定转录起始位点， 且可以包括TATA框和上游启动子元件。选择的启动子是预期在选择的特定宿主系统中可操作的那些。例如，当使用诸如酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母或巴斯德毕赤酵母等酵母宿主细胞时，在本发明的表达载体中使用酵母启动子，而真菌启动子则用于诸如黑曲霉、粗糙链孢霉或里氏木霉等宿主细胞。酵母启动子的实例包括但不限于GAPDH、A0X1、GAL1、PGK、GAP、 TPI、CYCl、ADH2、PH05、CUPl、MFa 1、PMA1、PDI、TEF 和 GUTl 启动子。Romanos 等人(Yeast 8: 423-488 (1992))提供了酵母启动子和表达载体的综述。可操作地连接到本文公开的核酸分子上的启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。诱导型启动子是在结合转录因子后以增加的或降低的速率指导转录的启动子。本文使用的转录因子包括可以结合启动子的调节区或控制区并由此影响转录的任意因子。通过将宿主暴露于诱导物，或从宿主细胞培养基去除诱导物，可以控制宿主细胞中转录因子的合成或启动子结合能力。因此，为了调节诱导型启动子的表达，将诱导物加入宿主细胞的生长培养基中，或从中去除诱导物。这样的诱导物可以包括糖类、磷酸盐、醇、金属离子、激素、热、冷等。例如，在酵母中常用的诱导物是葡萄糖、半乳糖等。可以选择的转录终止序列是在选择的特定宿主细胞可操作的那些。例如，当使用诸如酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母或巴斯德毕赤酵母等酵母宿主细胞时，在本发明的表达载体中使用酵母转录终止序列，而真菌转录终止序列则用于诸如黑曲霉、粗糙链孢霉、或里氏木霉等宿主细胞。转录终止序列包括但不限于酿酒酵母CTC转录终止序列GcCYC TT)、 巴斯德毕赤酵母也似转录终止序列(ALG3 TT)和巴斯德毕赤酵母·7转录终止序列 (PpPMAl TT)。本发明的表达载体也可以编码选择标记。选择标记是赋予宿主细胞可辨认的特性的遗传功能，使得用携带所述选择标记的载体转化的细胞可以与未转化的细胞区分开。 在载体中包含选择标记，也可以用于确保与所述标记关联的遗传功能在宿主细胞群体中保留。这样的选择标记可以赋予任意容易鉴别的显性特性，例如抗药性、合成或代谢细胞营养素的能力等。酵母选择标记包括抗药性标记和允许酵母宿主细胞合成必需的细胞营养素(例如氨基酸)的遗传功能。在酵母中常用的抗药性标记包括氯霉素、卡那霉素、甲氨蝶呤、G418 (遗传霉素)、^ocin等。允许酵母宿主细胞合成必需的细胞营养素的遗传功能与可得到的具有在对应的基因组功能中的营养缺陷型突变的酵母菌株一起使用。常见的酵母选择标记会提供合成亮氨酸HEU2)、色氨酸、TRP1和TRP2、、脯氨酸(PROl)、尿嘧啶(JURA3、URA5、 URA6)、组氨酸imS3)、赖氨酸HYS2)、腺嘌呤iADEl iADE2)等的遗传功能。其它酵母选择标记包括来自酿酒酵母的以基因，其赋予在有亚砷酸盐存在下生长的酵母细胞亚砷酸盐抗性(Bobrowicz 等人，Yeast, 13:819-828 (1997) ； Wysocki 等人，J. Biol. Chem. 272:30061-30066 (1997))。许多合适的整合位点包括在美国公开申请号2007/0072262中列举的那些，且包括已知的酿酒酵母和其它酵母或真菌的基因座的同源基因。使载体整合进酵母中的方法是众所周知的，例如，参见美国专利号7，479，389、W02007136865和PCT/ US2008/13719。插入位点的实例包括、但不限于毕赤酵母^^基因；毕赤酵母7 ° (包括 TRPl至TRP2)基因；毕赤酵母#以基因；毕赤酵母67#基因；毕赤酵母/ °基因；毕赤酵母 / 基因；和毕赤酵母Z^Z/基因。毕赤酵母和^？似基因已经描述在Lin Cereghino等人，Gene 263:159-169 Q001)和美国专利号4，818，700中，和基因已经描述在 Cosano 等人，Yeast 14:861-867 (1998)中，力7似已经描述在 GenBank 登记号 X56180 中。因此，本发明的表达载体可以编码选择标记，其可以用于在存在于培养物中的细胞群体中鉴别和维持含有载体的宿主细胞。在某些情况下，选择标记也可以用于放大表达载体的拷贝数。诱导本发明的表达载体的转录后，为了生产编码过表达的或重组的蛋白的 RNA，所述RNA被细胞因子翻译，以产生过表达的或重组的蛋白。在酵母和其它真核生物中，如下启动信使RNA (mRNA)的翻译核糖体结合mRNA的 5’帽，且核糖体与mRNA—起迁移至第一个AUG起始密码子，在这里可以开始多肽合成。在酵母和哺乳动物细胞中的表达通常不要求核糖体结合位点和起始密码子之间特定数目的核苷酸，有时在原核表达系统中有此要求。但是，对于在酵母或哺乳动物宿主细胞中的表达，mRNA中的第一个AUG密码子优选地是希望的翻译起始密码子。此外，当在酵母宿主细胞中表达时，长非翻译前导序列(例如超过50-100个核苷
16酸)的存在可以减少mRNA的翻译。酵母mRNA先导序列具有约50个核苷酸的平均长度，富含腺嘌呤，几乎不具有二级结构，且几乎总是使用第一个AUG来开始。由于不具有这些特征的先导序列可以降低蛋白翻译的效率，优选地将酵母先导序列用于过表达的基因产物或分子伴侣蛋白在酵母宿主细胞中的表达。许多酵母先导序列的序列是已知的，且可被技术人员得到，例如，通过参考Cigan等人(Gene 59: 1-18 (1987))。除了启动子、核糖体结合位点和起始密码子的位置以外，可以影响得到的表达水平的因素包括可复制的表达载体的拷贝数。载体的拷贝数通常由载体的复制起点和与其结合的任意顺式作用控制元件决定。例如，通过诱导与着丝粒紧密靠近的启动子的转录，可以增加编码受调节的着丝粒的酵母附加型载体的拷贝数。此外，在酵母载体中编码酵母FLP 功能，也可以增加载体的拷贝数。本领域技术人员也可以如下容易地设计和制作包括上述序列的表达载体通过组合来自可得到的载体的DNA片段，通过合成编码这样的调节元件的核酸分子，或通过克隆新的调节元件并将其放入本发明的载体中。制作表达载体的方法是众所周知的。在关于基因工程的众多标准实验室手册中的任一个中，可以找到过表达的DNA方法。通过以适当朝向将过表达的或重组的蛋白编码区连接到启动子和用于控制基因表达的其它序列元件上，可以制作本发明的表达载体。构建本发明的表达载体后，将这样的载体转化进宿主细胞，在其中可以表达过表达的基因产物和过表达的或重组的蛋白。用表达载体转化酵母和其它低等真核细胞的方法是众所周知的，且可被技术人员容易地得到。 例如，通过几种操作中的任一种(包括醋酸锂、原生质球、电穿孔和类似的操作)，可以将表达载体转化进酵母细胞。可以与酵母可复制的表达载体一起使用的酵母宿主细胞包括能分泌的酵母的任意野生型或突变株。这样的菌株可以源自酿酒酵母、多形汉逊酵母、乳酸克鲁维酵母、 巴斯德毕赤酵母、粟酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母、和有关的酵母物种。一般而言，有用的酵母突变株包括这样的菌株，其具有可以与编码选择标记的酵母载体组合使用的遗传缺陷。许多酵母菌株类型可从酵母品种中心(Yeast Genetics Stock Center) (Donner Laboratory, University of California, Berkeley, Calif. 94720)、美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection) (12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852, 在下文中称作ATCC)、国家酵母培养物保藏中心(National Collection of Yeast Cultures) (Food Research Institute, Colney Lane, Norwich NR4 7UA, UK)禾口 Centraalbureau voor Schimmelcultures (Yeast Division, Julianalaan 67a, 2628 BC Delft, Netherlands)得到。一般而言，诸如酵母等低等真核生物可用于表达糖蛋白，因为它们可以低成本地培养、提供高产率，且在适当修饰时，能实现合适的糖基化。酵母特别地提供确定的遗传学， 允许快速转化、测试蛋白定位策略和容易的基因敲除技术。合适的载体具有表达控制序列， 诸如启动子，包括3-磷酸甘油酸酯激酶或其它糖酵解酶以及复制起点、终止序列等(根据
需要)。不同的酵母(诸如乳酸克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母截多形汉逊酵母)可用于细胞培养，因为它们能生长至高细胞密度，并分泌大量重组蛋白。同样地，丝状真菌(诸如黑曲霉、镰孢菌属、粗糙链孢霉和其它真菌)可以用于在工业规模生产本发明的糖蛋白。可以遗传地修饰低等真核生物、尤其是酵母，使它们表达糖蛋白，其中糖基化模式是人样的或人源化的。这可以通过消除选择的内源糖基化酶和/或抑制外源酶来实现，如 Gerngross等人，US 20040018590所述。例如，可以选择宿主细胞，或工程化成被消除了 1，6-甘露糖基转移酶活性，所述酶否则会将甘露糖残基添加到糖蛋白的聚糖上。在一个实施方案中，所述宿主细胞另外包括与细胞靶向信号肽融合的α 1，2_甘露糖苷酶催化结构域，所述信号肽通常不结合催化结构域，并选择它来将α 1，2-甘露糖苷酶活性靶向宿主细胞的内质网或高尔基体。重组糖蛋白穿过宿主细胞的内质网或高尔基体，会产生包含Man5GlcNAc2糖形的重组糖蛋白，例如，优势地包含Man5GlcNAc2糖形的重组糖蛋白组合物。例如，美国专利号7，029，872和美国公开的专利申请号2004/0018590和 2005/0170452公开了能生产包含Man5GlcNAc2糖形的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。在另一个实施方案中，前面刚描述的宿主细胞另外包括与细胞靶向信号肽融合的GIcNAC转移酶I (&ιΤ I)催化结构域，所述信号肽通常不结合催化结构域，并选择它来将GIcNAC转移酶I活性靶向宿主细胞的内质网或高尔基体。重组糖蛋白穿过宿主细胞的内质网或高尔基体，会产生包含GlcNAcMan5GlcNAc2糖形的重组糖蛋白，例如，优势地包含 GlcNAcMan5GlcNAc2糖形的重组糖蛋白组合物。例如，美国专利号7，029，872和美国公开的专利申请号2004/0018590和2005/0170452公开了能生产包含GlcNAcMan5GlcNAc2糖形的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。可以在体外用己糖胺酶(hexaminidase)处理在上述细胞中生产的糖蛋白，以生产包含Man5GlcNAc2糖形的重组糖蛋白。在另一个实施方案中，前面刚描述的宿主细胞另外包括与细胞靶向信号肽融合的甘露糖苷酶II催化结构域，所述信号肽通常不结合催化结构域，并选择它来将甘露糖苷酶II活性靶向宿主细胞的内质网或高尔基体。重组糖蛋白穿过宿主细胞的内质网或高尔基体，会产生包含Gl CNACMan3Gl CNAC2糖形的重组糖蛋白，例如，优势地包含GlcNAcMan3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白组合物。例如，美国专利号7，0 ，872和美国公开的专利申请号2004/0230042公开了表达甘露糖苷酶II酶且能生产优势地具有 GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。可以在体外用己糖胺酶 (hexaminidase)处理在上述细胞中生产的糖蛋白，以生产包含Man3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白。在另一个实施方案中，前面刚描述的宿主细胞另外包括与细胞靶向信号肽融合的 GIcNAc转移酶II (GnT II)催化结构域，所述信号肽通常不结合催化结构域，并选择它来将GIcNAC转移酶II活性靶向宿主细胞的内质网或高尔基体。重组糖蛋白穿过宿主细胞的内质网或高尔基体，会产生包含GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白，例如，优势地包含 GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白组合物。美国专利号7，0 ，872和美国公开的专利申请号2004/0018590和2005/0170452公开了能生产包含GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。可以在体外用己糖胺酶(hexaminidase)处理在上述细胞中生产的糖蛋白，以生产包含Man3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白。在另一个实施方案中，前面刚描述的宿主细胞另外包括与细胞靶向信号肽融合的半乳糖基转移酶催化结构域，所述信号肽通常不结合催化结构域，并选择它来将半乳糖基转移酶活性靶向宿主细胞的内质网或高尔基体。重组糖蛋白穿过宿主细胞的内质网或高尔基体，会产生包含GalGlcNAc2Man3GlcNAc2或Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形或其混合物的重组糖蛋白，例如，优势地包含feilGlcNAc2Man3GlcNAc2糖形或Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 糖形或其混合物的重组糖蛋白组合物。美国专利号7,0 ，872和美国公开的专利申请号2006/0040353公开了能生产包含^il2GIcNAc2Man3GIcNAc2糖形的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。可以在体外用半乳糖苷酶处理在上述细胞中生产的糖蛋白，以生产包含 GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白，例如优势地包含GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白组合物。在另一个实施方案中，前面刚描述的宿主细胞另外包括与细胞靶向信号肽融合的唾液酸转移酶催化结构域，所述信号肽通常不结合催化结构域，并选择它来将唾液酸转移酶活性靶向宿主细胞的内质网或高尔基体。重组糖蛋白穿过宿主细胞的内质网或高尔基体，会产生优势地包含 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 糖形或 NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 糖形或其混合物的重组糖蛋白。对于低等真核生物宿主细胞(诸如酵母和丝状真菌)，宿主细胞另外包括提供用于转移到聚糖上的CMP-唾液酸的工具，也是有用的。美国公开的专利申请号2005/(^607 公开了将低等真核生物遗传地工程化成具有CMP-唾液酸合成途径的方法，美国公开的专利申请号2006/(^86637公开了将低等真核生物遗传地工程化成生产唾液酸化的糖蛋白的方法。可以在体外用神经氨酸酶处理在上述细胞中生产的糖蛋白，以生产优势地包含Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形或feilGlcNAc2Man3GlcNAc2糖形或其混合物的重组糖蛋白。任一种前述宿主细胞可以另外包括一种或多种选自GnT III.GnT IV、GnT V、GnT VI和GnT IX的GIcNAC转移酶，以生产具有二等分的(GnT III)和/或多触角的(GnT IV、V、VI和IX) 聚糖结构的糖蛋白，诸如在美国公开的专利申请号2004/074458和 2007/0037248中公开的那些。在其它实施方案中，生产优势地具有GlcNAcMan5GlcNAc2 N-聚糖的糖蛋白的宿主细胞另外包括与细胞靶向信号肽融合的半乳糖基转移酶催化结构域，所述信号肽通常不结合催化结构域，并选择它来将半乳糖基转移酶活性靶向宿主细胞的内质网或高尔基体。重组糖蛋白穿过宿主细胞的内质网或高尔基体，会产生优势地包含fedGlCNACMan5GlcNAc2糖形的重组糖蛋白。在另一个实施方案中，前面刚描述的生产优势地具有fedGlCNAcMan5GlcNAc2 聚糖的糖蛋白的宿主细胞另外包括与细胞靶向信号肽融合的唾液酸转移酶催化结
构域，所述信号肽通常不结合催化结构域，并选择它来将唾液酸转移酶活性靶向宿主细胞的内质网或高尔基体。重组糖蛋白穿过宿主细胞的内质网或高尔基体，会产生包含 NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2 糖形的重组糖蛋白。不同的前述宿主细胞另外包括一种或多种糖转运蛋白，诸如UDP-GlcNAc转运蛋白 (例如，乳酸克鲁维酵母和小家鼠UDP-GlcNAc转运蛋白)、UDP-半乳糖转运蛋白(例如，黑腹果蝇UDP-半乳糖转运蛋白)和CMP-唾液酸运载体(例如，人唾液酸转运蛋白)。因为低等真核生物宿主细胞(诸如酵母和丝状真菌)缺少上述转运蛋白，优选地，将低等真核生物宿主细胞(诸如酵母和丝状真菌)遗传地工程化成包括上述转运蛋白。在上述宿主细胞的其它实施方案中，将宿主细胞进一步遗传地工程化，通过删除或破坏β-甘露糖基转移酶基因该#7^)，消除具有α-甘露糖苷酶-抗性的聚糖的糖蛋白(参见，美国公开的专利申请号2006/0211085)，并通过删除或破坏磷酸甘露糖基转移酶基因和？之一或二者，消除具有磷酸甘露糖残基的糖蛋白(参见例如，美国专利号7，198，921和7，259，007)。在上述宿主细胞的其它实施方案中，进一步遗传地修饰宿主细胞，如下消除糖蛋白的O-糖基化通过删除或破坏蛋白&甘露糖基转移酶(Dol-P-Man: 蛋白(Ser/Thr)甘露糖基转移酶基因)(PMT)之一或二者(参见美国专利号5，714，377)， 或在诸如Riit-1、Pmti-2和Rnti-3等i抑制剂存在下培养(如在公开的国际申请号WO 2007061631中所公开的)，或二者。因而，提供了已经遗传地修饰成生产糖蛋白的宿主细胞，其中在所述糖蛋白上的优势聚糖包括但不限于=Man8GlcNAc2、Man7GlcNAc2, Man6GlcNAc2, Man5GlcNAc2, GlcNAcMan5GlcNAc2, GalGlcNAcMan5GlcNAc2, NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2、Man3GlcNAc2, GlcNAc(1_4)Man3GlcNAc2、Gal (1_4)GlcNAc(1_4)Man3GlcNAc2、NANA(1_4)Gal (1_4)GlcNAc(1_4) Man3GlcNAc2。另外包括生产糖蛋白的宿主细胞，所述糖蛋白在其上面具有前述聚糖的特定混合物。在下面的实施例中，在巴斯德毕赤酵母物种的宿主细胞中表达异源人蛋白。在本发明的具体实施方案方面，这些实施例证实了本发明，它们不应以任何方式解释为限制性的。技术人员在阅读本文的公开内容和实施例以后会认识到，对所述方法和材料的许多变化、修改和改进是可能的，且不偏离本发明的实践。实施例1
本实施例显示了生产具有Man5GlcNAc2 聚糖的重组蛋白的重组巴斯德毕赤酵母的构建。如下构建表达/整合质粒载体PGLY642，其包含编码人PDI蛋白的表达盒和将质粒载体靶向巴斯德毕赤酵母彻/7基因座的核酸分子，用编码人PDI的核酸分子替换编码巴斯德毕赤酵母彻/7的基因，如图2所示。使用引物hPDI/UPl: 5' AGCGCTGACGCCCCCGAGGAGGAG GACCAC 3' (SEQ ID NO: 1)禾口 hPDI/LP-PacI 5' CCTTAATTAATTA CAGTTCATCATGCACAGCTTTCTGATCAT 3' (SEQ ID NO: 2),Pfu turbo DNA 聚合醇(Stratagene, La Jolla, CA)、禾口人月干 cDNA (BD Bioscience, San Jose, CA)，通过 PCR扩增编码人PDIl的cDNA。PCR条件是95°C 2分钟的1个循环，95°C 20秒、58°C 30 秒和72°C 1.5分钟的25个循环，继之以72°C 10分钟的1个循环。将得到的PCR产物克隆进质粒载体PCR2. 1，以制备质粒载体pGLY618。人PDIl的核苷酸和氨基酸序列(分别是 SEQ ID N0:19和20)如表9所示。巴斯德毕赤酵母PDIl的核苷酸和氨基酸序列(分别是SEQ ID N0:21和22)如表9所示。通过PCR扩增来自巴斯德毕赤酵母基因组DNA的区域，分离包含巴斯德毕赤酵母PDIl 5'和 3'区域的核酸分子。使用引物 PBM8: 5' ATGAA TTCAG GCCAT ATCGG CCATT GTTTA CTGTG CGCCC ACAGT AG 3' (SEQ ID N0: 3) ； PB249: 5' ATGTT TMAC GTGAG GATTA CTGGT GATGA AAGAC 3，(SEQ ID N0: 4)，扩增 5，区域。使用引物PB250: 5，AGACT AGTCT ATTTG GAGAC ATTGA CGGAT CCAC 3' (SEQ ID N0: 5)； PB251: 5' ATCTC GAGAG GCCAT GCAGG CCAAC CACAA GATGA ATCAA ATTTT G_3，(SEQ ID N0: 6)，扩增 3’ 区域。使用巴斯德毕赤酵母菌株NRRL-Yl 1430基因组DNA进行PCR扩增。PCR条件是95°C 2分钟的1个循环，95°C 30秒、55°C 30秒和72°C 2. 5分钟的25个循环，继之以72°C 10分钟的1个循环。将得到的PCR片段PpPDIl (5’)和PpPDIl (3’)分别克隆进质粒载体pCR2. 1，以分别制备质粒载体PGLY620和pGLY617。为了构建pGLY678，分别用将质粒载体pGLY678靶向 PDIl基因座并破坏彻/7基因座的表达的DNA片段PpPDI (5’)和PpPDI (3’)替换将质粒载体靶向巴斯德毕赤酵母^？似基因座的整合质粒载体pGLYM的DNA片段PpARG3-5'和 PpARG-3，。然后将编码人PDI的核酸分子克隆进质粒载体PGLY678，以生产质粒载体 PGLY642，其中编码人PDI的核酸分子被置于巴斯德毕赤酵母GAPDH启动子(PpGAPDH)控制下。通过将编码酿酒酵母α交配因子前信号肽(Sc α MF前信号肽(SEQ ID NO: 18)，其具有在5'端和钝的3'端的AfoiI限制酶位点)的核酸分子(SEQ ID NO: 17)和包含用J/fel 和AcI从质粒载体PGLY618释放的编码人PDI的核酸分子(生成具有钝的5'端和在3'端的PacI位点的核酸分子)的表达盒连接进用Λ^ I和PacI消化的质粒载体pGLY678中，构建表达/整合质粒载体PGLY642。得到的整合/表达质粒载体PGLY642包含可操作地连接到巴斯德毕赤酵母启动子上的编码人PDIl/ Sc α MF前信号肽融合蛋白的表达盒和将质粒载体靶向巴斯德毕赤酵母基因座(从而破坏彻/7基因座并将表达盒整合进基因座)的核酸分子序列。图2解释了质粒载体PGLY642的构建。& α MF前信号肽的核苷酸和氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 17和18所示。如下构建编码人EROla蛋白的表达/整合载体pGLY2232，如图3所示。由 GeneArt AG (Regensburg,德国)合成编码人EROl α蛋白的核酸分子，并用于构建质粒载体PGLY22M。人EROl α蛋白的核苷酸和氨基酸序列(分别是SEQ ID NO: 23和24)如表9 所示。使用限制酶JZfeI和&el，从质粒载体释放出编码人EROl α蛋白的核酸分子，然后用具有如上所述的5' AfoiI和3'平端的编码& a MP前信号肽的核酸分子连接进用AfoiI和 AseI消化的质粒载体pGLY22^中。质粒载体pGLY22^也包括含有巴斯德毕赤酵母/ ^ 基因的5'和3'区域(分别是PpPRBl-5'和PpPRBl_3'区域)的核酸分子。用勒“/II和 Notl消化得到的质粒载体PGLY2230，然后与含有巴斯德毕赤酵母彻/7启动子(PpPDI启动子)的核酸分子相连，所述核酸分子已经从用AglII和彻《消化的质粒载体PGLY2187得至lj。PpPDI 启动子的核苷酸序列是 5，-AACACGAACACTGTAAATAGAATAAAAGAAAACTTGGATAGTAGA ACTTCAATGTAGTGTTTCTATTGTCTTACGCGGCTCTTTAGATTGCAATCCCCAGAATGGAATCGTCCATCTTTCTC AACCCACTCAAAGATAATCTACCAGACATACCTACGCCCTCCATCCCAGCACCACGTCGCGATCACCCCTAAAACTT CAATAATTGAACACGTACTGATTTCCAAACCTTCTTCTTCTTCCTATCTATAAGA-3' (SEQ ID NO:31)。得到的质粒载体PGLY2232是表达/整合载体，其含有在巴斯德毕赤酵母彻/7启动子控制下的编码人EROl α融合蛋白的表达盒，且包括巴斯德毕赤酵母/ ^基因的5'和3'区域，以将质粒载体靶向基因组的/ ^基因座，用于破坏/ ^基因座和将表达盒整合进/ ^基因座。图3解释了质粒载体pGLY2232的构建。如下构建编码人GRP94蛋白的表达/整合载体pGLY2233，如图4所示。使用引物 hGRP94/UPl 5'-AGCGC TGACG ATGAA GTTGA TGTGG ATGGT ACAGT AG-3， (SEQ ID N0: 15)； 和 hGRP94/LPl: 5， -GGCCG GCCTT ACAAT TCATC ATGTT CAGCT GTAGA TTC 3' (SEQ ID NO: 16)，从人肝 cDNA (BD Bioscience) PCR 扩增人 GRP94。PCR 条件是95°C 2 分钟的 1 个循环，95°C 20秒、55°C 20秒和72°C 2. 5分钟的25个循环，继之以72°C 10分钟的1个循环。将PCR产物克隆进质粒载体pCR2. 1，以制备质粒载体pGLY2216。人GRP94的核苷酸和氨基酸序列(分别是SEQ ID NO:25和26)如表9所示。使用JffeI和厂從1，从质粒载体pGLY2216释放出编码人GRP94的核酸分子。然后将该核酸分子连接到上述的具有Λ^ Ι和平端的编码Sc α MP前信号肽的核酸分子和用 AfoiI和消化的携带包含巴斯德毕赤酵母/ 5’和3’区域(分别是PpPEP4-5’ 和PpPEP4-3'区域)的核酸分子的质粒载体PGLY2231上，以制备质粒载体pGLY22^。用 BglII和NotI消化质粒载体pGLY22^，并使用BglII和NotI从质粒载体pGLY2187取出含有PpPDI 1启动子的DNA片段，并将该DNA片段连接进pGLY22^，以制备质粒载体pGLY2233。 质粒载体PGLY2233编码在巴斯德毕赤酵母PDI启动子控制下的人GRP94融合蛋白，且包括巴斯德毕赤酵母/ 基因的5'和3'区域，以将质粒载体靶向基因组的/ 基因座，用于破坏/ 基因座和将表达盒整合进/ 基因座。图4解释了质粒载体pGLY2233的构建。如下构建质粒载体pGLY1162、pGLY1896和pGFI207t。所有里氏木霉α-1,2-甘露糖苷酶表达质粒载体都源自PGFI165，其编码与酿酒酵母α MAT前信号肽融合的里氏木霉 α -1，2-甘露糖苷酶催化结构域(参见公开的国际申请号W02007061631)，在这里，表达是在巴斯德毕赤酵母GAP启动子控制下，且其中质粒载体的整合是靶向巴斯德毕赤酵母/ ^ 基因座，并使用巴斯德毕赤酵母 基因进行选择。质粒载体PGFI165的图谱如图5所示。通过用巴斯德毕赤酵母AOXl (PpAOXl)启动子替换pGFI 165中的GAP启动子，可以制备质粒载体PGLY1162。这如下实现从pGLY2(^8分离PpAOXl启动子作为(产生平端片段，并插入用NotI (产生平端)和BglII消化的pGFI165中。将质粒载体整合进巴斯德毕赤酵母/ ^基因座，并使用巴斯德毕赤酵母·5基因进行选择。质粒载体PGLY1162的图谱如图6所示。质粒载体pGLY1896含有编码与酿酒酵母MNN2膜插入先导肽融合蛋白融合的小鼠α -1，2-甘露糖苷酶催化结构域的表达盒(参见Choi等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 5022 Q003))，其插入在质粒载体pGFI165中(图5)。这如下实现从用损ol (产生平端)和/^eI消化的pGLY1433分离GAPp-kMNN2_小鼠丽SI表达盒，并将该片段插入用/i^I消化的PGFI165。使该质粒载体整合进巴斯德毕赤酵母/ ^基因座，并使用巴斯德毕赤酵母·5基因进行选择。质粒载体PGLY1896的图谱如图5所示。质粒载体pGFI207t类似于pGLY1896，例外是，用赋予亚砷酸盐抗性的的酿酒酵母 ARR3 (ScARR3)基因替换选择标记。这如下实现从用AscIUscI产生平端)和勒·/II 消化的PGFI166分离ScARR3基因，并将该片段插入用分el iSpel产生平端)和勒“/II消化的PGLY1896中。使该质粒载体整合进巴斯德毕赤酵母/ ^基因座，并使用酿酒酵母^WJ 基因进行选择。质粒载体pGFI207t的图谱如图5所示。如下构建抗-DKKl抗体表达/整合质粒载体pGLY2260和pGLY2261 (图7)。 抗-DKKl抗体是识别Dickkopf蛋白1 (一种参与Wnt信号传递途径的配体)的抗体。为了产生编码抗-DKKl抗体的表达/整合质粒载体pGLY2260和pGLY2261，由GeneArt AG合成了密码子优化的核酸分子，其编码重链(HC;含有VH + IgG2m4的融合蛋白)和轻链(LC;含有VL + LA恒定区的融合蛋白)融合蛋白，它们各自在框架内含有编码α-淀粉酶(来自黑曲霉)信号肽的核酸分子。α-淀粉酶信号肽的核苷酸和氨基酸序列如SEQ ID NO: 48 和49所示。HC的核苷酸序列如SEQ ID NO: 27所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:观所示。LC 的核苷酸序列如SEQ ID N0:四所示，氨基酸序列如SEQ ID N0:30所示。IgG2m4同种型已经公开在美国公开申请号2007/0148167和美国公开申请号2006/0228349中。使用独特的 5’ -EcoRl和3’ -^I位点，将编码HC和LC融合蛋白的核酸分子分别克隆进表达质粒载体 PGLY1508中，分别形成质粒载体pGLY1278和pGLY1274。这些质粒载体含有kocin-抗性标记和TRP2整合位点和可操作地连接到编码HC和LC融合蛋白的核酸分子上的巴斯德毕赤酵母AOXl启动子。使用勒“/II和及 H1，从pGLY1274取出LC融合蛋白表达盒，并克隆进用勒“/II消化的PGLY1278，以产生质粒载体pGLY2260，其编码HC和LC融合蛋白，并将表达盒靶向TRP2基因座，用于将表达盒整合进TRP2基因座中。质粒载体pGLY2261含有在质粒载体pGLY2260中的一个额外的LC (图7)。如下用上述表达/整合载体转化酵母。在50 mL YPD培养基(酵母浸出物(1%)、 蛋白胨0%)、右旋糖0%))中培养巴斯德毕赤酵母菌株过夜，至约0.2-6的0D。在冰上温育30分钟后，通过在2500-3000 rpm离心5分钟，沉淀细胞。去除培养基，用冰冷的无菌1 M山梨醇洗涤细胞3次，然后重新悬浮于0.5 ml冰冷的无菌IM山梨醇中。在电穿孔容器中组合10 μ L线性化的DNA (5-20 μ g)和100 μ L细胞悬浮液，并在冰上温育5分钟。按照预设的巴斯德毕赤酵母方案O kV，25 μ F, 200 Ω)，在Bio-fcid GenePulser Xcell中电穿孔，然后立即加入1 mL YPDS恢复培养基(YPD培养基+ 1 M山梨醇)。使转化的细胞在室温)恢复4小时至过夜，然后将细胞涂布在选择培养基上。如下建立细胞系，如图IA和IB所示。使用以前描述的方法(参见例如，Nett 和 Gerngross, Yeast 20:1279 (2003) ； Choi 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:5022 (2003) ； Hamilton 等人，Science 301:1244 U003))，构建菌株 yGLY24_l (ura5A: :MBTlocAlA: \lacZbmt2\lacZ/K1MNN2-2 / mnn4LlHacZ/ MmSLC35A3
pnol^nnn4^\ ·.IacZmet跳·. \lacZ)。浏基因已经公开在 Mille 等人，J. Biol. Chem. 283: 9724-9736 (2008)和美国公开申请号20060211085中。PNOl基因已经公开在美国专利号7，198,921中，且孜7基因(也称作办)已经公开在美国专利号7，259，007中。 mnn4魏mnn4L2 imnn4a0按照遗传型，K1MNN2-2是乳酸克鲁维酵母GlcNAc转运蛋白， 且MmSLC35A3是小家鼠(Mus musculus) GlcNAc转运蛋白。URA5删除会赋予yGLYM_l菌株尿嘧啶营养缺陷型(参见美国公开申请号2004/0229306)，并用于构建如下的人源化的分子伴侣菌株。当不同的表达盒整合进本文的实施例中的巴斯德毕赤酵母基因组的特定基因座中时，应当理解，本发明的操作独立于用于整合的基因座。除了本文公开的那些以外的基因座可以用于表达盒的整合。合适的整合位点包括在美国公开申请号20070072^2中列举的那些，且包括已知的酿酒酵母和其它酵母或真菌的基因座的同源基因。构建了对照菌株yGLY645 (PpPDIl)。菌株yGLY645表达里氏木霉甘露糖苷酶1 (TrMNSl)和小鼠甘露糖苷酶IA (MuMNSIA)，它们各自在PpGAPDH启动子的控制下组成地表达，具有完整的天然巴斯德毕赤酵母彻/7基因座。通过用质粒载体pGLY1896(其将质粒载体靶向毕赤酵母基因组中的脯氨酸1 (PROl)基因座)转化yGLYM-Ι，从菌株yGLYM_l产生菌株yGLY645。质粒载体pGLY1896含有编码里氏木霉甘露糖苷酶1 (TrMNSl)和小鼠甘露糖苷酶IA (FB53, MuMNS 1A)的表达盒，它们各自在PpGAPDH启动子控制下组成地表达。为了测试在没有内源巴斯德毕赤酵母PDI1基因存在下在巴斯德毕赤酵母细胞中表达的人PDI的有效性，建立了菌株yGLY702和yGLY704。如下构建菌株yGLY702和yGLY704 (hPDI)。通过用质粒载体pGLY642转化yGLYM-1，产生菌株yGLY702，所述质粒载体pGLY642
23含有在组成型PpGAPDH启动子控制下的编码人PDI的表达盒。质粒载体pGLY642也含有编码巴斯德毕赤酵母_5的表达盒，其赋予菌株yGLY702尿嘧啶原养型。通过在5-F0A平板上反选择yGLY702，去除表达盒，产生菌株yGLY704，其中巴斯德毕赤酵母PDIl基因已经被人PDI基因稳定地替换，且所述菌株是尿嘧啶营养缺陷型。使用下述引物，通过集落PCR，证实使用质粒载体PGLY642用人PDI对巴斯德毕赤酵母彻/7的置换，所述引物的特异性是仅针对PpPDIl ORF; PpPDI/UPi-1, 5，-GGTGA GGTTG AGGTC CCAAG TGACT ATCAA GGTC-3，(SEQ ID NO: 7) ； PpPDI/LPi-1, 5，-GACCT TGATA GTCAC TTGGG ACCTC AACCT CACC-3，(SEQ ID NO: 8) ； PpPDI/UPi-2, 5，CGCCA ATGAT GAGGA TGCCT CTTCA AAGGT TGTG-3，(SEQ ID NO: 9)；和 PpPDI/LPi-2, 5，-CACAA CCTTT GAAGA GGCAT CCTCA TCATT GGCG-3，(SEQ ID NO: 10)。因而，PCR 产物的缺失指示 PpPDIl的敲除。PCR条件是95°C 2分钟的1个循环，95°C 20秒、58°C 20秒和72°C 1 分钟的25个循环，继之以72°C 10分钟的1个循环。使用额外的PCR来证实在PpPDIl基因座处的pGLY642的双交换，其中使用PCR 引物；PpPDI-5，/UP, 5，-GGCGA TTGCA TTCGC GACTG TATC—3，(SEQ ID NO: 11)；禾口， hPDI-3， /LP 5， -CCTAG AGAGC GGTGG CCAAG ATG-3， (SEQ ID NO: 12)。 PpPDI_5，/UP 引发PpPDIl的上游区域，该区域在pGY642的PpPDIl (5’)中不存在，且hPDI_3’/LP引发 PGLY642中的人PDI ORF。PCR条件是95°C 2分钟的1个循环，95°C 20秒、50°C 30秒和72°C 2. 5分钟的25个循环，继之以72°C 10分钟的1个循环。质粒载体作为敲除(即，双交换事件)或“卷入”(即，质粒载体向基因组中的单个整合)的整合效率可以取决于许多因素，包括载体和宿主染色体DNA上的对应基因之间的同源区域的数目和长度、选择标记、目标基因的作用、和敲入的(knocked-in)基因补偿内源功能的能力。发明人发现，在某些情况下，PGLY642作为双交换进行整合，导致人PpPDI对内源PpPDI基因的补偿，而在其它情况下，PGLY642质粒载体作为单个整合进行整合，导致内源PpPDIl基因和人PpPDI基因的存在。为了区别这些事件，发明人使用了本文所述的序列ID NO. 11至14的PCR引物。如果在pGLY642质粒载体整合后已经保留了 PpPDI基因，针对内部PpPDI编码序列的PpPDI-5，/UP和hPDI_3，/LP会产生扩增产物和对应的带。 如果发生敲除或双交换的事件，这些引物不会产生任何扩增产物，且不可看到对应的带。使用编码PpPDIl 的引物 PpPDI/UPi-1 (SEQ ID NO: 7)和 PpPDI/LPi-1 (SEQ ID NO: 8)以及编码人 PDI 的 hPDI/UP, 5，-GTGGC CACAC CAGGG GGCAT GGAAC-3，(SEQ ID NO: 13)和hPDI-3，/LP, 5，-CCTAG AGAGC GGTGG CCAAG ATG-3' (SEQ ID NO: 14)，证实pGLY642 的转入。PCR条件是对于PpPDI 1，95°C 2分钟的1个循环，95°C 20秒、58°C 20秒和72°C 1分钟的25个循环，继之以72°C 10分钟的1个循环；对于人PDI，95°C 2分钟的1个循环，95°C 20秒、50°C 30秒和72°C 2. 5分钟的25个循环，继之以72°C 10分钟的1个循环。通过将质粒载体pGLY1162转化进yGLY704饱PROl基因座，产生菌株yGLY733，所述质粒载体PGLYl 162包含可操作地连接到巴斯德毕赤酵母AOXl启动子(PpAOXl-TrMNSl) 上的编码里氏木霉甘露糖苷酶(TrMNSl)的表达盒。该菌株的编码巴斯德毕赤酵母PDIl 的基因被替换为编码人/ /的表达盒，且具有整合进/ ^基因座中的PpAOXl-TrMNSl表达盒，且是·5原养型。当在甲醇存在下培养所述细胞时，PpAOXl启动子允许过表达。
通过将表达盒整合进菌株yGLY733 (在巴斯德毕赤酵母基因组的5’ / ^基因座 UTR处)，构建菌株yGLY762，所述表达盒编码TrMNSl和小鼠甘露糖苷酶IA (MuMNS 1A)，它们各自可操作地连接到质粒载体pGFI207t中的巴斯德毕赤酵母GAPDH启动子上。该菌株的编码巴斯德毕赤酵母PDIl的基因被替换为编码人/ /的表达盒，且具有整合进/ ^基因座中的PpGAPDH-iTrMNSl和PpGAPDH-MuMNSIA表达盒，且是URA5原养型。通过用整合/表达质粒pGLY2260 (其将编码抗-DKKl抗体的表达盒靶向TRP2基因座)转化菌株yGLY645，产生菌株yGLY2263。通过在5-F0A平板上反选择yGLY733，产生菌株yGLY^74。该菌株的编码巴斯德毕赤酵母PDIl的基因被替换为编码人/ /的表达盒，具有整合进/ ^基因座中的 PpAOXl-TrMNSl表达盒，且是V似5营养缺陷型。通过在5-F0A平板上反选择yGLY762，产生菌株yGLY^77。该菌株的编码巴斯德毕赤酵母PDIl的基因被替换为编码人/ /的表达盒，具有整合进/ ^基因座中的 PpAOXl-TrMNSl 表达盒，具有整合进/ ^ 基因座中的 PpGAPH-TrMNSl 和 PpGAPDH-MuMNSIA 表达盒，且是·5营养缺陷型。通过将编码人EROl α蛋白的质粒载体pGLY2232整合进基因座，产生菌株 yGLY^590。该菌株的编码巴斯德毕赤酵母PDIl的基因被替换为编码人/ /的表达盒，具有整合进/^W基因座中的PpAOXl-TrMNSl表达盒，具有整合进PRBl基因座中的人EROl α表达盒，且是·5原养型。通过将编码人GRP94蛋白的质粒载体pGLY2233整合进PEP4基因座，产生菌株yGLY^596。该菌株的编码巴斯德毕赤酵母PDIl的基因被替换为编码人/ /的表达盒，具有整合进PROi基因座中的PpAOX 1 -TrMNS 1表达盒，具有整合进PROl基因座中的 PpGAPDH-TrMNSl和PpGAPDH-MuMNSIA表达盒，具有整合进/ / 基因座中的人GRP94，且是
原养型。通过用整合/表达质粒pGLY2261 (其将编码抗-DKKl抗体的表达盒靶向TRP2基因座)转化菌株yGLY2696，产生菌株yGLY36^。通过用整合/表达质粒pGLY2261 (其将编码抗-DKKl抗体的表达盒靶向TRP2基因座)转化菌株yGLY^90，产生菌株yGLY3647。表1表明，在遗传地工程化成生产优势地具有Man5GlcNAc2 N-聚糖的糖蛋白的酵母中，用编码人PDI的表达盒替换编码巴斯德毕赤酵母PDIl的基因，会实现糖基化占据的减少和糖基化的增加。
权利要求
1.一种低等真核生物宿主细胞，其包含编码至少一种内源或外源Ca2+ ATP酶的核酸分子，其中Ca2+ATP酶在所述宿主细胞中的表达是异位的。
2.权利要求1的低等真核生物宿主细胞，其中所述核酸分子包含可操作地连接到异源启动子上的编码Ca2+ ATP酶的开放读码框。
3.权利要求1的低等真核生物宿主细胞，其中所述宿主细胞另外包括编码重组蛋白的核酸分子。
4.权利要求3的低等真核生物宿主细胞，其中所述重组蛋白是抗体。
5.权利要求1的低等真核生物宿主细胞，其中编码分子伴侣蛋白的至少一个内源基因的功能已经被减少、破坏或删除；并在所述宿主细胞中表达编码所述分子伴侣蛋白的至少一种哺乳动物同系物的核酸分子。
6.权利要求1的低等真核生物宿主细胞，其中所述宿主细胞另外包括编码ERp57蛋白的核酸分子和/或编码钙网蛋白的核酸分子。
7.—种生产具有减少的糖基化的重组蛋白的方法，所述方法包括(a)提供低等真核生物宿主，其包含编码至少一种内源或外源Ca2+ATP酶的核酸分子， 其中所述Ca2+ ATP酶在所述宿主细胞中的表达是异位的；(b)将核酸分子导入编码所述重组蛋白的宿主细胞中；和(c)在适合生产所述重组蛋白的条件下，培养所述宿主细胞。
8.权利要求7的方法，其中所述核酸分子包含可操作地连接到异源启动子上的编码 Ca2+ ATP酶的开放读码框。
9.权利要求8的方法，其中所述重组蛋白是抗体。
10.权利要求7的方法，其中编码分子伴侣蛋白的至少一个内源基因的功能已经被减少、破坏或删除；并在所述宿主细胞中表达编码所述分子伴侣蛋白的至少一种哺乳动物同系物的核酸分子。
11.权利要求7的方法，其中所述宿主细胞另外包括编码ERp57蛋白的核酸分子和编码钙网蛋白的核酸分子。
12.—种低等真核生物宿主细胞，其包含编码ERp57蛋白的核酸分子和/或编码钙网蛋白的核酸分子，其中所述蛋白在所述宿主细胞中的表达是异位的。
13.权利要求12的低等真核生物宿主细胞，其中所述宿主细胞另外包括编码至少一种内源或外源Ca2+ ATP酶的核酸分子，其中Ca2+ ATP酶在所述宿主细胞中的表达是异位的。
14.权利要求12的低等真核生物宿主细胞，其中所述宿主细胞另外包括编码重组蛋白的核酸分子。
15.权利要求14的低等真核生物宿主细胞，其中所述重组蛋白是抗体。
16.权利要求12的低等真核生物宿主细胞，其中编码分子伴侣蛋白的至少一个内源基因的功能已经被减少、破坏或删除；并在所述宿主细胞中表达编码所述分子伴侣蛋白的至少一种哺乳动物同系物的核酸分子。
17.—种生产具有减少的糖基化的重组蛋白的方法，所述方法包括(a)提供低等真核生物宿主，其包含编码ERp57蛋白的核酸分子和/或编码钙网蛋白的核酸分子，其中所述蛋白在宿主细胞中的表达是异位的；(b)将核酸分子导入编码所述重组蛋白的宿主细胞中；和(C)在适合生产所述重组蛋白的条件下，培养所述宿主细胞。
18.权利要求17的方法，其中所述宿主细胞另外包括编码至少一种内源或外源Ca2+ ATP酶的核酸分子，其中所述Ca2+ ATP酶在所述宿主细胞中的表达是异位的。
19.权利要求17的方法，其中所述重组蛋白是抗体。
20.权利要求17的方法，其中编码分子伴侣蛋白的至少一个内源基因的功能已经被减少、破坏或删除；并在所述宿主细胞中表达编码所述分子伴侣蛋白的至少一种哺乳动物同系物的核酸分子。
全文摘要
描述了低等真核生物宿主细胞，其中内源或异源Ca2+ATP酶被过表达。也描述了低等真核生物宿主细胞，其中钙网蛋白和/或ERp57蛋白被过表达。这些宿主细胞可用于生产具有减少的O-糖基化的重组糖蛋白。
文档编号C12P21/00GK102177247SQ200980140300
公开日2011年9月7日 申请日期2009年8月10日 优先权日2008年8月12日
发明者崔秉权 申请人:格利科菲公司