胰腺肿瘤发生的通路及遗传性胰腺癌基因的制作方法

专利名称：胰腺肿瘤发生的通路及遗传性胰腺癌基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及胰腺癌领域。具体的说，本发明涉及胰腺癌的诊断、治疗、鉴定、监测、 检测和分层。
背景技术：
2008年，全世界将有213，000位病人罹患胰腺癌，几乎所有病人都将死于该疾病 (1)。死亡率如此之高的部分原因是该疾病通常在局部扩散或转移至肝脏、腹膜或其它器官时才被检测到。该肿瘤对男性和女性的伤害相对平均，甚至在使用西方世界的积极疗法治疗时，总体存活率仍低于5% (2,3)0尽管与吸烟、长期慢性胰腺炎和某些饮食有适度的关联，但是对于环境因素导致胰腺肿瘤形成的机制还知之甚少。相似地，约10%胰腺癌病人似乎具有罹患该病的家族倾向性。尽管这些病人中的一小部分带有BRCA2、⑶KN2A、LKBU raSSl、STKll或MSH2的生殖细胞突变，但是导致绝大部分病人具有罹患胰腺癌的家族倾向性的基因还没有被发现(4)。胰腺肿瘤似乎经过多个中间阶段，与结直肠肿瘤很相似。侵润性癌症之前的非侵润阶段被称为胰腺上皮内瘤变(PanINs)，与组织病理学检查显现的进行性发育异常相关联。在这些病变以及由此最终发展而成的完全侵润性癌中确定了一些基因改变(6-10)。 改变的基因包括⑶KN2A、SMAD4、TP53抑癌基因以及KRAS致癌基因，其中每个在大部分晚期癌症和侵润前肿瘤的多个部分中都发现有突变。这些基因的发现为该疾病的自然史提供了独特的见解，激励我们为开发改进诊断和治疗试剂付出努力(11)。理解胰腺癌的详细基因构成的需求在本领域是持续存在的。对胰腺癌相关且重要的其它基因和通路的需求是持续存在的。发明简介本发明一方面是一种识别疾病易患个体的方法。对来源于个体组织的模板核酸中蛋白质编码基因的多个外显子进行测序反应。将个体的多个外显子的序列与未患病个体的序列相比较，从而识别在未患病个体中不存在的个体的蛋白质编码基因中的突变等位基因。存在突变等位基因即表明个体易患该疾病。本发明的另一方面是一种识别遗传性癌症相关基因的方法。对蛋白质编码基因的至少外显子的模板核酸进行测序反应。模板核酸源自首位具有家族性癌症的人的肿瘤。确定在肿瘤中没有野生型等位基因存在的蛋白质编码基因。对具有与首个人相同的器官家族性癌症的多人的蛋白质编码基因的模板核酸进行测序反应。从多位个体的蛋白质编码基因中识别出不同于首个人等位基因的一个或多个突变等位基因，从而确认该蛋白编码基因能赋予家族性癌症的易患性。本发明的另一方面是一种确定胰腺癌易患性的方法。测试个体是否存在其家族成员中发现的PALB2基因的突变。当突变存在时，识别该个体具有更高发展为胰腺癌的风险；当突变不存在时，识别该个体具有一般风险。本发明的另一方面是一种包含至少18个核苷酸的PALB2序列的核酸引物或探针， 其中序列包含的突变选自由下列组成的组172-175位TTGT缺失，IVS5-1位G突变为T， 3116位A缺失以及3256位C突变为T。本发明的另一方面是一种包含四条探针或引物的引物或探针的试剂盒，其中每条引物或探针包含至少18个核苷酸的PALB2序列，其中序列包含的突变选自由下列组成的组172-175位TTGT缺失，IVS5-1位G突变为T，3116位A缺失以及3256位C突变为T。本发明的一方面是一种在个体中确定胰腺癌易患性的方法。对源自个体的模板核酸进行PALB2基因序列的测序反应。识别PALB2序列中的突变，从而识别个体具有更高的胰腺癌易患性。本发明的另一个方面是一种在个体中确定胰腺癌易患性的方法。将一种包含至少 18个核苷酸的PALB2序列的核酸引物或探针与个体核酸中PALB2基因序列进行杂交，其中包含至少18个核苷酸的PALB2序列包含选自由下列组成的组突变172-175位TTGT缺失， IVS5-1位G突变为T，3116位A缺失以及3256位C突变为T。识别个体的PALB2序列中所述突变的一种，从而识别个体具有更高的胰腺癌易患性。根据本发明的一实施例，提供了一种在人体中检测或诊断胰腺癌或微小残留疾病或分子性复发的方法。测定相对于人体正常样品的测试样品中基因或其编码的cDNA或蛋白中的体细胞突变。基因选自表S7或S3中列出的基因组成的组；但该基因不是RAS、 SMAD4.CDKN2A和TP53中的任一个。当测定有体细胞突变时，识别个体很可能有胰腺癌、微小残留疾病或胰腺癌的分子性复发。还提供了一种在人体中鉴定胰腺癌的方法。CAN基因突变特征是通过测定测试样品中相对于人体正常样品的基因、其编码cDNA或蛋白的至少一种体细胞突变而测定的。基因是选自由表S7或S3中列出的基因组成的组；但该基因不是RAS、SMAD4、⑶KN2A和TP53 中的任一个。本发明的另一方面是一种在人体中鉴定胰腺肿瘤的方法。通过测定测试样品中相对于人体正常样品的至少一种体细胞突变来测定胰腺肿瘤中选自表S8所示通路组成的组中的突变通路。在通路的一个或多个基因中至少有一个体细胞突变。胰腺肿瘤被指定为通路有突变的第一组胰腺肿瘤；第一组胰腺肿瘤对有突变的通路基因而言是异质的，但对通路而言是同质的。本发明另一方面是一种在个体中检测早期癌症、微小残留疾病或分子性复发的方法。在从个体收集的临床样品中检测到选自表S6或S12(来自SAGE分析的胰腺过表达基因)所示的基因的mRNA或蛋白的增强表达。增强是相对于健康人群或相对于不同时间点收集的相同个体的临床样品而言的。当临床样品相对于对照物表达提高时，识别个体可能有胰腺癌、微小残留疾病或胰腺癌的分子性复发。本发明的另一方面是一种监测胰腺癌负担的方法。在临床样品中测定表S6或 S12(来自SAGE分析的胰腺过表达基因)所列的一个或多个基因的表达。测定表达的步骤重复所述一次或多次。识别表达随时间增高、降低或稳定的水平。本发明的另一方面是一种检测或诊断胰腺癌的方法。在临床样品中测定表S5 (纯合性缺失)所列的一个或多种基因的表达。将临床样品中一个或多个基因的表达与对照人或人群对照组或病人正常组织中的相应样品中一个或多个基因的表达相比较。相对于对照物表达下降的临床样品被识别为可能有胰腺癌。进一步提供了一种监测胰腺癌负担的方法。测定表S5 (纯合性缺失)所列的一个或多种基因在临床样品中的表达。测定步骤重复一次或多次。识别表达随时间增高、降低或稳定的水平。本发明也提供了一种监测胰腺癌负担的方法，其中测定测试样品中相对于人体正常样品基因或其编码cDNA或蛋白的体细胞突变。基因是选自由表S7所列基因组成的组中挑出的；但该基因不是RAS、SMAD4、⑶KN2A和TP53中的任一个。测定步骤重复一次或多次。 识别测试样品中所述突变随时间增高、降低或稳定的水平。这些和其它实施例为本领域提供了鉴定、治疗、预测、诊断和分层胰腺癌的工具和方法，所述实施例对阅读了该说明书的本领域普通技术人员来说是显而易见的。


图1A-1D突变结构模型示例(图.1A)。蛋白激酶C (PKC) γ的C2结构域的X-射线晶体结构(PDBID :2UZP)。Arg252用大实心体显示，Ca2+离子用较小的球体显示。配体1， 2-乙二醇和5'-磷酸吡哆醛用球和棒表示。R252H突变会降低PRKCG C2结构域的膜结合从而影响功能。(图.1B)人Kruppel样因子5(KLF5)的zf_C2H2结构域的三串联重复的核磁共振(NMR)解析结构(PDBID :2EBT)。His389用实心体表示，Zn2+离子用小球体表示。残基包括协同附近&ι2+离子的C2H2基团，H393和H397用球和棒表示，并且Cys380和Cys375 用球和棒表示。389位的突变(H389N)可能破坏锌指结构或附近的锌协同位点。(图.1C) SMAD3 (两个亚基表示为几乎垂直的丝带)和SMAD4 ( 一个亚基表示为水平的丝带)的异三聚体的X射线晶体结构(PDBID :1U7F)。对应于两个突变位点的残基(M60S和S422F，表示为实心体，在A链中)位于接合处，可能扰乱Smad3-Smad3或Smad3-Smad4的相互作用。在 B链中，F260和S422表示为实心体。(图.1D)人DPP6作为同源二聚体的细胞外结构域的 X射线晶体结构(PDBID =IXFD)。本研究中发现的两个突变残基T409I和D475N (用实心体表示)在空间上相近，而且与一个糖基化位点Asn471(用实心体表示)相近。这些突变落在被认为与蛋白-蛋白相互作用相关的蛋白的β-螺旋结构域(残基142-322和351-581) 中。Α778Τ突变(表示为实心体)落在α/β水解酶结构域(残基127-142和581到849)， 而且与蛋白的同源二聚体区域相近，可能扰乱同源二聚体结合。有糖基化位点的糖类用棒表不。图2通过测序和分析M份癌症中每份的拷贝数来检测基因改变的数量。数据条底部代表突变，数据条中间代表扩增，数据条顶端代表缺失。图3A-3C。通路和调控过程。(图3Α)在大多数胰腺癌中成分基因发生基因改变的12条通路和过程。(图3Β，图3C)两份胰腺癌(PaHC和I^aIOX)和其中突变的特定基因。 (图3B)和(图3C)中圆周围的位置对应于(图3A)中的通路和过程。几个通路组分互相重叠，正如在I^alOX中推测破坏了 SMAD4和Hedgehog信号通路的BMPR2突变所说明的那样。 此外，不是所有12条过程和通路在每份胰腺癌中都改变，正如在I3aIOX中未观察到已知影响DNA损伤控制的突变这一事实所例证的那样(N. 0.，未观察到)。图4. PALB2基因中突变的位置。方框代表外显子，内含子为黑线(未按照比例)。以前在家族性乳腺癌或范科尼贫血症的病人中识别的突变表示在基因下方。在家族性胰腺癌病人中识别的生殖细胞系突变表示在基因上方。图5.补充表S3 (发现性筛选中的突变)、S4(突变流行性筛选)、S5(纯合性缺失)、S6 (扩增的基因)、S7 (CAN基因)、S8 (频繁突变的通路)、S12 (SAGE过表达基因)和 S13(过表达，细胞外基因)。

发明内容
发明人深入地分析了胰腺肿瘤，并且基于分析结果开发了新的治疗方法、预测方法、工具和分层方法。用一些独特的方法，比如为突变、扩增和缺失检测而测序以及表达定量，发明人识别了关键的基因、通路和突变。尽管个体胰腺肿瘤间有巨大的基因异质性，经常突变的基因和通路的模式还是被检测到。体细胞突变是在个体生物生命期特定的体细胞克隆中发生的突变。所以该突变不会遗传自父母或传给后代。这种突变相对于其它细胞、组织和器官显得不同。当在疑似癌变的胰腺组织中检测体细胞突变时，会与看上去是非肿瘤的正常胰腺组织，或如血细胞等非胰腺样品，或来自未受影响个体的样品作比较。表S7或表2显示了胰腺肿瘤中发现的突变。这些突变可以在测试样品中被检出， 比如疑似肿瘤组织样品、血液、胰管液、尿液、唾液、淋巴液等等。体细胞突变往往通过将测试样品中的序列和来自正常对照样品，如健康胰腺组织中的序列相比较来测定。一个或多个突变可用于此目的。如果病人经历过外科手术，检测肿瘤边缘或剩余相邻组织中的突变可来检测微小残留疾病或分子性复发。如果胰腺癌以前未确诊，突变可用于帮助诊断，例如和其它包括生物化学标记和放射性结果的实验室体检结果相结合。突变可用于对病人分层，识别那些对药物或其它治疗敏感或耐受的病人或病人群体。可以测定CAN基因特征来鉴定胰腺癌。特征是CAN基因中的一组一个或多个体细胞突变。表S7和表2显示了胰腺的CAN基因。一旦测定这样的特征，胰腺肿瘤即可分配在一组共有该特征的胰腺肿瘤中。该组可用来分配预测，分配临床试验组，分配治疗方案，和/ 或分配用于进一步鉴定和研究。在临床试验组中，可以评估药物对有无特征的胰腺肿瘤的影响能力的差别。一旦确定差别影响，该特征可在给药方案中用于分配病人，或避免不必要地治疗那些对药物没有有益效果的病人。临床试验的药物可以是以前已知用于另一目的药物，以前已知用于治疗胰腺癌或以前不知可用于治疗的药物。CAN基因特征可能包含至少1 个，至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个基因。特定特征中基因或突变的数量可能随特征中CAN基因的标识而变化。被分析的胰腺肿瘤中突变基因的分析结果显示出与通路的有趣关联性。在胰腺肿瘤中某些通路频繁带有突变。在特定肿瘤中单一基因突变常常会排除该通路中另一基因突变的存在。在胰腺肿瘤中频繁突变的通路列于表S8和表2中。通路可以用任一标准参考数据库来定义，如MetaCore基因本体(GO)数据库，MetaCore标准基因通路图(MA)数据库，MetaCore GeneGo (GG)数据库，Panther，TRMP, KEGG 和 SPAD 数据库。基于在某一通路中存在或缺乏突变来分组。这种组对突变的基因而言是异质的，但对突变的通路而言是同质的。和CAN基因特征一样，这些组可用来鉴定胰腺。一旦确定通路中的突变，可以将胰腺分配到一组共有该突变通路的胰腺肿瘤中。该组可用来分配预测，分配临床试验组，分配治疗方案，和/或分配用于进一步鉴定和研究。在临床试验组中，可以评估药物对有无突变通路的胰腺肿瘤的影响能力的差别。一旦确定差别影响，该通路可用于在给药方案中分配病人，或避免不必要地治疗那些对药物没有有益效果的病人。临床试验的药物可以是以前已知用于另一目的药物，以前已知用于治疗胰腺癌或以前不知道可用于治疗的药物。表达水平可以测定且过表达可能表示新的胰腺肿瘤、胰腺的分子性复发或微小残留疾病。在胰腺肿瘤中发现的高度增强的表达如表S6和表S12所示。这些过表达基因可以在测试样品中检出，比如疑似肿瘤组织样品、血液、胰管液、尿液、唾液、淋巴液等等。表达增高往往通过将测试样品中基因的表达和来自正常样品，如健康胰腺组织中基因的表达相比较而测定。一个或多个基因的表达增高可用于此目的。如果病人经历过外科手术，检测肿瘤边缘或剩余相邻组织中的表达增高可用于检测微小残留疾病或分子性复发。如果胰腺癌以前未确诊，表达增高可用于帮助诊断，例如和其它包括生物化学标记和放射性结果的实验室体检结果相结合。为了这些目的，可以使用本领域已知的用于表达定量的任何方法， 包括用于检测增高的mRNA的SAGE和微阵列，以及在各种分析形式中使用的，用于检测增高的蛋白表达的抗体。对于检测蛋白表达，表S13所列的基因特别有用。肿瘤负担可以用表S7所列的突变来监测。例如，这可用在观察等待模式中或在治疗期间以监测效力。用体细胞突变作为标记，随时间测试可检测的DNA、mRNA或蛋白的水平，可以表明肿瘤负担。样品中突变的水平可能随分析的时间而增高、降低或保持稳定。这种监测可以指导治疗疗法和时机。对胰腺肿瘤的分析揭示了纯合性缺失的基因。这些结果列于表S5中。测定一个或多个这些基因表达的消失可以作为胰腺癌的标记。这可以在血液或淋巴结样品中或胰腺组织样品中进行。可以测试一个或多个这些基因的表达。如ELISA或IHC等技术可用于检测样品中蛋白表达的减少或消失。同样，列于表S5中的纯合性缺失的基因(和表S6的扩增基因)可用于随时间检测肿瘤负担。为了确定表达增高、降低或稳定的水平，可以反复监测表达。这种突变和拷贝数改变的整合分析获得的数据提供了对胰腺肿瘤基因层面不同的视野。不同类型基因数据的组合，包括点突变、扩增和缺失使个体CAN基因以及胰腺肿瘤的复杂细胞通路和过程中可能优先受影响的基因组能够被识别。对之前所示的胰腺肿瘤中受突变、扩增或缺失影响的实质上所有基因的识别证实了我们所采用广泛的基因组方法是有效的。此处所述的广泛的基因研究表明理解胰腺癌的关键在于鉴别一组核心的调控过程和通路。我们识别了在大部分胰腺癌中发生基因改变的12条这样的过程(图3A)。然而，在任一个体肿瘤中改变的通路组分变化很大(图3B，C)。例如，图;3B和C描绘的两个肿瘤每个都包含TGF- β通路相关的基因突变(一个是SMAD4，另一个是BMPR2)。同样，这两个肿瘤都包含其它11条核心过程/通路中的大部分相关的基因的突变，但每个肿瘤中改变的基因却大不相同。尽管我们不能确定每个识别的突变在其相关的通路或过程中都发挥功能性作用，但是从现在和以前发表的基因数据以及从过去的功能性研究来看，很明显其中很多很可能影响这些通路。这种观点很可能适用于大部分的，如果不是所有的，上皮性肿瘤。它完全与基因改变可以归类为高峰(高频突变)和矮峰(低频突变)的观点相一致，就相关改变的总数而言矮峰占主导(16)。通路组分的异质性和个别基因中突变的多变特性可以解释肿瘤的异质性，这是所有实体肿瘤的一个基本面(39)。从睿智的观点来看，通路的观点能有助于有序而根本地理解非常复杂的疾病 (40-42) 0虽然调控过程和通路在总体理解肿瘤形成中的重要性已经得到承认03，44)，但是基因组范围的基因分析，如本研究中进行的分析可以在每位病人的肿瘤中识别出导致调控异常的准确的基因改变。除了产生对肿瘤发病机理的理解之外，这种研究还提供了基于个人化癌症药物的方向所需的数据。不同于某些形势的白血病中肿瘤发生似乎由单一靶向性癌基因驱动，胰腺癌是由大量基因的基因改变通过相对少数的通路和过程产生作用所引起的。由于KRAS癌基因到目前为止没有被成功靶向且没有出现类似的新的广泛改变的目标，我们的研究表明治疗方法发展的最大希望在于发现针对改变后的通路和调控过程的生理影响，而不是个别基因组分的试剂。这些影响包括代谢紊乱、血管异生、细胞表面蛋白的错误表达、细胞周期改变、细胞骨架异常以及基因组损伤修复能力受损(表S8)。用于胰腺癌的方法具有更广泛的应用。识别遗传性疾病相关基因的方法可用于其它癌症和其它疾病。被识别为与胰腺癌易患性相关的一个基因是PALB2。在病人的胰腺癌中识别有 PALB2的突变，然后可以测试家族成员们以确定他们是否也有突变。如果家族成员(们)有突变，那么她就具有更高发展为胰腺癌的风险。如果病人的PALB2突变不存在于家族成员中，那么她和一般人群具有相同的风险。可以用本领域普通技术人员已知的任一方法进行测试。可以将家族成员的模板核酸与核酸探针或引物杂交而分析突变。如示例所示，模板核酸可以是基因组、mRNA或cDNA。探针或引物可以包含至少14、16、18、20、22、24J6或30 个核酸碱基。探针或引物可以包括包含胰腺癌中发现的突变的PALB2的一部分。引物可以位于突变位点两侧，允许对扩增子中的突变进行扩增和分析。测定的特定突变是172-175 位TTGT缺失，IVS5-1位G突变为T，3116位A缺失以及3256位C突变为T。突变特异性PALB2探针或引物可以组合在试剂盒中。试剂盒可以包含分离的或不分离的容器。试剂盒组分可以分开或混合。试剂盒除容器外的其它组分可以包括说明书，试剂如缓冲液和酶(如聚合酶)等。固体支架、反应管和微珠等等可以包括在试剂盒中。试剂盒可以包含至少两种、三种或四种不同的突变特异性试剂。上述公开内容总体描述了本发明。此处公开的所有参考文献通过参考特别并入。 通过参考下面特定的实施例可以获得更加全面地理解，且实施例仅仅为了说明，无意限制发明的范围。实施例1样品选择。和所有的癌症基因组学研究一样，样品的选择是关键的。对于本研究， 我们挑选了 M份晚期腺癌，每一份来自不同且不相关的病人(表Si)。选择晚期胰腺癌是因为期望它们包含导致肿瘤起始和进展的所有基因改变，而早期癌症可能仅包含一部分。 M份癌症体外传代为细胞株或裸鼠中的异种移植物以便于检测突变。研究显示比起原发瘤，这种传代方法为Sanger测序或拷贝数分析提供了更好的DNA模板，因为它去除了最初存在于肿瘤中的污染的非癌细胞(1 。研究还表明在间接体内培养期间，细胞系和异体移植物中的克隆突变即使有也很少出现(12-14)。实施例2
测序方案。提取在保守编码序列(发布号1)、参照序列(发布号16)和Ensembl 数据库(发布号31)中发现的编码蛋白质的外显子序列，并用来设计用于基因组DNA扩增的引物(图.Si)。如果在我们过去的乳腺癌和结直肠癌研究中设计的引物证明是成功的 (75，16)，则使用相同的引物。针对以前没有研究过的11，579个外显子以及那些以前为之设计过引物，但被证明不理想的外显子设计了新的引物组(见下面)(17)。在M份胰腺癌中用染料终止测序法和表S2所列的416，622条引物对每个得到的外显子的序列进行测定。 包含变异序列的外显子从肿瘤DNA中再次扩增并再次测序以确认观察到改变。对每个病例中具有突变的病人的正常组织的DNA进行额外检测。该方法测定在正常细胞中是否存在改变(因此生殖细胞性变异)或者代表该个体中癌细胞特异的体细胞突变。由于未来医学的再测序计划可能采用下一代边合成边测序的化学方法，确定用本研究所用的传统染料终止测序法获得的覆盖范围是令人感兴趣的。我们试图评价代表 20，735个基因的23，962条转录本的蛋白质编码外显子的序列。目标序列包括每个外显子的所有蛋白质编码部分以及上游的四个碱基和下游的四个碱基。为了覆盖这些区段，我们针对219，2 个扩增子设计引物，其中208,311个(95%)产生了 PCR产物，且被成功测序并符合我们用于进一步突变分析的质量控制要求(17)。这些控制质量的扩增子覆盖了 94. 5%的目标编码区，为扩增子中98. 5%的目标碱基产生了高质量的测序结果。我们总计在这M位病人中成功测序了代表目标转录本的编码区段中93. 1 %碱基的752，843，968bp。 这产生了代表了 20，661个基因的23，219条转录本的突变数据。请注意，扩增所用引物最小是“第二代”引物，在我们实验室以前进行的每次大规模测序项目期间，不合格的引物已经用新的引物替代和改进了。这样，这93. 的数值代表接近于染料终止技术所能达到的最大值了。而且，大部分不能被测序的区段代表了重复元素，而不是本身测序失败。因为重复区段对产生短阅读长度的方法甚至会有更多问题，这种序列覆盖范围用第二代技术也不可能被提高。实施例3体细胞突变。在1562个体细胞突变中，25. 5%是同义的(synonymous)，62. 4%是错义的(missense)，3. 8%是无义的(nonsense)，5. 0 %是小的插入和缺失，3. 3%是在剪接位点(splice sites)或在非翻译区(UTR)中(表1)。体细胞突变谱可以为潜在致癌物质和其它环境暴露提供见解。表1列举了对四份肿瘤中大多数编码蛋白质的基因的大规模测序分析后观察到的突变谱。很明显，乳腺癌具有独特的体细胞突变谱，5' -TpC位点突变占多数而5' -CpG位点突变相对少数。然而，结直肠的、脑的(18)和胰腺的肿瘤的突变谱是相似的，表明与发展为其它肿瘤(19，20)的细胞相比，乳腺上皮细胞暴露于不同水平或种类的致癌物，或采用不同的修复系统。考虑到如胰腺和结肠细胞等胃肠道细胞比乳腺或脑细胞更多暴露于饮食性致癌物中，这些结果的一种解释是饮食成分不直接导致人类癌症中发现的多数突变。表1.四种肿瘤类型中体细胞突变总结
权利要求
1.一种识别疾病易患性个体的方法，通过对来源于所述个体组织的模板核酸中的蛋白质编码基因的多个外显子进行测序反应；将所述个体的多个外显子的序列与未患病个体的序列相比较从而识别在未患病个体中不存在的所述个体的蛋白质编码基因中的突变等位基因，其中突变等位基因的存在表明个体易患病。
2.如权利要求1所述的方法，进一步包括识别所述个体中的存在于生殖细胞中且包含截短突变的基因的等位基因。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述截短突变是无义突变。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述截短突变是移框突变。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述截短突变在剪接位点中。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个突变等位基因包含截短突变。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述模板核酸是肿瘤DNA。
8.如权利要求1所述的方法，其中对蛋白质编码基因的所有外显子进行所述测序反应。
9.如权利要求1所述的方法，其中对蛋白质编码基因的无偏见样品进行所述测序反应。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述测序反应在不采用连锁分析时进行。
11.如权利要求1所述的方法，其中如果不存在野生型等位基因而且剩下的蛋白质编码基因中至少有一个的等位基因包含截短突变，所述蛋白质编码基因被识别。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述易患疾病是癌症。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述易患疾病是由至少有一位受影响的一级亲属的受影响个体所定义的家族性癌症。
14.一种识别遗传性癌症相关基因的方法，包括对至少蛋白质编码基因的外显子的模板核酸进行测序反应，其中模板核酸来源于首位具有家族性癌症的人的肿瘤；识别在肿瘤中没有野生型等位基因存在的蛋白质编码基因；对与所述首个人相同的器官具有家族性癌症的多人的蛋白质编码基因的模板核酸进行测序反应；从多位个体的蛋白质编码基因中识别出不同于首个人等位基因的一个或多个突变等位基因，从而确认该蛋白编码基因能赋予家族性癌症的易患性。
15.一种确定胰腺癌易患性的方法，包括测试个体是否存在有该个体家族成员中发现的PALB2基因的突变；当突变存在时，识别该个体具有更高发展为胰腺癌的风险，当突变不存在时，识别该个体具有一般风险。
16.权利要求15所述的方法，其中所述测试包括将核酸探针或引物与PALB2基因或转录本杂交的步骤。
17.一种包含至少18个核苷酸的PALB2序列的核酸引物或探针，其中序列包含选自由下列组成的组中的突变172-175位TTGT缺失，IVS5-1位G突变为T，3116位A缺失以及 3256位C突变为T。
18.—种包含权利要求17中四种探针或引物的引物或探针的试剂盒。
19.一种在个体中确定胰腺癌易患性的方法，包括对来自所述个体的模板核酸进行PALB2基因序列的测序反应；识别PALB2序列中的突变，从而识别所述个体具有更高的胰腺癌易患性。
20.如权利要求19所述的方法，其中突变是截短突变。
21.一种在个体中确定胰腺癌易患性的方法，包括将包含至少18个核苷酸的PALB2 序列的核酸引物或探针，其中所述序列包含选自由下列组成的组中的突变172-175位 TTGT缺失，IVS5-1位G突变为T，3116位A缺失以及3256位C突变为T，与所述个体核酸中PALB2基因序列进行杂交；识别PALB2序列中所述突变的一种，从而识别个体具有更高的胰腺癌易患性。
22.一种在人体中检测或诊断胰腺癌或微小残留疾病或分子性复发的方法，包括步骤确定测试样品中相对于人体正常样品的基因或其编码的cDNA或蛋白中的体细胞突变，所述基因选自由表S7或S3中列出的基因组成的组，其中所述基因不是RAS、SMAD4、 CDKN2A和TP53中的任一个；当确定有体细胞突变时，识别所述个体可能有胰腺癌、微小残留疾病或胰腺癌的分子性复发。
23.如权利要求22的所述方法，其中所述测试样品是胰腺组织样品、疑似胰腺癌转移、 血浆、血清、全血、胰管液、粪便和呼吸。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述正常样品是胰腺组织样品。
25.一种在人体中鉴定胰腺癌的方法，包括步骤通过测定样品中相对于人体正常样品基因或其编码cDNA或蛋白中至少一种体细胞突变来测定样品中相对于人体正常样品的CAN基因突变特征，所述基因选自由表S7或S3中列出的基因组成的组，其中所述基因不是RAS、SMAD4、 CDKN2A和TP53中的任一个。
26.如权利要求4的所述方法，进一步包含步骤将具有CAN基因突变特征的胰腺癌形成第一组；将候选或已知的抗癌治疗方法对第一组的效力与对具有不同CAN基因突变特征的第二组的效力进行比较；识别与所述候选或已知的抗癌治疗方法相对于其它组具有增强或减弱的效力相关的 CAN基因突变特征。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述的测试样品是胰腺组织样品。
28.如权利要求25所述的方法，其中所述的正常样品是胰腺组织样品。
29.如权利要求25所述的方法，其中所述的CAN基因突变特征包含选自表S7或S3中的至少2个基因，其中所述基因不是RAS、SMAD4、⑶KN2A和TP53中的任一个。
30.如权利要求25所述的方法，其中所述的CAN基因突变特征包含选自表S7或S3中的至少3个基因，其中所述基因不是RAS、SMAD4、⑶KN2A和TP53中的任一个。
31.如权利要求25所述的方法，其中所述的CAN基因突变特征包含选自表S7或S3中的至少4个基因，其中所述基因不是RAS、SMAD4、⑶KN2A和TP53中的任一个。
32.如权利要求25所述的方法，其中CAN基因突变特征包含选自表S7或S3中的至少 5个基因，其中所述基因不是RAS、SMAD4、⑶KN2A和TP53中的任一个。
33.如权利要求25所述的方法，其中CAN基因突变特征包含选自表S7或S3中的至少 6个基因，其中所述基因不是RAS、SMAD4、⑶KN2A和TP53中的任一个。
34.如权利要求25所述的方法，其中CAN基因突变特征包含选自表S7或S3中的至少 7个基因，其中所述基因不是RAS、SMAD4、⑶KN2A和TP53中的任一个。
35.一种在人体中鉴定胰腺癌的方法，包括步骤通过测定测试样品中相对于人体正常样品的至少一种体细胞突变来测定胰腺肿瘤中选自表S8所示的通路组成的组中的突变通路，其中在所述通路的一个或多个基因中至少有一个体细胞突变；指定通路有突变的所述胰腺肿瘤为通路有突变的第一组胰腺肿瘤，其中所述第一组胰腺肿瘤对有突变的通路基因而言是异质的。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述通路是选自表2所示的通路。
37.如权利要求35所述的方法，进一步包括步骤将候选或已知的抗癌治疗方法对第一组的效力与对在第一通路中没有突变的第二组胰腺肿瘤的效力进行比较；如果与候选或已知的抗癌治疗方法相对于其它组具有增强或减弱的效力相关，即确定第一通路可用于分层。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述通路是选自表2所示的通路。
39.一种在个体中检测早期癌症或微小残留疾病或分子性复发的方法，包括在从所述个体收集的临床样品中检测选自表S6或S12(来自SAGE分析的胰腺过表达基因)所示基因中的mRNA或蛋白的增强表达，其中所述增强是相对于健康人群或相对于不同时间点收集的相同个体的临床样品而言的；当所述临床样品相对于所述对照品有高表达时，识别所述个体很可能有胰腺癌、微小残留疾病或胰腺癌的分子性复发。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述一个或多个基因的蛋白表达被测定。
41.如权利要求39所述的方法，其中所述一个或多个基因的mRNA表达被测定。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述一个或多个基因选自表S13(SAGE分析发现的细胞外蛋白)所列的基因。
43.一种监测胰腺癌负担的方法，包括在临床样品中测定选自表S6或S12(来自SAGE分析的胰腺过表达基因)所列的一个或多个基因的表达；重复所述测定步骤一次或多次，确定表达随时间的增高、降低或稳定水平。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述一个或多个基因的蛋白表达被测定。
45.如权利要求43所述的方法，其中所述一个或多个基因的mRNA表达被测定。
46.如权利要求43所述的方法，其中所述一个或多个基因选自表S13(SAGE分析发现的细胞外蛋白)所列的基因。
47.如权利要求39或43所述的方法，其中所述样品选自由下列组成的组血浆、血清、全血、胰管液、粪便和呼吸。
48.一种在个体中检测或诊断胰腺癌的方法，包括在人的临床样品中测定表S5(纯合性缺失)所列的一个或多种基因的表达； 将临床样品中一个或多个基因的表达与对照人或人对照组或人对照组织中的相应样品中一个或多个基因的表达相比较；临床样品相对于对照品表达下降，则识别为很可能有胰腺癌。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述临床样品是血液或淋巴结样品。
50.如权利要求48所述的方法，其中所述临床样品是胰腺组织样品。
51.如权利要求48所述的方法，其中所述一个或多个基因的蛋白表达被测定。
52.一种监测胰腺癌负担的方法，包括测定表S5(纯合性缺失)所列的一个或多种基因在临床样品中的表达； 重复所述测定步骤一次或多次， 确定表达随时间的增高、降低或稳定水平。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述临床样品是血液或淋巴结样品。
54.如权利要求52所述的方法，其中一个或多个基因的蛋白表达被测定。
55.如权利要求48或52所述的方法，其中所述样品选自由下列组成的组血浆、血清、 全血、胰管液、粪便和呼吸。
56.一种监测胰腺癌负担的方法，包括测定相对于人体正常样品的测试样品中基因或其编码的cDNA或蛋白中的体细胞突变，所述基因选自表S7中列出的基因组成的组，其中所述基因不是RAS、SMAD4、⑶KN2A和 TP53中的任一个；重复所述测定步骤一次或多次；确定所述测试样品中所述突变随时间的增高、降低或稳定水平。
57.如权利要求56所述的方法，其中多个基因的体细胞突变被测定。
58.如权利要求56所述的方法，其中所述测试样品选自由下列组成的组血浆、血清、 全血、胰管液、粪便和呼吸。
全文摘要
目前胰腺癌病人的治疗选择很少，急需对这种致死性疾病发病机理的新见解。为此，我们在24份胰腺肿瘤中全面地分析了改变的基因。首先，我们在来自这些肿瘤的DNA中测定了代表20,583个蛋白编码基因的23,781条转录本。其次，我们在每一样品中用单核苷酸多态性为1000,000的微阵列芯片查询搜索纯合性缺失和扩增。再次，我们用SAGE和下一代边合成边测序技术分析相同样品的转录组。我们发现胰腺癌平均包含63个基因改变，其中49个是点突变，8个是纯合性缺失，6个是扩增。进一步分析揭示了在70％-100％的样品中各自发生基因改变的一组核心的12条调控过程或通路。数据表明这组核心通路的调控异常导致了胰腺肿瘤的大部分特征。
文档编号C12Q1/68GK102203295SQ200980143925
公开日2011年9月28日 申请日期2009年9月3日 优先权日2008年9月3日
发明者A·克莱因, B·沃格斯坦, D·W·帕森斯, G·帕玛强尼, J·C·林, J·R·埃什尔曼, K·W·金兹勒, M·戈金斯, N·帕帕多普洛斯, P·安格嫩特, R·J·利里, R·卡新, R·赫鲁班, S·克恩, S·琼斯, V·韦尔库列斯库, 张晓松 申请人:约翰霍普金斯大学