专利名称：用于微生物快速生长和检测的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及用于在待测样本中，检测采自微生物尤其致病微生物的特定物质的方法。本发明还涉及用于该微生物快速生长使得与当前的方法相比，明显早地检测成为可能的组合物和方法。
背景技术：
由于食物产品从本质上是生物的，其能够支持多种微生物的生长。根据统计，在美国每年发生七千六百万例食源性疾病，在医疗护理和生产力降低方面花费六十五亿到349 亿美元的(Buzby和Roberts，1997 ；Mead等人，1999)。据统计在欧洲沙门氏菌属的经济和卫生服务的花费在六亿两千万到三十亿欧元之间(David Byrne, European Commissioner for health and consumer protection，2000)。沙门氏菌属，属，弯曲杆菌属，大肠杆菌0157:H7以及志贺氏菌属是形成大多数食源性疾病案例的原因。例如，沙门氏菌属和李斯特菌属单独地对分别为31%和的食物相关的死亡负责(Mead等人1999)，而在日本，在1981年到1995年之间，沙门氏菌病占总的食源性疾病爆发的14%以上(Lee等人，2001)。实际上，根据估计细菌是多达60%的需要住院的食源性疾病的病例的病因。因此，对微生物污染产品的低效率的及慢速的检测造成的延迟是造成浪费的最大因素之一。按照当前的检测方法，生产商必须为微生物繁殖结果等待三到七天。该延迟所产生的成本是显著的——降低了供应链的效率，占用库存并且增加损坏。不适当的或者不完善的检测的成本可能是昂贵的，如果不会带来更多问题的话。 例如，1999年Sara Lee在其食物被认为与李斯特氏菌属爆发有关之后，与其BiI Mar Foods 单位的三千五百万磅热狗和熟肉的召回有关的花费估计有七千六百万美元。根据《The Scotsman)), 2006年Cadbury Schweppes在为沙门氏菌属污染巧克力的召回成本，广告，损失的收入以及随后对其生产操作的改进花费了估计有两千万英镑。更近的在2009年，美国花生公司，作为2008年经营收入估计有两千五百万美元的公司，在被确认是美国花生中一次较大的沙门氏菌爆发的源头之后，递交了破产请求。因此，在食物、饲料和环境样品中检测致病性微生物如沙门氏菌属，志贺氏菌属和李斯特氏菌属的存在具有重大的经济意义。然而，用于该微生物检测的传统培养方法不仅是劳动力密集的，而且耗时。通常这样的方法基于已经使用超过五十年的标准步骤。除此之外，致病性的微生物能够在环境中长期处于受严重的胁迫状态，所述的“活的非可培养状态(VNC) ”或者“不能立即培养(NIC)”状态。该受严重的胁迫的微生物仅仅显示出弱的，通常在检测限上的代谢活性，并且其失去在非选择性平面皿培养基上形成聚落，或者在非选择性肉汤培养基中生长的能力(Reissbrodt等人，200 。然而，当这种不可培养的聚落存在于食物和动物饲料中时，如果食用，其仍然可能导致疾病。由于这样受胁迫的微生物可能无法充分地活化以至于能够被检测，这带来了特别的问题。因此，任意诊断中在进一步培养、铺板和检测之前通常包括旨在活化该细胞的额外的细胞培养步骤。因此，在非选择性的培养介质中预先富集对于传统的方法而言是关键
4的要素Stephens等人，2000)。例如，沙门氏菌属的检测需要长达5天的数个培养阶段；分析通常包括富集步骤，从而活化“生病的”细菌，并且检测通常受到该富集肉汤和培养基的性能的限制。因此，为了恢复来自潜在地含有异源的细菌种群的临床标本，食物和其他产品的微生物，可以使用三大类培养介质(1)为初步分离目的的非选择性的介质；( 富集肉汤以及C3)选择性的和/或分化性的琼脂糖。该介质的配方通常复杂，并且包括不仅抑制特定的细菌种类生长，也即它们是选择性的，同时也检测几种生物化学特性，所述的生物化学特性在对样品中存在的微生物进行早期鉴别是重要的，也即，它们是分化性的。为了进行合理的选择，微生物学家必须知道各个配方的成分以及所包括的各个化合物的目的及相对浓度。不幸的是，可得到的介质通常过于复杂，以及多种组分的效果和量通常很少为人所知。 通常，所使用的介质与使用了几个世纪的介质是一样的，并可能是一开始为了完全不同的生物体开发的。例如，由于这些缺陷，当前对沙门氏菌属的检测率在15天内低于50%，以及在沘天内低于90% (King，2009)。因此，需要明确界定，不含有多余的组分的培养介质，所述的培养介质可能具有少的或者没有副作用，并且对于即使受胁迫的微生物的生长和快速培养而言是优化的，。该培养介质应该不需要二次的/额外的培养步骤。也有对新的和更好的检测方法的需要，所述的方法使得能够分离和/或鉴定非常低数量的，以及位于异源微生物群落的环境下的致病性微生物。进一步地，任意的该方法应该等同地适用于从大范围内的来源中检测微生物，所述的来源如化妆品、食物产品、临床样品和环境样品，所述的食物产品包括冷冻的、冻干的和液体的产品，所述的临床样品如尿、大便或者血液样品和环境样品。发明概述在本发明的第一个方面，提供了用于至少一种微生物的生长的培养介质，其必要地包括⑴基础肉汤；(ii)至少一种生长抑制剂，其选自煌绿、萘啶酸和氯化锂所组成的组；和(iii)可选地，至少一种生长促进剂，其选自连四硫酸钠、连四硫酸钾、柠檬酸铁铵和柠檬酸钠所组成的组。为了避免产生怀疑，此处使用的术语“必要地包括”包括仅包括所规定的材料或者步骤，以及不相当地影响到本发明的基本的和创新的特征的范围内的额外组分或者元素。可以将介质分类为简单的、复杂的或者经界定的。基础肉汤或者基础培养基从根本上是维持细菌的具有最少的附加成分的简单培养基。一般地说该基础肉汤只需提供能量的来源，以及具有保持正确的渗透压。蛋白胨、胰化蛋白胨、肉汁(蛋白胨、肉的提取物，可选地酵母提取物和氯化钠)，L-肉汤(胰化蛋白胨、酵母提取物和氯化钠)，革兰氏阴性肉汤、胰蛋白酶大豆肉汤、含有酵母的胰蛋白酶大豆肉汤和改良的胰蛋白酶大豆肉汤是本领域适用的基础组分。蛋白胨是几种水溶的蛋白质衍生物，其通过将蛋白质(或者多种蛋白质)在消化过程中，由酸或者酶部分水解得到。胰蛋白酶大豆肉汤一般地包括例如胰化蛋白胨(酪蛋白的胰腺消化物)，大豆胨(大豆粉木瓜蛋白酶消化物)和氯化钠。改良的胰蛋白酶大豆肉汤可以进一步地包括葡萄糖、胆汁盐和磷酸二钾盐。具体地，基础肉汤选自胰化蛋白胨、肉汁、L-肉汤、革兰氏阴性肉汤、蛋白胨、胰蛋白酶大豆肉汤、具有酵母的胰蛋白酶大豆肉汤和改良的胰蛋白酶大豆肉汤所组成的组。更具体地，基础肉汤选自蛋白胨、胰蛋白酶大豆肉汤、具有酵母的胰蛋白酶大豆肉汤和改良的胰蛋白酶大豆肉汤所组成的组。在具体的实施方案中，所述的生长抑制剂是煌绿，一种三芳基甲烷染料(CAS号为 633-03-4)。煌绿是已知抑制革兰氏阳性细菌和大多数革兰氏阴性细菌的染料。在本领域中其以变化的量使用，例如，在Difco m煌绿肉汤中25mg/L，以及在煌绿连四硫酸盐胆汁肉汤中70mg/L，在MLCB琼脂糖中4. 5_6mg/L，以及在Muller Kauffmann连四硫酸盐肉汤中 10mg/L。尽管已经使用了几个世纪，发明人惊奇地发现煌绿的该浓度对于例如沙门氏菌属和志贺氏菌属的生长而言不是最优的。实际上，据认为该高浓度对于沙门氏菌属和志贺氏菌属的充分和快速的生长是有害的，并可能妨碍“生病的”或者“受胁迫的”细菌的恢复。沙门氏菌属的特定的株如伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌以及其他已知是对煌绿敏感的株， 并且目前没有适当的培养介质在株之间显示出有差别的抑制(Chau和Leimg，2008)。发明人发现了一系列浓度的煌绿针对例如革兰氏阳性细菌提供抑制效果，同时使得沙门氏菌属(包括伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌)和志贺氏菌属能快速地恢复并生长。因此，在具体的实施方案中，所述的培养介质包括煌绿，其用量约为0. 05至约0. 25mg/ L之间，或者在约0. 1至约0. 25mg/L之间，更具体地0. 15mg/L。从本领域中介质中已知的水平来看，这些“低水平”是令人吃惊的。人们相信由于本领域已知的长期的培养方法，在可能长达48小时的培养持续时间内使用高浓度的煌绿抑制竞争微生物以前是必要的。然而在本发明的介质中，生长效率是微生物能在单一的培养基中20小时之内培养到适合的检测水平，具体地约4-15个小时，更具体地约4-8个小时，以及再更具体地4-6个小时。在其他的实施方案中，如果用于表面棉签试验，这可能进一步地缩减到约30分钟至约4小时，具体地约1、1. 5、2、2. 5或者3小时。结果是可以使用令人吃惊地低的水平的煌绿，并且其仍然在抑制特定的竞争性微生物上起效长达20小时， 而且其充分地低，从而对感兴趣的微生物，如沙门氏菌属和/或志贺氏菌属的生长没有影响。尽管量一般以mg/L或者g/L提及，应当理解组合物可以干的性质预先混合提供， 如为片、粉末、颗粒或者其他合适的干的形式，分别地或者顺序地加到水中。如果需要，所属的组合物也能以多个包装系统中分开的组分提供。在这个情况下，所述的量指在合适的水中稀释之后组分的最终浓度。例如，含有0. 5mg煌绿的小包干粉稀释于2升水中，达到浓度为 0. 25mg/L。在其他的实施方案中，所述的介质含有萘啶酸和/或氯化锂作为抑制剂(或者多种抑制剂。)萘啶酸(CAS编号为389-08-2)有效抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。在较低的浓度下，其以细菌抑制的方式起效果；也即其抑制细菌的生长和繁殖。在更高的浓度下， 其为杀菌的，意味着其杀死细菌而不仅仅抑制其生长。在具体的实施方案中，所述的介质包括量为约1至:3mg/L，更具体地约ang/L的萘啶酸。氯化锂(CAS编号为7447-41-8)抑制革兰氏阴性细菌的生长，而不影响革兰氏阳性细菌的生长。在具体的实施方案中，介质包含约1至3g/L，更具体低约2g/L的量的氯化锂。
萘啶酸和/或氯化锂作为生长抑制剂的使用在用于李斯特菌属生长的培养介质中是有利的。在具体的实施方案中，培养介质可以选地包括生长促进剂。对于沙门氏菌属而言，发现了当基础肉汤包括蛋白胨时，包括连四硫酸钠或者其盐是有利的。出人意料的是，发明人发现培养介质中连四硫酸钠水平高于20g/L时沙门氏菌属的生长显著地受抑制。由于在本领域中对沙门氏菌属进行阳性选择和培养时，高于 20g/L的水平是惯常地使用的。因此，优选地连四硫酸钠以约1至约20g/L的量存在，更具体地约4至约15g/L，6至约15g/L，再更具体地约7至约15g/L，约8至12g/L或者约8g/L。在供选择的实施方案中，在不背离本发明精神的前提下可以使用适量的硫代硫酸钠和碘代替连四硫酸钠。这是由于碘能和硫代硫酸钠原位反应产生连四硫酸钠(以及碘化钠)。在其他的实施方案中，可以使用连四硫酸钾、无水连二硫酸钡、其盐或者能够释放连四硫酸根阴离子(S4O62-)的化合物，这些化合物的混合物。在其他的实施方案中，所述的培养介质包括生长促进剂，其中所述的生长促进剂为柠檬酸铁铵。在特定的实施方案中，使用约200至1000mg/L的量的柠檬酸铁铵(CAS编号为 1185-57-5)，更具体地约200至约500mg/L，再更具体地约200至约300mg/L，以及进一步再更具体地约250mg/L。在再另一个实施方案中，培养介质进一步地包括生长促进剂柠檬酸钠。在特定的实施方案中，使用约10至20g/L，约12至18g/L以及更具体地约15g/L 的量的柠檬酸三钠盐(CAS编号为68-04-2)。在特定的实施方案中，所述的培养介质用于沙门氏菌属的生长。在其他的实施方案中，所述的培养介质用于志贺氏菌属的生长。在再进一步的实施方案中，所述的培养介质用于李斯特菌属的生长。根据本发明的第二个方面，本发明提供了从微生物细胞中，将核心寡糖单体释放出来的方法，其包括(i)在含有所述的微生物的至少一个培养样品中加入洗涤剂，从而提供洗涤剂-培养物溶液；并且(ii)将所述的洗涤剂-培养物溶液加热到足以释放所述的核心寡糖的温度。细菌脂多糖(LPQ对于全部的革兰氏阴性细菌和一些革兰氏阳性细菌而言是外膜的关键组分。人们认为它们在该细菌感染的患者中，是造成炎症反应的原因。革兰氏阴性细菌的实例包括大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌和弯曲杆菌。李斯特菌是革兰氏阳性的细菌。多数经表征的LPS具有相同的主要结构；确定了 LPS的结构中包括三个不同的区 脂类A区，核心寡糖以及0-多糖链(
图12a)。该结构在脂类A及LPS的内核中是尤其保守的。由于这一结构上的保守，脂类A区的结合物，如抗体可能不具有对特定种的特异性，而导致在任何分子检测步骤中的假阳性。进一步地，针对如核心区的多种结合物的应用是差强人意的，由于该结合物可能对同一表位进行竞争，由于表位之间的类似性可能妨碍彼此各自的结合反应。因此，现有技术的检测方法依赖于对如沙门氏菌属的细胞表面或者鞭毛有特异性的结合物，由于这些容易达到。
一般通过含水酚萃取，随后纯化来分离LPS。经分离的LPS随后可以通过如 SDS-PAGE、质谱和NMR进行表征(Raetz，1996)。本发明人发现可以通过使用快速的方法， 使核心寡糖区释放或者使其可及，或者可以进行检测，所述的检测例如通过抗体结合技术， 所述的方法使用洗涤剂以及加热。这一套简单方法的不适用于如细胞表面抗原或者鞭毛的检测，由于已知洗涤剂与脂类相互作用，并且会破坏或者扰乱结合物可能与之反应的脂类A 表位。同时可以单独地使用洗涤剂，加热的使用是进一步有利的，由于其将LPS分解为可检测的单体，并且具有着杀死病原菌的附加好处。优选地，所述的洗涤剂是十二烷基磺酸钠 (SDS)或者吐温20、40、60或者80。出人意料地，在下文所述的直接测定中，本发明人发现SDS的使用能够增强结合物如抗体和表位之间的结合高达10倍。类似地，尽管其他的洗涤剂在直接测定(如下所示)中，妨碍和阻止抗体结合，出人意料地本发明人发现了吐温20、40、60和80很少或者没有这样的效果，例如，在竞争测定中。这与现有技术中现成的示教形成了鲜明的对比，所述示教如Qualtiere等人，1977。所述的洗涤剂可以以液体加入培养样品中，例如溶解于如水等溶剂中，或者在SDS 的情况下以固体的形式加入。用于本方法的特定的洗涤剂浓度为从约0. 至约2%，具体地约0. 5%至约1 % (w/v或者ν/ν)。优选地，所述的洗涤剂在水中溶解或者稀释，并以液体加入，得到前文所述的浓度。优选地，洗涤剂溶液中不存在进一步的组分如缓冲液等等。因此，在优选的实施方案中， 所述洗涤剂溶液仅包括洗涤剂，溶于水中的十二烷基磺酸钠或者吐温20、40、60或者80。在本方法的下一步中，将洗涤剂-培养物溶液加热到足以使核心寡糖释放的温度。优选地，将所述溶液(或多种溶液)加热到足以杀死样品中可能存在的细菌的温度，所述细菌具体地为沙门氏菌、志贺氏菌或者李斯特菌。具体的温度包括从约60°C到约100°C， 具体地约65、70、75、80、85、90、95到约100°C。对于本领域技术人员而言，显而易见的是步骤(i)和(ii)可以依次进行，同时进行，或者所述培养样品和/或洗涤剂可以在合并之前分别地加热。所述的洗涤剂-培养物溶液可以加热约30秒到约20分钟，具体地约2分钟到约15分钟，以及更具体地约2、3、4、5、6、7、8、9到约10分钟。在本发明的第三个方面，提供了检测感兴趣的微生物在待测样本中存在或不存在的检测方法，所述的方法包括(i)将所述的检测样品在培养介质中培养，所述的培养介质允许感兴趣的微生物的增殖；(ii)处理将所述的检测样品到足以从检测样品中存在的任意微生物中释放一种或多种核心寡糖的程度；(iii)将所述的检测样品暴露于至少一种结合物，所述结合物对感兴趣的微生物的核心寡糖有结合特异性；以及(iv)检测至少一种结合物与感兴趣的微生物的核心寡糖的任意结合。本检测方法可以是直接的或者间接的。在直接结合或者非竞争性分析中(直接的或者间接的)，也称作“三明治检测”，核心寡糖优选地结合于表面和结合物，例如抗体与感兴趣的微生物的任意核心寡糖反应。优选地所述结合物为经标记的结合物。随后测定表面上的所述经标记的结合物。
直接检测方法的结果一般来说与样品核心寡糖的浓度直接成比例。如果样品中不存在核心寡糖，很显然经标记的结合物不会结合。在竞争性检测中，检测样品中的核心寡糖在与结合物的结合中，与经标记的核心寡糖竞争。随后测量经标记的结合于结合物的核心寡糖的量。在这个方法中，响应与样品中核心寡糖的浓度成反比。这是由于响应越大，在“未知”的或者检测样品中能与经标记的核心寡糖竞争的核心寡糖越少。不管该检测是直接的或者间接的，核心寡糖或者经标记的核心寡糖都优选地分别结合在检测表面上。所述核心寡糖(或者多种寡糖)所结合的表面可以是现有技术中已知的材料，例如有机聚合物如塑料、玻璃、陶瓷等等。特定的有机聚合物包括聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯、纤维素和硝酸纤维素。优选的聚合物为聚苯乙烯，以及更具体地Y-射线辐照的聚苯乙烯。所述的表面其自身或者其一部分可以为片、微板块或者微量滴定板，板子、膜、 孔、小丸、棒、棍、管、珠子等等。在特定的实施方案中，将LPS或者包括所述核心寡糖的单体固定于没有任何修饰的表面上。例如该分子的疏水脂类A部分可以通过非共价的疏水相互作用结合于表面上， 所述表面如Y-射线辐照的聚苯乙烯表面。该结合使核心寡糖区易与结合物如抗体相互作用。在可选的实施方案中，通过使用中间的结合物，将LPS和/或核心寡糖结合到表面上，所述的中间的结合物如抗体、缀合物或者其他的连接物。在第W003/36419号国际专利申请公开中，公开了使用的替代物。该方法的第一步包括将检测样品在培养介质中进行培养，所述的培养介质使得感兴趣的微生物能够增殖。在特定的实施方案中，所述方法用于检测食物或者食物产品中的微生物蛋白或者片段。在进一步的实施方案中，所述的样品是环境样品、农业样品、医学样品或者制造业样品。所述的检测样品可能为食品产品如肉、肉制品，其包括肉末、蛋、奶酪、牛奶、蔬菜、巧克力、花生酱等等，其包括经处理的、经干燥的、经冷冻的或者经冷藏的食品产品。可选地所述检测样品可以为临床上的样品，如活组织检查样品、排泄物、唾液、保湿液、营养液、血液、血液产品、组织提取物、疫苗、麻醉剂、药学上有活性的药剂、成像药剂、或者尿样等等。所述的检测样品还可以包括棉签，如皮肤_、盲囊_、排泄物的、排泄腔的、或者直肠的棉签，或者表面的棉签，如地板、门和墙，或者得自食品产品的棉签，包括经屠宰的动物躯体的棉签等等。 所述的检测样品还可以包括化妆品样品如基础化妆品、唇膏、洗液、乳霜、香波等等。优选地，将所述检测样品在根据本发明第一个方面的培养介质中进行培养。在具体的实施方案中，将所述的检测样品在培养介质中在约30°C到约44°C中进行培养，具体地约37°C到42°C，更具体地约37°C。所述的检测样品可以在培养介质中培养约4-15个小时，更具体地约4-8个小时，以及再更具体地4-6小时。在其他的实施方案中， 可以将所述的检测样品在培养介质中培养30分钟到约4个小时，优选地约1、1. 5、2、2. 5或者3小时。所述方法的第二步包括将检测样品处理到足以从检测样品中存在的任何微生物中释放一种或多种核心寡糖的程度。
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可以将所述检测样品以任意适用的方法进行处理，所述方法导致从微生物的细胞膜中释放细菌LPS和/或核心寡糖。优选地，将所述检测样品根据本发明的第二个方面进行处理。现有技术中有其他适用但是可能效率较低的提取方法，并且也可能使用，其包括超声降解法、使用高压、使用酶、“珠磨”等等。然而，当处理致病性细菌如沙门氏菌时，在高温下(如煮沸或者前面所讨论的)使用洗涤剂是尤其地有效的，由于高温能确保所有的细菌被杀死。更具体地，当所述的检测是直接结合检测时，优选地使用SDS，然而当分析为竞争形式时，使用SDS来制备涂布抗原的板，同时将吐温20、吐温40、吐温60或者吐温80，优选吐温20用在步骤中剩下的部分。在前文第一个方面中给出了适用的加热/处理时间间隔。很明显，感兴趣的微生物可能不存在于检测样品中，在这种情况下该感兴趣的微生物的 LPSs和核心寡糖也将不存在。在该方法的第三步中，将所述的检测样品暴露于至少一种结合物，所述结合物对感兴趣的微生物的核心多糖具有结合特异性。在具体的实施方案中，在步骤(iii)之前，将经处理的检测样品中的核心寡糖、 LPS或者单体固定在表面上，暴露于至少一种结合物，所述结合物对感兴趣的微生物的核心多糖具有结合特异性。在该实施方案中，可以通过将经处理的检测样品与表面接触，并温育和/或保持接触约10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟到约60分钟将在样品中的所述核心寡糖、LPS或者单体进行固定。在其他的实施方案中，例如在竞争性检测中，将所述的检测样品施加到，或者接触到表面上，所述表面上已经固定了已知的或标准量的核心寡糖、LPS或者单体。来自已知的或者标准物的核心寡糖、LPS或者单体与检测样品的核心寡糖、LPS或者单体竞争结合于至少一种结合物上。可以将核心寡糖、LPS或者单体直接地固定在所述的表面上，其通过例如非共价的疏水相互作用或者如前所述地间接的方法。应该将检测样品暴露于至少一种结合物足够的时间，从而使核心寡糖、LPS或者单体结合于至少一种结合物形成复合物，例如核心寡糖/结合物复合物。合适的时间包括从约1分钟到约4小时，具体地从约30分钟到约2小时，具体地约45分钟、1小时和1. 5小时。在特定的实施方案中，在所述方法的可选的步骤中，将所述的复合物暴露于对至少一种结合物具有结合特异性得第二种结合物足够的时间，从而使第二种结合物形成次级复合物，例如核心寡糖/结合物/第二结合物的复合物。优选地，所述的结合物为抗体，更优选地为亲和纯化的抗体，以及再更优选地为单
克隆抗体。用于本发明的检测的抗体可以为多克隆的、单克隆的、双特异性的、人源化的或者嵌合的抗体。该抗体可包括单个的链，但优选地包括至少轻链或者重链，但为了结合与抗体具有结合特异性的靶如核心寡糖或者微生物污染物，最好有至少一个互补决定区(CDR)。制备抗体的方法是本领域中已知的。例如如果想要多克隆抗体，可以将所选择的抗原，如细菌内毒素免疫接种于所选择的哺乳动物中，所述的哺乳动物如鼠、兔、山羊或者马。收集经免疫的动物的血清并进行处理从而得到抗体，所述的处理如通过免疫亲和层析。可以通过现有技术中已知的方法制备单克隆抗体，并且这是一般来说优选的。利用杂种瘤技术制备单克隆抗体的一般方法是公知的(参见例如Kohler，G和Milstein，C， Nature 256:495-497(1975) ；Kozbor 等人，I mmunology Today 4:72(1983) ；Cole 等人， Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 第 77-96 页，Alan R. Liss, Inc. (1985))。如本文所述的抗原应该包括如CDR的表位结合区域。所述的抗体可以为任意适用的种类，包括IgE、IgM、IgD、IgA以及特别地，IgG。也预期了这些抗体不同的亚类。如在此所使用的，术语“抗体结合片段”具体地指抗体的片段，来自抗体保留抗体的结合特异性的多肽。该片段包括但不限于抗体片段，如Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv，其全部都能够结合于表位。术语“抗体”还延伸到能得到的任意各种天然的和人工的抗体，以及可用的抗体衍生蛋白质，和它们的衍生物，例如，包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化的抗体、人类抗体、单功能域抗体、完整的抗体、抗体的片段如F(ab' )2*F(ab)的片段、 Fv片段(非共价的杂合二聚体)、单链的抗体如单链的Fv分子(scFv)、微抗体、特异性寡配体、二聚体或者三聚体抗体片段或者结构等等。术语“抗体”不暗示任意的具体来源，并且包括通过非传统的过程得到的抗体，所述非传统的过程如噬菌体表面展示。本发明的抗体可以为任意的亚型(如IgA、IgG、IgM也即α、Y或者μ重链)并可以具有κ (kappa)或者 λ (lambda)轻链。本发明因此延伸到抗体以及抗体衍生的结合片段的应用，所述的结合片段对本发明所使用的核心寡糖具有结合特异性。术语“特异地结合”或者“结合特异性”指抗体或者其片段结合靶微生物病原体的能力，所述的结合与其结合非靶表位相比具有更强的亲和性。例如，抗体与靶表位的结合的亲和力比非靶表位亲和力的大至少10、50、100、250、500或者1000倍。在特定的实施方案中，亲和力通过亲和ELISA检测进行测定。在可选的实施方案中，亲和性通过大分子相互作用检测进行测定。可选地，亲和力可以通过动力学方法进行测定。在特定的实施方案中，结合物如抗体可以固定在表面上，在可选的洗涤步骤之后， 将可能含有感兴趣的核心寡糖或者微生物污染物的检测样品暴露于表面结合抗体足够的时间，从而使结合发生，以及使表面结合第一结合物-核心复合物形成。该检测可以随后包括将包括表面结合第一结合物-核心复合物的与第二结合物接触，所述第二结合物如抗体，其可以是共价结合态的并能发射光，例如为吖啶酯。在该情况下，第二结合物对存在于第一结合物上或者在核心寡糖上或者微生物污染物上的表位具有结合特异性，从而所产生的信号的量与第一或者第二结合物所结合的核心寡糖或者微生物污染物的量相对应。典型地，将抗体纯化从而避免聚集。在特定的实施方案中，所述的表面为常规设计的微滴定板，然而在使用改性的表面的时候具有优点，例如具有涂黑的壁以及白色或者透明的部分(如在底部)。这在测量的时候加强了所产生的任意信号，并减少了背景光。白色的部分使得光线反射，从而增强所产生的信号。因此，在具体的实施方案中，表面是具有多个孔的多孔板，其中各个孔的底部是透明的或者大体上透明的，而孔的壁是不透明的，或者涂黑的从而避免光透过，或者染色的，从而与允许光线通过的孔的底部进行对比。再更具体地，所述的抗体是物种特异性的单克隆抗体。术语“物种特异性的”意图表示该抗体能够区分例如沙门氏菌、志贺氏菌和李斯特菌，而只有很少或者没有交叉反应。在具体的实施方案中，所述的结合物与LPS核心寡糖的该表位相互作用及结合
权利要求
1.用于至少一种微生物的生长的培养介质，其本质上含有(i)基础肉汤，选自蛋白胨、胰蛋白酶大豆肉汤、含有酵母的胰蛋白酶大豆肉汤以及改良的胰蛋白酶大豆肉汤；( )至少一种生长抑制剂，选自煌绿、萘啶酸和氯化锂；和(iii)可选地，至少一种生长促进剂，选自连四硫酸钠、柠檬酸铁铵和柠檬酸钠。
2.权利要求1中所述的培养介质，其中所述的生长抑制剂为用量为约0.05至0. 25mg/ L的煌绿。
3.权利要求1中所述的培养介质，其中所述的生长抑制剂为用量为约1至:3mg/L的萘啶酸和约1至约3g/L的氯化锂。
4.权利要求1或者2中所述的培养介质，其包括生长促进剂，其中所述的生长促进剂是用量为约4至约12g/L的连四硫酸钠。
5.权利要求1至4中所述的培养介质，其包括生长促进剂，其中所述的生长促进剂是量为约200至300mg/L的柠檬酸铁铵。
6.权利要求7或者8中所述的培养介质，其还包括生长促进剂柠檬酸钠，所述柠檬酸钠的量为约10至20g/L，更具体地约为15g/L。
7.权利要求1、2或者4中任一项所述的培养介质，其中至少一种微生物是沙门氏菌属。
8.权利要求1、2、5或者6中任一项所述的培养介质，其中至少一种微生物是志贺氏菌属。
9.权利要求1、3或者5中任一项所述的培养介质，其中至少一种微生物是李斯特菌属。
10.一种用于检测待测样本中感兴趣的微生物存在或不存在的检验方法，所述的方法包括(i)将所述的待测样本在培养介质中培养，所述的培养介质允许感兴趣的微生物的增殖；( )将所述的待测样本处理到足以从待测样本中存在的任意微生物中释放一种或多种核心寡糖的程度；(iii)将所述的待测样本暴露于至少一种结合物，所述结合物对感兴趣的微生物的核心寡糖有结合特异性；和(iv)检测至少一种结合物与感兴趣的微生物的核心寡糖的任意结合。
11.权利要求11所述的方法，其中步骤(ii)包括(a)在含有所述感兴趣的微生物的一个待测样本中加入洗涤剂，从而提供一个洗涤剂-培养物溶液；和(b)将所述的洗涤剂-培养物溶液加热到足以释放所述的核心寡糖的温度。
12.权利要求11所述的方法，其中所述洗涤剂是十二烷基磺酸钠、吐温20、吐温40、吐温60或者吐温80。
13.权利要求10至12中任一项所述的方法，其中步骤(i)使用根据权利要求1至9中任一项的培养介质进行。
14.权利要求10或者13中任一项所述的方法，其中步骤(iv)通过检测冷光信号进行。
15.权利要求14所述的方法，其中所述的冷光信号由吖啶酯产生。
16.从微生物细胞中将核心寡糖单体释放出来的方法，其包括(i)在含有所述的微生物的至少一个待测样本中加入洗涤剂，从而提供洗涤剂-培养物溶液；和(ii)将所述的洗涤剂-培养物溶液加热到足以释放所述的核心寡糖的温度。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述的洗涤剂是十二烷基磺酸钠、吐温20、吐温 40、吐温60或者吐温80。
18.本质上含有十二烷基磺酸钠、吐温20、吐温40、吐温60或者吐温80的溶液在权利要求16所述的方法中的应用。
19.对核心寡糖具有结合特异性的结合物在微生物的特异性检测中的应用，所述微生物选自沙门氏菌、志贺氏菌和李斯特菌。
20.根据权利要求1至9中任一项的培养介质在至少一种细菌的生长中的应用，所述的细菌具体地为沙门氏菌、志贺氏菌或者李斯特菌。
21.权利要求10至17任一项所述的方法，其中所述的核心寡糖表位是
全文摘要
本发明涉及用于在待测样本中检测采自微生物尤其是致病微生物的特定物质如核心寡糖的检测方法。本发明还涉及用于该微生物快速生长使得与当前的方法相比，明显早地检测成为可能的组合物和方法，。在具体的实施方案中，本发明旨在沙门氏菌属、志贺氏菌属、李斯特氏菌属的快速生长和/或检测。
文档编号C12Q1/04GK102216467SQ200980142725
公开日2011年10月12日 申请日期2009年9月10日 优先权日2008年9月10日
发明者W·斯廷森 申请人:速乐思科学解决方案有限公司