生产琥珀酸的微生物的制作方法

专利名称：生产琥珀酸的微生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物，与野生型相比其被遗传修饰，并且其适合于生产有机酸，特别是琥珀酸，涉及这样的微生物的用途以及涉及生产这样的微生物的方法。本发明的现有技术和背景
二羧酸具有很大的经济潜力，因为它们可以用作许多化学物质的前体物质。例如，琥珀酸充当了生产基于1，4-丁二醇、四氢呋喃和γ-丁内酯的塑料的前体。当今，琥珀酸通过马来酸酐到琥珀酸酐的催化氢化作用和随后的加水，或通过马来酸的直接催化氢化来化学地产生。琥珀酸也通过许多微生物在生理环境条件下由糖或氨基酸出发来产生。在厌氧条件下，通常地，除了琥珀酸之外，产生额外的发酵终产物，例如乙醇、乳酸、乙酸和甲酸。具有高氧含量的琥珀酸的生物合成需要还原性的(X)2固定。琥珀酸是一种通常通过厌氧发酵过程来富集的代谢物。虽然在厌氧条件下产品的产量和富集好于有氧条件下数倍，仅仅厌氧过程的缺点是生物质生产的技术限制和微生物生产者的低生产力。因而，结果是相对低的生物质/产物效力。此外，难以工业操作严格厌氧的微生物。能够在厌氧条件下合成琥珀酸的不同的微生物是本领域中已知的。文献US 5，143，834描述了产琥珀酸厌氧螺菌属(A succiniciproducens)的变种。它是专性厌氧微生物，仅能产生适量的琥珀酸，此外不能耐受高渗透压和盐浓度。文献US 7，063，968描述了来自牛瘤胃的微生物分离物曼氏杆菌属属物种 (.Mannheimia sp. ) 55E，其能够在有氧以及厌氧条件下合成有机酸。然而这不是琥珀酸的特异性富集，而是不同有机酸的混合物，例如，甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸。这种生产者的缺点是，由于为了获得琥珀酸必需应用昂贵的富集和纯化方法，如果不是完全地不可能，这种菌株的经济使用仅在困难的情况下是可能的。文献US 5，869，301描述了使用五coli AFP-111在两步发酵过程中生产二元羧酸的方法，其中在第一个阶段微生物生物质在有氧条件下产生，在第二阶段琥珀酸的生产厌氧地进行。生物质产生的第一阶段在这个过程中是限制性的，因为进料-分批过程中的葡萄糖浓度必需限于1 g/L，以避免乙酸的富集，其将干扰产生生物质以及产生琥珀酸的过程。因而，这种过程的生物质的产生仅对有限的程度是可能的。此外，琥珀酸的生物合成途径在这个过程中经历强烈的降解代谢产物抑制，因为柠檬酸循环和乙醛酸途径的糖酵解的基因强烈地被葡萄糖抑制，这是从文献中已知的(DeRisi等人1997)。结果是，在存在葡萄糖的情况下琥珀酸的合成被很大地抑制，因而强烈地受限制。根据文献US 6，190，914已知这样的微生物，其中通过调节合适的转录因子和激酶，各种基因的葡萄糖抑制被降低。然而，通过这样的微生物的有机酸生产，特别是对于有机酸生产被显著优化的微生物的有机酸生产没有在其中提及。本发明的技术问题
本发明的技术问题是给出一种微生物，通过所述微生物，可以在微生物学生产方法中获得有机酸、特别是琥珀酸的改进的产量。本发明的基础和优选的实施方式
为了解决这个技术问题，本发明教导了分离的遗传修饰的微生物，其中与野生型相比， a)基因idhl和idpl被删除或灭活，和/或b)基因sdh2和sdhl被删除或灭活，和/或c) 基因/^β 被删除或灭活，或处在启动子的控制之下，所述启动子能通过将微生物暴露于诱导物质来抑制或诱导，和/或d)来自由ICL1、MLSU ACSl和MDH3构成的组的一种或多种基因被来自Crabtree阴性生物体的一个相应的外源基因或多个相应的外源基因替换或补充。替换或补充基因ICLl的外源基因可以与序列No. 1具有至少75%的同源性。替换或补充基因ACSl的外源基因可以与序列No. 2具有至少75%的同源性。替换或补充基因 MLSl的外源基因可以与序列No. 3具有至少75%的同源性。替换或补充基因MDH3的外源基因可以与序列No. 4具有至少75%的同源性。优选地，所述同源性是超过80%、特别地超过 90%，最优选地超过95%。但是，理所当然地，也可以是与之相比相同的。根据本发明，获得了通过酵母菌株、特别是酿酒酵母Ueiccheiromyces cerevisiae)酵母菌株，生产呼吸作用中央新陈代谢的琥珀酸和其他有机酸的优化方法。这种方法允许有机羧酸、特别是酵母菌呼吸作用中央新陈代谢的二元羧酸以及羟基脂肪酸， 例如琥珀酸在生产时间和产量方面更有效的生产。此外，通过生长和生产阶段的分离，而不使用抗生素依赖性的启动子系统，它容许2步骤的生产过程。根据本发明，一种过程变成可能，在其中，起初在第一生长阶段中，生物质被富集， 在第二阶段中，琥珀酸被产生并释放到培养介质中。生长和生产阶段的分离很大程度地促进了酵母菌中有机酸的整个生产过程的效率，因为不然的话细胞的生长和期望的代谢物的生产总是竞争性的因素。在生产阶段期间，生物质的生产是非期望的，因为为此使用的碳或底物被消耗，其最终导致要生产的代谢物，例如琥珀酸的产量的降低。生长和生产阶段的分离能通过遗传修饰的微生物，或通过遗传突变修饰的微生物和相关的发酵方法来实现，其中，首先在第一阶段期间，确保微生物生产者的最佳生物质提高，然后，在第二阶段中(生产阶段)，随后是羧酸，例如琥珀酸来自初始碳源(例如，葡萄糖) 和(X)2 (添补反应，CO2固定)的富集。在生产阶段，通过微生物的遗传修饰，所述修饰在非在先公开的专利申请PCT/ DE 2008/000670 “生产琥珀酸的微生物(Mikroorganismus zur Herstellung von Bernsteindure)”中描述了，在中间体异柠檬酸和琥珀酸之后(附

图1中黑色十字标出的) 柠檬酸循环(附图la)被中断，而这在生长阶段不被中断并具有野生型的构型。这些中断导致琥珀酸不能进一步被代谢，并作为终产物被富集，碳流动重定向到乙醛酸循环中(附图 lb)。对于通过乙醛酸循环的有机酸生产，优点是，在柠檬酸循环中异柠檬酸到琥珀酰-CoA 的两个氧化脱羧作用步骤，以及双次CO2形式的碳损失(参见附图Ic)被阻止了。在生产阶段期间在中间体异柠檬酸和琥珀酸之后的所描述的中断通过外源的可控制启动子系统来实现，所述启动子系统连接到生产阶段中要被抑制的基因的上游。然后，在生产阶段期间相应基因的抑制通过向培养介质添加四环的抗生素，例如四环素来发生。然而在发酵中抗生素的应用可能导致问题，因为它们是额外的成本因素。此外，任选地，从产品或培养肉汤再次除去的抗生素要求使得“下游加工”显著更昂贵和更成本密集。相比之下，本发明提供了生长和生产阶段的分离的另一种优化的可能性，其不需要使用抗生素，还提供了在酵母菌中生产琥珀酸或其他有机酸的优化的方法。对于特征a)进行以下陈述。例如在酵母菌酿酒酵母中，不考虑基因sdh2和idhl 的删除，这导致柠檬酸循环的中断，可以测量到与未修饰的野生型酵母菌可比较的生长速度。躲idhl删除的酵母菌株的生长仅仅是可能的，因为这个删除不导致异柠檬酸脱氢酶活性的完全消失。这个的原因是异柠檬酸脱氢酶的三个另外的同工酶的存在，对于α-酮戊二酸的产生，它们可以补偿由基因7 //和7 编码的二聚化的主要酶的损失。α-酮戊二酸的合成是酵母细胞在最小培养基上的生长绝对必需的，因为氨基酸谷氨酸从这个中间体产生，没有谷氨酸不可能有生长。在用酵母菌生产琥珀酸的2步发酵过程中，因而生长和生产阶段的有效分离仅通过生产菌株中异柠檬酸脱氢酶活性的完全抑制才是可能的，由于因此确保了谷氨酸营养缺陷型，结果是酵母菌在没有补充的谷氨酸的培养基中不生长。可以使用这一点通过谷氨酸向培养介质的补充来控制发酵过程。根据向培养介质添加的谷氨酸的数量，生长阶段的延续时间和期望的细胞密度可以在这个阶段中被有效地控制。随着数量提高，持续时间和细胞密度也将提高。当培养介质中的谷氨酸被耗尽时，进一步的生长是不可能的，所有的碳可以有效地用于琥珀酸的合成，则它的产生不与生物质的产生相竞争。如果除了基因的删除之外，编码异柠檬酸脱氢酶的同工酶的至少基因ii//^ (Contreras-Shannon等人2005)，优选的还有基因idp2和idp3被删除，通过谷氨酸的补充实现了发酵过程中生长和生产阶段的分离。异柠檬酸脱氢酶活性的实际上完全的抑制确保了为此所需的谷氨酸营养缺陷型。异柠檬酸脱氢酶活性的完全抑制的另一个优点时，在酵母菌的呼吸系统中所有的碳因而被重定向到乙醛酸循环中朝向琥珀酸的方向，不能流回 α-酮戊二酸，流回α-酮戊二酸将导致产量损失。对于特征b进行如下陈述。为了避免或降低进一步的产量损失，琥珀酸应当作为终产物被富集，不应当被酵母细胞进一步代谢。这不能通过基因SO^ 的简单删除来实现。 此外，根据本发明，由基因编码的异四聚化的酶琥珀酸脱氢酶的另一个亚基被删除。 (Kubo等人2000)检测出在具有S0^ 删除的酵母菌株中琥珀酸脱氢酶的残余活性，其通过基因的额外删除被抑制。产量损失还可能产自酶琥珀酸-半醛脱氢酶对产生的琥珀酸的进一步新陈代谢。这种酶是谷氨酸降解途径的一部分，催化琥珀酸到琥珀酸-半醛的反应。这种中间体然后通过从Y-氨基丁酸到谷氨酸被代谢。这样，不但可能发生产量损失，还可能合成α -酮戊二酸和谷氨酸，其使得通过谷氨酸补充的发酵过程控制变为不可能。因而，编码琥珀酸-半醛脱氢酶的基因卿2的额外的删除对于生产琥珀酸的优化的生产过程是有益的。对于乙醛酸循环所必需的乙醛酸不能仅从异柠檬酸裂解酶催化的反应产生，其中异柠檬酸被裂解成琥珀酸和乙醛酸，还从丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶的反应产生。 这种酶基于丙酮酸和甘氨酸催化乙醛酸和丙氨酸的产生。如果乙醛酸不必是可从异柠檬酸裂解酶反应获得的，乙醛酸循环也能通过丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶反应来确保，通过所述反应提供乙醛酸。在这种情况下，通过异柠檬酸裂解酶活性产生期望的产物，异柠檬酸裂解酶活性不是乙醛酸循环必需的，结果是，酵母菌部分地利用由丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶催化的可选择的反应用于乙醛酸的合成。然后不产生琥珀酸，其将导致产量损失。因而， 编码丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶的基因的额外的删除对于生产琥珀酸的优化的生产过程是有益的。 对于特征C)进行如下陈述。在细胞呼吸中，来自底物例如葡萄糖的碳不象发酵中那样被转化成乙醇或甘油，而是进入呼吸作用中央新陈代谢，即，进入柠檬酸循环或乙醛酸循环。当碳通过这个两个循环时，产生NADH或NADPH形式的氧化还原作用等价物，它们的电子被转移到呼吸链的第一蛋白质复合物，其位于内线粒体膜中。这些电子然后通过呼吸链的进一步的蛋白质复合物逐步地转移到最终的电子受体氧中，氧从而被还原成水。这种受控的氢氧反应释放的能量被用于对抗梯度将质子转移到线粒体的内膜腔中，当流回线粒体中时它们通过呼吸链的复合物V驱动所谓的“质子泵送”，其中产生ATP形式的能力。在发酵条件下，除了甘油之外酵母菌主要产生乙醇，并产生每分子葡萄糖ATP形式的仅2个能量等价物，相比呼吸作用，其中每个分子葡萄糖可以产生38个ATP。在发酵中，通过乙醇或甘油的合成，NADH被重新氧化成NAD，已经如同呼吸作用中，不通过电子在氧上的转移， 因为在厌氧条件下氧不是可获得的最终的电子受体。酵母菌酿酒酵母菌kSaccharomyces cerevisiae)是“Crabtree”阳性的。这是指，在初始碳来源上，例如葡萄糖，酵母菌将甚至在有氧条件下发酵并且不呼吸。这种发酵活性已经可以在培养介质中约100 mg/L葡萄糖的葡萄糖浓度下观察到，因为在这个浓度下，达到了酵母细胞的呼吸能力的极限。这一点的原因是，在存在葡萄糖的情况下，呼吸作用中央新陈代谢的大量基因，即，柠檬酸和乙醛酸循环(参见附图la^Pb))以及呼吸链的基因被转录地强烈抑制(Gancedo 1998)。这种现象也称为葡萄糖或降解代谢产物抑制。发酵是另一个方面，其可能影响琥珀酸的生物技术生产， 因为它将导致非期望的副产物的产生。在这一点上，主要是甘油、乙酸和乙醇的产生构成了难题，因为这将导致实质上的产量损失。显示Crabtree效应的所有生物体，例如，酵母菌酿酒酵母，将在甚至有氧条件下发酵。在酵母菌中琥珀酸的生物技术生产中，发酵终产物，主要为乙醇的产生，原则上不是期望的和可避免的。在有氧条件下，这能通过少量葡萄糖向培养介质的连续添加来部分地实现，这将阻止或降低葡萄糖抑制，因而在有氧条件下发酵。在厌氧条件下，氧不是可获得的最终电子受体，因而无论如何酵母菌必须发酵来再氧化NADH， 因而保留代谢活性。防止酒精发酵，即乙醇的发酵的一种可能性是消除基于丙酮酸的乙醇生物合成。为此目的，丙酮酸脱羧酶活性可以被关闭，其在酵母菌酿酒酵母中由基因彻以、 彻仏和彻访所编码的3种丙酮酸脱羧酶同工酶催化。仅通过在葡萄糖上，以及在乙醇上生长，PDC6完全微弱地表达(Velmurugan等人1997)。基因/^C 编码转录诱导物，其主要对基因彻以和/ ^的表达负责。基因/^C 因而提供了在细胞中用仅一种简单的删除来抑制由3种基因编码的丙酮酸脱羧酶活性的主要部分。当然，做为选择或另外地，基因PDC1、 PDC5和/或PDC6的一个或更多个也可以被删除。这具有很大的优势，因而成问题的乙醇产生可以仅用酵母菌中新陈代谢的一个单独的修饰来阻止。为了最小化或降低酵母菌中琥珀酸的生物技术生产的产量损失，副产物，主要是乙醇的产生应当被阻止或强烈地降低。这能通过酵母菌酿酒酵母中基因/^β 的删除来实现。因为这个删除导致基于葡萄糖的强烈受限的生长，可被抑制或诱导的启动子可以在基因/^β 的上游提供。可以被抑制的启动子确保了在生长阶段下游提供的基因的足够的转录，以及在生产阶段通过向培养介质的添加来停止转录。可以被诱导的启动子在生长阶段期间通过向培养介质添加诱导物来诱导，从而在下游提供的基因/ ^ 被充分转录，酵母培养物的生长是可能的。当诱导物被消耗尽时， 进一步的生长是不可能的，启动生产阶段。在没有丙酮酸脱羧酶活性的情况下，酵母细胞的生长是不可能的，因为没有足够的、通过乙醛和乙酸产生的乙酰-CoA可用于脂肪酸生物合成。对于特征d)进行如下陈述。柠檬酸和乙醛酸循环的不同的酶，其基因被葡萄糖转录地抑制，在蛋白质水平上也是被葡萄糖调节或灭活的目标。这些基因的单独的转录去调节因而不足以最大程度地获得活性的基因产物。对于要针对生产时间和产量进行优化的生产琥珀酸的方法来说，蛋白质水平上的灭活效果因此必需被避免。实例是乙醛酸循环的主要酶之一，异柠檬酸裂解酶。对于有机酸的有效生产必需的这种酶，在存在葡萄糖的情况下，是通过磷酸化和提高的蛋白水解降解来灭活的目标(Lopez-Boado等人1988 ；Ordiz等人1996)。对于呼吸系统，特别是乙醛酸循环的进一步的酶，也可以设想在蛋白质水平上葡萄糖诱导的负调节效果。这主要涉及乙酰-CoA合成酶(Acslp)、苹果酸合酶(Mlslp)和苹果酸脱氢酶(Mdh3p)。这些酶的葡萄糖诱导的蛋白水解降解或灭活能通过在酵母菌酿酒酵母中表达的异源同工酶来阻止。这些酶来源于天然地包含乙醛酸循环并且是“Crabtree” 阴性的微生物，因为来自这样的生物体的乙醛酸循环的酶不受葡萄糖诱导的负调节或蛋白质水平上的蛋白水解降解的影响。活性的乙醛酸循环对于以高产量在初始碳源上有效的有机酸生产是必需的。“Crabtree”阴性供体生物体例如大肠杆菌(Mscherichia cWi)、厌氧电累菌属 iAnaerobiospir i 1 Ium ) > ^ If lif M (Actinobaci llus) ^M M iMannheimia ) 或棒状杆菌属(Corynebacterium) 术语基因的删除是指基因从微生物的基因组中完全除去，和/或其编码的活性的酶从微生物中的去除。基因的灭活是指所述基因编码的酶或蛋白质的活性的降低或完全消除。这能通过常规的标准测试的方式测量相应的酶活性，或通过例如免疫学检测反应的方式的相应的酶或蛋白质的测定来验证。灭活可以例如通过基因表达(转录和/或翻译)的降低或抑制来进行。为此，例如，反义核酸的诱导(通过添加或通过核酸序列插入到基因组中， 其可以被转录成反义核酸)，向内基因突变的诱导，所述内基因降低或完全消除基因产物的活性，基因特异性DNA结合因子的诱导，例如，锌指转录因子，其引起基因表达的降低，用编码相应的但是灭活或较低活性的酶或蛋白的外源基因替换内基因。进一步的，控制相应的内基因的启动子可以被删除或突变，使得转录作用被降低或抑制。根据本发明灭活的基因或酶或提及的启动子的序列(核酸序列和/或氨基酸序列) 可以根据以下基因数据库编号获得，或在以下文献中描述了。SDHl NC_001143. 7 PDC2-. NC_001136. 8 IDPl NC_001136. 8 IDP2: NC_001144. 4 IDP3: NC_001146. 6 AGXl: NC_001138. 4 UGA2: NC_001134. 7 MLSl: X64407 S50520 ICLl: X65554
MDH3: M98763 ACSl: AY723758aceA: NC_000913. 2 acs: NC_004431. 1 aceB: NC_010473. 1 mdh: NC_000913. 2
ADHl: Lang C. , Looman A. C. , Appl Microbiol biotechnol. 44(1 - 2): 147 - 156 (1995)
tetO 和 tTA: Gari Ε.等人，Yeast 13: 837 - 848 (1997)。微生物例如酵母细胞的转化，可以按照常规的方法进行，对此参考文献khiestl R. H.,等人，Curr Genet. Dec, 16 (5-6) :339-346 (1989)，或 Manivasakam P.,等人， Nucleic Acids Res. Sep 11，21 (18): 4414—4415 (1993)，或 Morgan A. J.，Experientia Supp1. , 46 : 155-166 (1983)。适合于转化的载体，特别是质粒，例如是从以下文献已知的Naumovski L.，等人， J Bacteriol. 152 (1) :323-331 (1982), Broach J. R.,等人，Gene, 8 (1) :121-133 (1979)，Sikorski R. S.,等人，Genetics, 122 (1)_19_27 (1989)。这些载体是 Y印24、 Yepl3,pRS 载体系列，以及 YCpl9 或 pYEXBX。适合于本发明的目的的表达盒的产生一般地通过启动子与编码基因的核酸序列， 以及任选的终止子的融合，通过常规的重组和克隆技术来进行，例如在以下文献中描述的， Maniatis Τ.,等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYj USA, 1989，或Sihlavy Τ. J.,等人，Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYj USA, 1984，or Ausubel F. Μ.,等人，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience，1987。本发明进一步涉及根据本发明的微生物用于生产乙醛酸和/或柠檬酸循环的有机羧酸，特别是有机二元羧酸，优选的琥珀酸的用途，以及涉及其在生产乙醛酸和/或柠檬酸循环的有机羧酸，特别是有机二元羧酸，优选琥珀酸的方法中的用途，包括以下方法步骤:A)在生长方法步骤中，在优选的有氧条件下、任选的在添加用于诱导可被诱导的启动子的诱导物质和/或谷氨酸的情况下，培养和增殖所述微生物，B)然后，在生产阶段中，在优选的厌氧条件下，任选的在添加用于抑制可被抑制的启动子的诱导物质的情况下，培养所述微生物，C)然后在步骤B)之后或在步骤B)期间，从培养物上清液分离所述羧酸，以及任选地纯化所述羧酸。在根据本发明的方法中，优选的是进行步骤A)直到达到至少100 g干生物质/1， 优选的至少120 g/Ι，最优选的至少140 g/Ι的细胞密度。可以进行步骤B)直到达到至少 0. 4摩尔/1，优选的至少0. 8摩尔/1，最优选的至少1. O摩尔/1的羧酸浓度。在步骤A) 中，范围从4到9，优选的从6到8的pH值，范围从0. 01到0. 5摩尔/1，优选的从0. 05到 0.2摩尔/1，最优选的从0.05到0.1摩尔/1的的盐浓度可以进行调整。在步骤B)中，范围从4到9，优选的从6到8的pH值，范围从0. 01到0. 5摩尔/1，优选的从0. 05到0. 2摩尔/1，最优选的从0. 05到0. 1摩尔/1的的盐浓度可以进行调整。步骤A)优选的在20到 350C，优选28到30°C的温度进行1到1，000 h，优选的2到500 h，最优选的2到200 h。在步骤B)中，15到40°C，优选的20到35°C，最优选的观到30°C的温度，进行1到1，000 h，优选的2到500 h，最优选的2到200 h的时间是优选的。例如，步骤A)的培养介质可以是使用的WMVIII介质(Lang C.，Looman A. C., Appl Microbiol Biotechnol. 44 (1-2) :147-156 (1995))。培养介质中四环素的数量是优选的低于20 mg/L，更优选的低于10 mg/L，最优选的低于1 mg/L，低至低于检测极限的值，和/或如果使用的话，培养介质中CUS04&度优选的高于1 μΜ，最优选的高于5 μ M0 范围可以是例如1到3 μ M或3到15 μΜ。例如，步骤B)的培养介质可以是使用的WMVIII-介质，但也可以使用常规的糖蜜介质。如果使用的话，四环素的数量是优选的高于1 mg/1，最优选的高于3 mg/L·范围可以是例如1到3 mg/1或3到15 mg/L·培养介质中使用的CuSO4浓度优选低于20 μ M，更优选低于10 μ Μ，最优选低于1 μ Μ，低至低于检测极限的值。然后在步骤B)之后进行步骤C)。然后，例如通过过滤或离心，从微生物分离培养物上清液。然而，步骤C)也可以在步骤B)期间进行，并且是连续地或不连续地。在后一情况中，至少部分培养物上清液被除去并用新的培养介质替换，如果可应用的话，这个过程重复几次。从除去的培养物上清液中，获得琥珀酸。通过适合的膜，或引导培养介质流动通过用于分离琥珀酸的设备，可以进行连续分离。本发明进一步涉及生产根据本发明的微生物的方法，其中a)基因idhl和idpl被删除或灭活，和/或b)基因sdh2和sdhl被删除或灭活，和/或c)基因/^C 被删除或灭活，或处在启动子的控制之下，所述启动子能通过将微生物暴露于诱导物质来抑制或诱导， 和/或d)来自由ICL1、MLS1、ACS1和MDH3构成的组的一种或多种基因被来自Crabtree阴性生物体的相应的外源基因、或相应的多个外源基因替换或补充。原则上，对于根据本发明的微生物给出的所有解释也以类似的方式适用于根据本发明的用途和方法。上文提及的文献和下文中简短形式的引证的书目如下 Contreras-Shannon, V., A. P. Lin, Μ. T. McCammon 禾口 L. McAlister-Henn
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附图1:柠檬酸和乙醛酸循环与涉及的基因、代谢物和酶或蛋白质的示意图，以及附图2:在野生型中琥珀酸到谷氨酸的新陈代谢。在下文中，参考不同的实施例更详细地解释本发明。对于仅仅为示范性的微生物描述了根据本发明的个体特征。描述的遗传性手段当然也可以转移到其他微生物，特别是酵母菌。进一步的，各种遗传学手段也可以在其他的组合中提供。实施例1:利用在转录上和蛋白质水平上不受葡萄糖抑制影响的乙醛酸循环的微生物的产生，用于生产呼吸作用中央新陈代谢的有机酸，特别是琥珀酸。柠檬酸和乙醛酸循环的不同的酶，其基因被葡萄糖转录地抑制，是酵母菌酿酒酵母中以及在蛋白质水平上被葡萄糖调节或灭活的目标。这些基因的转录去调节因而不足以最大程度地获得活性的基因产物。因而，对于要针对生产时间和产量进行优化的生产琥珀酸的方法来说，蛋白质水平上的灭活效果也必需被阻止。乙醛酸循环的酶的葡萄糖诱导的蛋白水解降解或灭活能通过在酵母菌酿酒酵母中表达的异源同工酶来阻止。这些酶来源于天然地包含乙醛酸循环并且是“Crabtree” 阴性的微生物，因为来自这样的生物体的乙醛酸循环的酶不受葡萄糖诱导的负调节或蛋白质水平上的蛋白水解降解的影响。供体生物体可以是，例如，大肠杆菌(Escherichia coli)、厌氧螺菌属(Anaerobiospirillum)、方文线杆菌属(Actinobacillus)、曼氏杆菌属 (Mannheimia)和棒状杆菌属(Corynebacterium)。这些酶的转录去调节能通过将相应的基因置于组成型启动子的控制下来实现。为此，基因acs (乙酰-CoA合成酶)、卿A (异柠檬酸裂解酶)、aceB (苹果酸合酶 k),mdh (苹果酸脱氢酶)通过PCR的方式从菌株五coli JM109的细菌DNA扩增，并装上限制性接头，然后在组成型ADHl启动子的控制之下整合到酵母菌染色体中。对于这个基因在酵母菌酿酒酵母中去调节的表达，使用组成型^ 启动子，其由非常长时间上天然序列的修饰而产生，来进行独立于葡萄糖和乙醇的组成型表达(Lang和Looman 1995)。g ADHlprom-acs (aceA, aceB, fflt/力)-TRPlterm.的表达盒的编码核酸序列通过利用标准方法的PCR从载体pFlatl-acs (aceA, aceB, 中扩增。获得的DNA片段在Klenow处理之后钝端克隆到载体pUG6的EcoRV接口中，产生载体pUGe-acs (aceA,aceB, mdh\在质粒分离之后，通过PCR方式从载体pUGe-acs CaceA, aceB,扩增
扩展的片段，从而产生的片段由以下成分组成loxP-kanMX-loxP-ADHl-prom-acs CaceA, aceB,色氨酸终止子。引物是选择的寡核苷酸序列，其在5’和3’突出处分别含有
acs (aceA, aceB, 基因的5’或3’序列，以及在退火的区域含有IoxP区域的5’和色氨酸终止子的3’的序列。因而，这确保了，在一个方面，包括KanR和acs的完整片段(acd， aceB, 被扩增，另一方面，这个片段然后可以转化到酵母菌中，并通过同源重组将这个完整片段整合到酵母菌的相应基因座中。选择标志物提供了针对G418的相应的抗性。然后为了再次除去针对G418的抗性， 相应的形成的酵母菌株用ere重组酶载体pSH47 (Guldener等人1996)转化。通过这种载体，酵母菌中的ere重组酶被表达，结果是两个IoxP序列内的序列区域重新组合出来。结果是，两个IoxP序列的仅一个和相应的表达盒仍然包含在初始的相应基因座中。结果是，酵母菌株再次失去G418抗性，因而通过酵母菌株中这种cre-lox系统的方式适合于整合或除去另外的基因。载体PSH47然后能通过在补充尿嘧啶(20 mg/L)和FOA (5-氟乳清酸)(1 g/L)的YNB琼脂平板上反选择来再次除去。为此，带有这个质粒的细胞必需首先在非选择性条件下培养，然后在含有FOA的选择平板上抽取。在这些条件下，仅那些自己不能合成尿嘧啶的细胞可以生长。在这种情况下，这些是不再含有任何质粒(PSH47)的细胞。实施例2:用于琥珀酸和其他有机酸的生物技术生产的微生物的产生，其通过降低产量损失使得更有效的生产过程成为可能。为了降低酵母菌酿酒酵母中琥珀酸的生物技术生产期间的产量损失，琥珀酸必需作为终产物富集，并且必需不被酵母细胞进一步代谢。这不能通过基因sdh2的简单删除来最大程度地实现。此外，由基因编码的异四聚化的酶琥珀酸脱氢酶的另一个亚基必须被删除。产量损失还可能产自通过酶琥珀酸半醛脱氢酶对形成的琥珀酸的进一步新陈代谢。这种酶是谷氨酸降解途径的一部分，催化琥珀酸到琥珀酸-半醛的反应。这种中间体然后被Y-氨基丁酸代谢成谷氨酸。这样，不但可能发生产量损失，还可能合成α-酮戊二酸和谷氨酸，其使得通过谷氨酸补充的发酵过程控制变为不可能。因而，编码琥珀酸-半醛脱氢酶的基因卿2的额外的删除对于生产琥珀酸的优化的生产过程是有益的。对于乙醛酸循环所必需的乙醛酸不能仅从异柠檬酸裂解酶催化的反应产生，其中异柠檬酸被裂解成琥珀酸和乙醛酸，还从丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶的反应产生。这种酶基于丙酮酸和甘氨酸催化乙醛酸和丙氨酸的产生。如果乙醛酸不必然地通过异柠檬酸裂解酶反应来提供，乙醛酸循环也能通过丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶反应的反应来确保，通过所述反应提供乙醛酸。在这种情况下，通过异柠檬酸裂解酶活性产生期望的产物，异柠檬酸裂解酶活性不是乙醛酸循环必需的，结果是，酵母菌部分地利用由丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶催化的可选择的反应用于乙醛酸合成。其中，不产生可能导致产量损失的琥珀酸。因而，编码丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶的基因3#7的额外的删除对于生产琥珀酸的优化的生产过程是有益的。idhl删除不导致异柠檬酸脱氢酶活性的完全消失。其理由是异柠檬酸脱氢酶的 3种另外的同工酶，对于α -酮戊二酸的产生，它们可以补偿由基因IDHl和7 编码的二聚的主要酶的缺失。除了基因的删除之外，至少编码异柠檬酸脱氢酶的同工酶的基因idpl也必需被删除，以完全地阻止对葡萄糖的异柠檬酸脱氢酶活性。异柠檬酸脱氢酶活性的完全抑制具有优点是，酵母菌的呼吸系统中的所有的碳被重定向到乙醛酸循环中朝向琥珀酸的方向，不能流到将导致产量损失的α-酮戊二酸。简言之，除了基因sdh2和idhl之外，通过删除基因sdhl、agxl、uga2和idpl，在酵母菌中琥珀酸的生物技术生产期间的产量损失可以被最小化或降低。为此，删除盒loxP-kanMX-loxP的编码核酸序列通过使用标准方法的PCR从载体 pUG6扩增(Guldener等人1996)，从而产生的片段由以下成分组成loxP-kanMX_loxP。引物是选择的寡核苷酸序列，其在5’和3’突出处分别含有要删除的基因(5^7,3^^4^^, idpl)的天然座位的起始和末端的5’或3’序列，以及在退火区域含有IoxP区域的5’和第二 IoxP区域的3’的序列。因而，它确保了，在一方面，完整片段loxP-kanMX-loxP被扩增，另一方面，这个片段然后被转化到酵母菌中，通过同源重组将这个完整片段整合到酵母菌的要删除的基因座中。选择标志物提供了针对G418的抗性(由kanMX编码)。然后为了再次除去针对G418 的抗性和容许进一步使用kanMX标志物，形成的酵母菌株用ere重组载体pSH47(Guldener 等人1996)转化。通过这种载体，酵母菌中的ere重组酶被表达，结果是两个IoxP序列内的序列区域重新组合出来。结果是，两个IoxP序列的仅一个序列保留在删除的基因座处 (.sdhl,agxl,uga2,idpl).结果是，酵母菌株再次失去G418抗性，因而通过酵母菌株中这种 cre-lox系统的方式适合于整合或除去另外的基因。载体pSH47然后能通过在补充尿嘧啶 (20 mg/L)和FOA (5-氟乳清酸)(1 g/L)的YNB琼脂平板上反选择来再次除去。为此，带有这个质粒的细胞必需首先在非选择性条件下培养，然后在含有FOA的选择平板上抽取。 在这些条件下，仅那些自己不能合成尿嘧啶的细胞可以生长。在这种情况下，这些是不再含有任何质粒(PSH47)的细胞。这样，要删除的所有基因Qsdhl, agxl, uga2, idpl)被迭代地删除。表1 示范性地显示了，在 3. 52 g/Ι 硫酸铵和 0. 05 M Na2HPO4 和 0. 05 M NaH2HPO4 作为缓冲液、具有组氨酸100 mg/1、亮氨酸400 mg/1、尿嘧啶100 mg/1的WM8介质(Lang 和Looman，1995)中培养表格中提及的菌株72小时之后，通过上述删除的产量提高。C源是5%葡萄糖。接种用来自48 h预培养物以1%进行。培养在30°C和150 rpm的摇晃孵化器上100 ml摇瓶中进行。由于菌株5和6不在没有谷氨酸的介质中生长，首先生物质用这些菌株在具有谷氨酸钠和葡萄糖5%的75 ml标准WM8介质中在250 mL挡板烧瓶(Schikanekolbe)中产生。 细胞在上述介质中洗涤和重悬浮用于进一步培养。表1:提及的菌株在上述条件下在WM8介质中72小时培养之后的琥珀酸滴度。 在表1中可以看出，与野生型相比，所有进行的删除导致培养上清液中更高的琥珀酸数量。四删除突变种AXa^raJ」sdh2A sdhl Δ idhl Δ idpl富集了最高数量的琥珀酸。用其他微生物或酵母菌也获得了相应的结果。实施例3:用于琥珀酸和其他有机酸的生物技术生产的微生物的产生，其通过降低副产物产生，特别是乙醇和乙酸，使得更有效的生产过程成为可能。发酵是另一个主要方面，其对于琥珀酸的生物技术生产是不利的，因为它将导致非期望的副产物的产生。在这一点上，主要是乙酸和乙醇的产生构成了难题，因为这将导致严重的产量损失。防止酒精发酵，即形成乙醇的一种可能性是关闭基于丙酮酸的乙醇生物合成。从而，通过乙醛的乙酸产生也被阻止。为此目的，丙酮酸脱羧酶活性必须被关闭，其在酵母菌酿酒酵母中由基因/ 1/、PDC5和PDC6所编码的3种丙酮酸脱羧酶同工酶催化。基因PDC2 编码转录诱导物，其主要对基因/ 1/和/ ^的表达负责。因而，基因/^C 提供了用一个单独的删除来消除由细胞中3种基因编码的丙酮酸脱羧酶活性的主要部分的可能性。这具有很大的优势，从而成问题的乙醇产生可以仅用酵母菌中新陈代谢的单个修饰来阻止。这能通过酵母菌酿酒酵母中基因/^β 的删除来实现。因为这个删除导致在葡萄糖上强烈受限的生长，可以被诱导的启动子可以连接到基因/^β 的上游。可以被诱导的启动子在生长阶段期间通过向培养介质添加诱导物来诱导，从而下游基因/^β 被充分转录， 确保了酵母培养物的生长。当诱导物被耗尽时，进一步的生长是不可能的，启动了没有乙醇和乙酸形式的副产物产生的生产阶段。可被诱导的启动子，CUPl启动子被选择，染色体地整合到基因/^C 的“开放阅读框”之前，从而后者在可由铜诱导的CUPl启动子的控制下。对此，CPUl启动子盒的编码核酸序列利用标准方法通过PCR扩增，从而产生的片段由以下成分组成l0XP-kanMX-l0XP-CUPlpr。作为引物，选择寡核苷酸序列，其在5’和3’ 突出分别含有/^β 基因的天然启动子的5’或3’序列，以及在退火区域中含有IoxP-区域的5’和CUPlprom的3’的序列。因而，这确保了，在一个方面，包括kanMX和CUPl启动子的完整片段被扩增，另一方面，这个片段然后可以转化到酵母菌中，并通过同源重组将这个完整片段整合到酵母菌的PDC2基因座中，基因PDC2的编码区域之前。选择标志物提供了针对G418的抗性。产生的菌株含有处在铜调节的CUPl启动子以及天然/^β 终止子控制下的基因/^β 的拷贝。然后为了再次除去针对G418的抗性，相应的形成的酵母菌株用ere重组酶载体pSH47 (Guldener等人1996)转化。通过这种载体，酵母菌中的cre重组酶被表达，结果是两个IoxP序列内的序列区域重新组合出来。结果是，两个IoxP序列的仅一个以及CUPl启动子盒仍然包含在基因/^C 的编码序列之前。 结果是，酵母菌株再次失去G418抗性，因而通过酵母菌株中这种cre-lox系统的方式适合于整合或除去另外的基因。载体PSH47然后能通过在补充尿嘧啶(20 mg/L)和FOA (5-氟乳清酸)(1 g/L)的YNB琼脂平板上反选择来再次除去。为此，带有这个质粒的细胞必需首先在非选择性条件下培养，然后在含有FOA的选择平板上抽取。在这些条件下，仅那些自己不能合成尿嘧啶的细胞可以生长。在这种情况下，这些是不再含有任何质粒(PSH47)的细胞。实施例4:用于琥珀酸和其他有机酸的生物技术生产的微生物的产生，其通过谷氨酸补充使得生长和生产阶段的分离成为可能。在下文中，描述了生长和生产阶段的分离的可能性，其不需要使用抗生素。在酵母菌酿酒酵母中，不考虑导致柠檬酸循环中断的基因SiZAi^niofei的删除，(参见附图1，黑色十字)，可以测量生长速度，其与未修饰的野生型酵母菌是可比较的(在在100 ml摇瓶的YDP 介质中，菌株AH22ura3 Δ HKidhl具有与菌株AH22ura3 (野生型)相比仅低11%的生长速度，来源自有数据)。具有删除的酵母菌株的生长是可能的，只是因为这个删除不导致异柠檬酸脱氢酶活性的完全消失。这的理由是异柠檬酸脱氢酶的3种另外的同工酶，对于α-酮戊二酸的产生，它们可以补偿由基因IDHl和IDH2编码的二聚的主要酶的缺失。α -酮戊二酸的合成是酵母细胞在最小培养基上的生长绝对必需的，因为氨基酸谷氨酸从这个中间体产生，没有谷氨酸不可能有生长。在用酵母菌生产琥珀酸的2步发酵过程中，因而生长和生产阶段的有效分离仅通过生产菌株中异柠檬酸脱氢酶活性的完全抑制才是可能的，因为由此确保了谷氨酸营养缺陷型，结果是酵母菌在没有补充的谷氨酸的培养基中不生长。这可以用于通过谷氨酸向培养介质的补充来控制发酵过程。根据向培养介质添加的谷氨酸的数量，生长阶段的时间和期望的细胞密度可以在这个阶段中被有效地控制。随着数量提高，持续时间和细胞密度也将提高。当培养介质中的谷氨酸被耗尽时，进一步的生长是不可能的，所有的碳可以有效地用于琥珀酸的合成，则它的产生不与生物质的产生相竞争。这实质上促进了产量的提高和生产过程的效力的提高。如果除了基因的删除之外，至少编码异柠檬酸脱氢酶的同工酶的基因idpl也被删除，通过谷氨酸的补充在葡萄糖和其他可发酵的碳源上发酵过程中生长和生产阶段的分离才能实现。异柠檬酸脱氢酶活性的完全抑制才确保了必要的谷氨酸营养缺陷型。异柠檬酸脱氢酶活性的完全抑制的另一个优点是，因而酵母菌的呼吸系统中所有的碳被重定向到乙醛酸循环中琥珀酸的方向，不能流出到导致产量损失的α-酮戊二酸 (参见附图le)。为此，删除盒loxP-kanMX-loxP的编码核酸序列通过使用标准方法的PCR从载体 pUG6扩增(Guldener等人1996)，从而产生的片段由以下成分组成loxP-kanMX_loxP。引物是选择的寡核苷酸序列，其在5’和3’突出处分别含有要删除的基因i办7的天然基因座的起始和末端处的5’或3’序列，以及在退火区域含有IoxP区域的5’和第二 IoxP区域的 3’的序列。因而，它确保了，在一方面，完整片段loxP-kanMX-loxP被扩增，另一方面，这个片段然后被转化到酵母菌中，通过同源重组将这个完整片段整合到酵母菌的要删除的基因座中。选择标志物提供了针对G418的相应抗性(由kanMX编码)。然后为了再次除去针对 G418的抗性和由此容许进一步使用kanMX标志物，形成的酵母菌株用ere重组载体pSH47 (Guldener等人1996)转化。通过这种载体，酵母菌中的ere重组酶被表达，结果是两个 IoxP序列内的序列区域重新组合出来。结果是，两个IoxP序列的仅一个保留在删除的基因座/办7上。结果是，酵母菌株再次失去G418抗性，因而通过酵母菌株中这种cre-lox系统的方式适合于整合或除去另外的基因。载体PSH47然后能通过在补充尿嘧啶(20 mg/L) 和FOA (5-氟乳清酸)(1 g/L)的YNB琼脂平板上反选择来再次除去。为此，带有这个质粒的细胞必需首先在非选择性条件下培养，然后在含有FOA的选择平板上抽取。在这些条件下，仅那些自己不能合成尿嘧啶的细胞可以生长。在这种情况下，这些是不再含有任何质粒 (PSH47)的细胞。生产菌株AH22ura3 Δ sdhl Δ sdh2 AiVAi Δ idpl评估有和没有补充的谷氨酸的情况下它的生长性质。采用AH22ura3AsdhlAsdh2Aii/A7作为参考菌株，其是没有idpl的额外删除的菌株。两个菌株在100 ml烧瓶中的20 ml WM8介质中培养，3. 52 g/Ι硫酸铵(作为氮源)， 0.05 M K2HPO4 和 0.05 M KH2HPO4 作为缓冲液，在标准的 WM8 介质(Lang 和 Looman 1995) 中，其含有10 g谷氨酸钠作为氮源。64h之后，测定4个培养物的光密度。结果在表2中示
出ο表2 在有和没有谷氨酸的WM8介质中64小时培养之后提及的菌株的光密度。在没有谷氨酸的介质中，补充NH3SO4作为氮源。
菌株有谷氨酸钠的WM8中的0D600/ml没有谷氨酸钠的WM8中的0D600/mllAH22ura3Δsdh2Δ sdhlΔ idhl26. 4102AH22ura3 Δ sdh2 Δ sAhl Mdhl Δ idpl29. 50 在表2中可以看出，菌株中idpl的额外删除导致在葡萄糖上的谷氨酸营养缺陷型，因为菌株m22\xr。Lsdh2 Lsdhl Δ idhl Δ idpl在没有谷氨酸的介质中不显示生长， 与L sdh2 L sdhl L idhl不。ii/^W的单独的删除不导致谷氨酸营养缺陷型。通过谷氨酸补充在葡萄糖上生产琥珀酸和其他有机酸的2步生产过程中生长和生产阶段的分离，仅在具有删除的基因和iW的菌株中是可能的。当添加其他氮源，例如硫酸铵时，」IdhlAidpl突变种的生长在极低数量的补充的谷氨酸(约20 mg/1)的最小培养基中是可能的。
权利要求
1.分离的遗传修饰的微生物，其中与野生型相比，a)idhl和idpl基因被删除或灭活，和/或b)sdh2和sdhl基因被删除或灭活，和/或基因被删除或灭活，或处在启动子的控制之下，所述启动子能通过所述微生物暴露于诱导物质来抑制或诱导，和/或d)来自由ICL1、MLS1、ACS1和MDH3构成的组的一种或多种基因被来自Crabtree阴性生物体的一个相应的外源基因或多个相应的外源基因替换或补充。
2.根据权利要求1的微生物，其中除了基因idhl和idpl之外，基因idp2或idp3之一或这两个基因被删除或灭活。
3.根据权利要求1或2的微生物，其中除了基因sdh2和sdhl之外，基因uga2或agxl 之一或这两个基因被删除或灭活。
4.根据权利要求1到3之一的微生物，其中连接在基因/^β 上游的启动子是可以被诱导的启动子，例如，CUPl。
5.根据权利要求1到3之一的微生物，其中连接在基因/^β 上游的启动子是可以被抑制的启动子，例如，四环素调节的tetO启动子。
6.根据权利要求1到5之一的微生物，其中所述外源基因来源于来自以下构成的组的 Crabtree阴性生物体大肠杆菌、厌氧螺菌属、放线杆菌属、曼氏杆菌属、根霉属、棒状杆菌属、裂殖酵母属、威克酵母属、德巴利酵母属、汉逊酵母属、有孢汉逊酵母属、毕赤氏酵母属、 克勒克酵母属、念珠菌属、Ogataea, Kuraishia, Komagatael la、耶氏酵母属、梅奇酵母属属、 ffilliopsis, Nakazawaea、克卢费氏酵母属、隐球酵母属、有孢圆酵母属、布勒掷孢酵母属、 红酵母属、Willopsis、克勒克酵母属、丝孢酵母(Trichosporon)、Yamadazmya和掷孢酵母 jM ο
7.根据权利要求1到6之一的微生物，其中所述外源基因处在组成型活性启动子，例如，ADHl启动子的控制下。
8.根据权利要求1到7之一的微生物，其中所述微生物是酵母菌，优选选自以下构成的组酿酒酵母、酵母属、Saccharomycecopsis、类酵母属、裂殖酵母属、威克酵母属、德巴利酵母属、汉逊酵母属、有孢汉逊酵母属、毕赤氏酵母属、克勒克酵母属、念珠菌属、接合酵母属、 Ogataea、Kurai shia、Komagatael la、耳氏酵母属、梅奇酵母属、Wi 11 iopsi s、Nakazawaea、克卢费氏酵母属、隐球酵母属、有孢圆酵母属、布勒掷孢酵母属、红酵母属、Willopsis、克勒克酵母属和掷孢酵母属。
9.根据权利要求1到8之一的微生物用于生产乙醛酸和/或柠檬酸循环的有机羧酸， 特别是有机二元羧酸，优选琥珀酸的用途。
10.根据权利要求1到8之一的微生物在生产乙醛酸和/或柠檬酸循环的有机羧酸，特别是有机二元羧酸，优选琥珀酸的方法中的用途，包括下列方法步骤A)在生长方法步骤中，在优选有氧条件下、任选的在添加用于诱导可被诱导的启动子的诱导物质和/或谷氨酸的情况下，培养和增殖所述微生物，B)然后，在生产阶段中，在优选厌氧条件下，任选的在添加用于抑制可被抑制的启动子的诱导物质的情况下，培养所述微生物，C)在步骤B)之后或在步骤B)期间，从培养物上清液分离所述羧酸，以及任选地纯化所述羧酸。
11.根据权利要求10的用途，其中进行步骤A)直到达到至少100g干生物质/1，优选至少120 g干生物质/1，最优选至少140 g干生物质/1的细胞密度。
12.根据权利要求10或11之一的用途，其中进行步骤B)直到达到至少0.4摩尔/1， 优选至少0. 8摩尔/1，最优选至少1. 0摩尔/1的羧酸浓度。
13.根据权利要求10到12之一的用途，其中在20到35°C，优选观到30°C的温度进行步骤A) 1到1，000 h，优选2到500 h，最优选2到200 h。
14.根据权利要求10到13之一的用途，其中在15到40°C，优选20到25°C的温度进行步骤B) 1到1，000 h，优选2到500 h，最优选2到200 h。
15.生产根据权利要求1到8之一的微生物的方法，其中a)idhl和idpl基因被删除或灭活，和/或b)sdh2和sdhl基因被删除或灭活，和/或基因被删除或灭活，或处在启动子的控制之下，所述启动子能通过将所述微生物暴露于诱导物质来抑制或诱导，和/或d)来自由ICL1、MLS1、ACS1和MDH3构成的组的一种或多种基因被来自Crabtree阴性生物体的一个相应的外源基因或多个相应的外源基因替换或补充。
全文摘要
本发明涉及分离的遗传修饰的微生物，其中与野生型相比，a)idh1和idp1基因已经被删除或灭活，和/或b)sdh2和sdh1基因被删除或灭活，和/或c)PDC2基因被删除或灭活，或处在启动子的控制之下，所述启动子能通过将微生物暴露于诱导物质来抑制或诱导，和/或d)来自由ICL1、MLS1、ACS1和MDH3构成的组的一种或多种基因被来自Crabtree阴性生物体的一个相应的外源基因、或多个相应的外源基因替换或补充。
文档编号C12N1/18GK102257152SQ200980151009
公开日2011年11月23日 申请日期2009年10月7日 优先权日2008年10月17日
发明者拉布 A., 兰 C. 申请人:器官平衡有限责任公司