专利名称：Ires介导的gh四种亚型与igf-i双顺反子真核共表达载体的构建与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域。尤其是涉及IRES介导的人生长激素(GH)的四种亚型 (22kD、20kD、17kD、5kD)与IGF-I的双顺反子真核共表达载体的构建方法及应用。
背景技术：
人生长激素(human Growth Hormone, GH)是由垂体分泌的最主要的内分泌激素。 GH在代谢和脂解作用上有很多有益效应，如运动时增加心输出量和脂解作用，改善内环境 的热稳定，提供能量以加强耐力运动，并且可能增加韧带强度和创伤愈合率，并且可以促 进蛋白合成和骨骼生长。GH经循环系统与GH受体结合刺激肝脏产生胰岛素样生长因子 Kinsulin-like growthfactor I，IGF-I)，是其最主要的影响因素。IGF-I是一种既具有 促进细胞分化和增殖活性又具有胰岛素样作用的多肽，可通过促进骨祖细胞及成骨样细胞 的增殖和分化等多种机制而发挥保护骨量的作用。GH和IGF-I在内分泌、代谢和合成作用方面有很多相同的地方但是在糖代谢、胰 岛素敏感度和成骨细胞上的作用又各不相同。理论上，GH和IGF-I联合使用治疗疾病，会比 它们单独使用的效果更好。理由如下1)当两者共同使用时，IGF-I的清除率将显著降低， IGF-I可持久的发挥作用。2)两者联合使用，使血清中IGF-I的含量要比它们各自单独使 用时要高，联合使用可能有更好的协同和叠加作用。3)联合使用还可以使GH和IGF-I在糖 代谢上的副作用相互抵消。4)在联合治疗中，GH可以不通过IGF-I而直接作用于特定靶组
幺口
/Ν οGH和IGF-I联合治疗对生长迟缓的治疗是有益的，尤其是在患有代谢综合征和显 性糖尿病的生长激素缺乏症中，因此，将GH和IGF-I构建成真核共表达载体进行基因治疗 是一种非常具有潜力的治疗生长激素缺乏症的治疗方法。内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)序列具有不依赖于 5 ‘帽子结构的翻译起始功能，可翻译一条mRNA上两个相对独立的开放读码框，其转录产 物在翻译时核糖体能同时进入并起始翻译IRES序列上下游的2个转录子，所以可通过IRES 介导将GH和IGF-〗构建成真核共表达载体。而GH在人体内主要有22kD、20kD、17kD、5kD四种亚型，GH与IGF-I的相互作用， 主要基于GH亚型22kD的研究，其余三种亚型研究较少。而本发明则是同时构建这四种亚 型与IGF-I的双顺反子真核共表达载体，为研究GH与IGF-I联合治疗奠定了基础，也为研 究GH四种亚型基因与IGF-I基因的相互作用提供了原材料和研究基础。
发明内容
本发明的目的是构建IRES介导的GH四种亚型(22kD、20kD、17kD、5kD)与IGF-I 的双顺反子真核共表达载体，可以在活体动物中产生一定的生物学功能，并最终运用于临 床的基因治疗。
本发明所述IRES介导GH的四种亚型(22kD、20kD、17kD、5kD)与IGF-I的双顺反 子真核共表达载体是通过以下方法构建获得的1、GH四种亚型和IGF-I目标DNA的克隆根据Genebank公布的GH的mRNA序列和蛋白序列对比得出GH四种亚型编码序 列22kD的编码序列是序列l，20kD的编码序列是序列2，17kD的编码序列是序列3，5kD的 编码序列是序列4。设计GH引物，并在上下游引物的5’端分别加上XhO I和EcoR I的限 制性内切酶位点，在上游加入atg起始密码子，22kD引物(上游5-ccgctcgagatgttcccaac cattcccttatc-3 ；下游5_cggaattcttatcagaagccacagctgccctc_3) ；20kD 弓丨物(上游5_c cgctcgagatgttcccaaccattcccttatc-3 ；下游5_cggaattcttatcagaagccacagctgccctc_3)； 17kD 弓丨物(上游5_ccgctcgagatgttcctgcagaacccccag_3 ；下游5_cggaattcttatcagaagc cacagctgccctc-3) ；5kD 弓丨物(5-ccgctcgagatgttcccaaccattcccttatc_3,下游5_cggaatt cttatcatgaatacttctgttcctttgg-3)。根据Genebank公布的IGF-I的mRNA序列和蛋白序列对比得出的编码序列(序 列5)设计IGF-I的引物，并在上下游引物的5，端分别加上Sam I和Not I的限制性内切 酶位点，在上游加入atg起始密码子，IGF-I引物(上游5，-ttcccgggatgggaccggagacgctc tg-3' ；Tffif 5' -ttgcggccgcctattaagctgacttggcaggcttg-3' )。 ^h Taq mix( MiIfPPjfe^ 司)的作用下以实验室的GH和IGF-I的DNA为模板，94°C预变性5min ；94°C 30s, 56°C 30s， 72 °C 30s ； 50 μ L体系30个循环，72°C延伸7min。扩增出GH四种亚型的目标条带约为573bp、 528bp、444bp 和 129bp ；IGF-I 的目标条带约为 210bp。2、GH四种亚型和IGF-I的TA载体的构建GH和IGF-I的PCR产物经1 %的琼脂糖凝胶电泳纯化后按照1 10的比例与 PBS-T载体(天根生物公司)在T4连接酶的作用下，置4°C 16小时进行连接反应。反应结 束后，取10 μ L的连接产物转化100 μ L的感受态大肠杆菌Top 10，取100 μ L的转化产物涂 布于含有50g/mL青霉素和0. 8mg IPTG以及0. Smg的Χ-gal的LB固体培养基上进行蓝白 斑筛选，37°C培养18小时后，挑取白色单菌落，加入含50 μ g/mL青霉素的LB液体培养基置 37°C培养16小时后提取质粒，即为GH四种亚型和IGF-I的TA载体。3、GH四种亚型和IGF-I的TA载体的酶切提取GH四种亚型的TA载体，进行XhO I和EcoR I双酶切，再提取IGF-I的TA载 体，进行Sam I和Not I双酶切，酶切产物经1 %的琼脂糖凝胶电泳后，用回收试剂盒进行小 片段回收，并存于-20°C备用。4、pCI_IRES 的提取、酶切提取pCI-IRES的质粒后，进行XhO I和EcoR I双酶切，酶切产物经1 %的琼脂糖 凝胶电泳后，用回收试剂盒进行大片段回收，并存于-20°C备用。5、GH四种亚型与pCI-IRES的连接GH四种亚型基因片段和pCI-IRES载体片段以1_10 1的摩尔比在T4连接酶的 作用下，置4°C 16小时进行连接反应。10 μ L的连接产物转化100 μ L的感受态大肠杆菌 ToplO，取100 μ L的转化产物涂布于含有50 μ g/mL青霉素的LB固体培养基上，培养18小 时后，挑取单菌落，加入含50 μ g/mL青霉素的LB液体培养基置37°C培养16小时后提取质 粒，即为重组基因载体 pCI-22-IRES、pCI-20-IRES、pCI-17-IRES、pCI-5-IRES。
6、GH的重组质粒的提取、酶切提取pCI-22-IRES、pCI-20-IRES、pCI-17-IRES、pCI-5-IRES 重组质粒，进行 Sam I 和Not I双酶切，酶切产物经的琼脂糖凝胶电泳后，用回收试剂盒进行大片段回收，并 存于-20°C备用。7、IGF-I与GH四种亚型重组质粒的连接IGF-I 的基因片段分别和 pCI-22-IRES、pCI_20_IRES、pCI-17-IRES、pCI-5-IRES 载体片段以1-10 1的摩尔比在T4连接酶的作用下，置4°C 16小时进行连接反应。 10 μ L的连接产物转化100 μ L的感受态大肠杆菌ToplO，取100 μ L的转化产物涂布于含 有50μ g/mL青霉素的LB固体培养基，37 °C培养18小时后，挑取单菌落，加入含50 μ g/ mL青霉素的LB液体培养基置37°C培养16小时后提取质粒，即为IRES介导的GH四种亚 型(22kD、20kD、17kD、5kD)与 IGF-I 的双顺反子真核共表达载体pCI-22-IRES-IGF_I、 pCI-20-IRES-IGF-I、pCI-17-IRES-IGF-I、pCI-5-IRES-IGF-I。本发明的有益结果是所提供的pCI-22-IRES-IGF-I、pCI-20-IRES-IGF-I、 pCI-17-IRES-IGF-I、pCI-5-IRES-IGF-I重组质粒经酶切和测序证实其中含有的GH 四种亚型和IGF-I的序列与Gene Bank公布的序列相同。将pCI-22-IRES-IGF-I、 pCI-20-IRES-IGF-I、pCI-17-IRES-IGF-I、pCI-5-IRES-IGF-I 导入小鼠左腿肌肉中，可以发 现其影响了小鼠血清中的IGF BP-2和IGF BP-3的变化。该发明将为广大科研人员进一步 研究GH的四种亚型和IGF-I的生物学特性和功能提供了一个方便有效的基本资料，也为研 究GH与IGF-I联合治疗奠定了基础，同时也为研究GH四种亚型基因与IGF-I基因的相互 作用提供了原材料和研究基础。
图 1 是本发明的 pCI-22-IRES-IGF-I、pCI-20-IRES-IGF-I、pCI-17-IRES-IGF-I 和 pCI-5-IRES-IGF-I四种重组质粒经XhO I和EcoR I双酶切鉴定电泳图；图 2 是本发明的 pCI-22-IRES-IGF-I、pCI-20-IRES-IGF-I、pCI-17-IRES-IGF-I 和 pCI-5-IRES-IGF-I四种重组质粒经Sam I和Not I双酶切鉴定电泳图；图 3 是本发明的 pCI-22-IRES-IGF-I、pCI-20-IRES-IGF-I、pCI-17-IRES-IGF-I 和 pCI-5-IRES-IGF-I四种重组质粒经Sam I和EcoR I双酶切鉴定电泳图；图 4 是本发明的 pCI-22-IRES-IGF-I、pCI-20-IRES-IGF-I、pCI-17-IRES-IGF-I 和 pCI-5-IRES-IGF-I四种重组质粒导入昆明鼠的左腿肌肉后小鼠血清中的IGF BP-2在13周 内的变化；图 5 是本发明的 pCI-22-IRES-IGF-I、pCI-20-IRES-IGF-I、pCI-17-IRES-IGF-I 和 pCI-5-IRES-IGF-I四种重组质粒导入昆明鼠的左腿肌肉后小鼠血清中的IGF BP-3在13周 内的变化。
具体实施例方式1、GH四种亚型和IGF-I目标DNA的克隆根据Genebank公布的GH的mRNA序列和蛋白序列对比得出GH四种亚型的编码序 列22kD的编码序列是序列l，20kD的编码序列是序列2，17kD的编码序列是序列3，5kD的编码序列是序列4。设计GH引物，并在上下游引物的5’端分别加上XhO I和EcoR I的限 制性内切酶位点，在上游加上atg起始密码子，22kD引物(上游5-ccgctcgagatgttcccaac cattcccttatc-3 ；下游5_cggaattcttatcagaagccacagctgccctc_3) ；20kD 弓丨物(上游5_c cgctcgagatgttcccaaccattcccttatc-3 ；下游5_cggaattcttatcagaagccacagctgccctc_3)； 17kD 弓丨物(上游5_ccgctcgagatgttcctgcagaacccccag_3 ；下游5_cggaattcttatcagaag ccacagctgccctc-3) ；5kD 弓丨物(5-ccgctcgagatgttcccaaccattcccttatc_3,下游5_cggaat tcttatcatgaatacttctgttcctttgg-3)；根据Genebank公布的IGF-I的mRNA序列和蛋白序列对比得出编码序列(序列5) 设计IGF-I的引物，并在上下游引物的5’端分别加上Sam I和Not I的限制性内切酶位点， 在上游加入 atg 起始密码子，IGF-I 引物(上游5，-ttcccgggatgggaccggagacgctctg-3，； 下游5' -ttgcggccgcctattaagctgacttggcaggcttg-3')；在Taq mix(盈信阳光公司)的作用下以实验室的GH和IGF-I的DNA为模板， 94°C预变性 5min ；94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 30s ；50 μ L 体系 30 个循环，72°C延伸 7min。扩 增出GH四种亚型的目标条带约为573bp、528bp、444bp和129bp ；IGF-I的目标条带约为 210bp。反应体系为模板质粒，1.0 μ L(浓度约1 μ g)；上游引物，1.0 μ L(IOyM)；下游引 物，1.0 μ L(IOyM) ；2*PCRmix，10μ L ；ddH20,7y L02、GH四种亚型和IGF-I的TA载体的构建GH和IGF-I的PCR产物经1 %的琼脂糖凝胶电泳纯化后按照1 10的比例与 PBS-T载体(天根生物公司)在T4连接酶的作用下，置4°C 16小时进行连接反应(方法 参照天根生物公司PBS-T的说明书)，连接体系为PCR片段，7 μ L ；pBS-T载体(约50ng/ yL)，lyL ;10*T4Buffer，lyL ;T4DNA 连接酶(3U/yL)，lyL。反应结束后，取 IOyL 的连 接产物转化100 μ L的感受态大肠杆菌ToplO，取100 μ L的转化产物涂布于含有50g/mL青 霉素和0. 8mg IPTG以及0. Smg的Χ-gal的LB固体培养基进行蓝白斑筛选，37°C培养18小 时后，挑取白色单菌落，加入含50g/mL青霉素的LB液体培养基置37°C培养16小时后提取 质粒(上海生物工程有限公司BBI414质粒小提试剂盒)，即为GH四种亚型和IGF-I的TA 载体。3、GH四种亚型和IGF-I的TA载体的酶切提取GH四种亚型的TA载体，进行XhO I和EcoR I双酶切，酶切时间为2h，酶切 体系为质粒 DNA, LOyL ；EcoR 1,0. 5μ L ； Xho 1,0. 5μ L ； 10*Buff er, 2. 0 μ L ；无菌水， 16 μ L。再提取IGF-I的TA载体，进行Sam I和Not I双酶切，酶切体系为质粒DNA，1. 0 μ L ； Sam 1,0. 5μ L ；Not I，0. 5 μ L ； 10*Buffer，2. 0 μ L ；无菌水，16 μ L。酶切产物经 的琼脂 糖凝胶电泳后，用回收试剂盒(上海生物工程有限公司的ΒΒΙ354)进行小片段回收，并存 于-20°C备用。4、pCI_IRES 的提取、酶切提取pCI-IRES的质粒后，进行XhO I和EcoR I双酶切，酶切时间为2h，酶切体系 为质粒 DNA，LOyL ；EcoR 1,0. 5μ L ； Xho 1,0. 5μ L ； 10*Buff er, 2. 0 μ L ；无菌水，16 μ L。 酶切产物经1 %的琼脂糖凝胶电泳后，用回收试剂盒进行大片段回收，并存于-20°C备用。5、GH四种亚型与pCI-IRES的连接GH四种亚型基因片段和pCI-IRES载体片段以1_10 1的摩尔比在T4连接酶的作用下，置4°C 16小时进行连接反应，连接体系为基因片段，7 u L ；pCI-IRES载体，luL； 10*T4Buffer，1 u L ； T4DNA连接酶(3U/ uL),luLo 10uL的连接产物转化100 u L的感受态 大肠杆菌ToplO，取100 u L的转化产物涂布于含有50 u g/mL青霉素的LB固体培养基，37°C 培养18小时后，挑取单菌落，加入含50 u g/mL青霉素的LB液体培养基置37°C培养16小 时后提取质粒，即为重组基因载体 pCI-22-IRES、pCI-20-IRES、pCI-17-IRES、pCI-5-IRES。 图 1 是本发明的 pCI-22-IRES-IGF-I、pCI-20-IRES-IGF-I、pCI-17-IRES-IGF-I 和 pCI-5-IRES-IGF-I四种重组质粒经XhO I和EcoR I双酶切鉴定电泳图。图1所示的结果 显示GH四种亚型基因已连进真核共表达载体。6、GH的重组质粒的提取、酶切提取pCI-22-IRES、pCI-20-IRES、pCI-17-IRES、pCI-5-IRES 重组质粒，进行 Sam I和Not 1双酶切，酶切时间为211，酶切体系为质粒0嫩，1.01^;53111 1,0. 5u L ；Not I， 0. 5uL, 10*Buffer, 2. 0 u L ；无菌水，16 u L。酶切产物经1 %的琼脂糖凝胶电泳后，用回收 试剂盒进行大片段回收，并存于-20°C备用。7、IGF-I与GH四种亚型重组质粒的连接IGF-I 的基因片段分别和 pCI-22-IRES、pCI_20_IRES、pCI-17-IRES、pCI-5-IRES 载体片段以1-10 1的摩尔比在T4连接酶的作用下，置4°C 16小时进行连接反应，连 接体系为基因片段，7 ii L ；重组质粒片段，1 U L ；10*T4Buffer，1 u L ；T4DNA连接酶(3U/ u L), 1 u Lo 10 uL的连接产物转化100 u L的感受态大肠杆菌ToplO，取100 y L的转化产 物涂布于含有50 u g/mL青霉素的LB固体培养基，37°C培养18小时后，挑取单菌落，加入含 50 u g/mL青霉素的LB液体培养基置37°C培养16小时后提取质粒，即为IRES介导的GH四 种亚型(22kD、20kD、17kD、5kD)与IGF-I的双顺反子真核共表达载体pCI-22-IRES-IGF_I、 pCI-20-IRES-IGF-I、pCI-17-IRES-IGF-I、pCI-5-IRES-IGF-I。图 2 是本发明的 pCI-22-IRES-IGF-I、pCI-20-IRES-IGF-I、pCI-17-IRES-IGF-I、pCI-5-IRES-IGF-I 四种重 组质粒经Sam I和Not I双酶切鉴定电泳图。结果显示IGF-I基因已连进真核共表达载体。8、重组质粒的酶切鉴定1)提取的 pCI-22-IRES-IGF-I、pCI-20-IRES-IGF-I、pCI-17-IRES-IGF-I、 pCI-5-IRES-IGF-I重组质粒，进行XhO I和EcoR I双酶切，酶切时间为2h，酶切体系为 质粒 DNA，1. Oil L ;EcoR 1,0. 5 u L ；Xho I，0. 5 ii L ;10*Buffer，2. 0 ii L ；无菌水，16 ii L。酶 切后进行1 %的琼脂糖凝胶电泳。重组质粒pCI-22-IRES-IGF-I、pCI-20-IRES-IGF-I、 pCI-17-IRES-IGF-I、pCI-5-IRES-IGF-I经过XhO I和EcoR I双酶切后各自获得的小片段 大小分别为 573bp、528bp、444bp、129bp。2)四种重组质粒进行Sam I和Not I双酶切，酶切时间为2h，酶切体系为质粒 DNA, 1. 0u L ；Sam 1,0. 5 u L ；Not I，0. 5 ii L ； 10*Buffer，2. 0 ii L ；无菌水，16 ii L。酶切后进 行的琼脂糖凝胶电泳。四种重组质粒经过Sam I和Not I双酶切后获得的小片段大小 均是210bp。3)四种重组质粒进行Sam I和EcoR I双酶切，酶切时间为2h，酶切体系为质粒 DNA, 1. 0u L ； Sam 1,0. 5u L ；EcoR 1,0. 5u L ； 10*Buffer, 2. 0 u L ；无菌水，16ii L。酶切后进 行的琼脂糖凝胶电泳。四种重组质粒经过Sam I和EcoR I双酶切后获得的小片段大小 为 586bp0
图 3 是本发明的 pCI-22-IRES-IGF-I、pCI-20-IRES-IGF-I、pCI-17-IRES-IGF-I、 pCI-5-IRES-IGF-I四种重组质粒经Sam I和EcoR I双酶切鉴定电泳图。结果显示在真核 共表达载体中IRES基因位于GH四种亚型的基因与IGF-I基因的中间。9、重组质粒的测序鉴定重组质粒经酶切鉴定后送上海生物工程有限公司进行测序，测序引物为各基因的 上游引物。10、重组质粒导入活体将pCI-22-IRES-IGF-I、pCI_20-IRES-IGF_I、pCI-1 7_IRES-IGF-I、 pCI-5-IRES-IGF-I重组质粒以20 u g/只的量，每组8只，使用在体基因导入仪将重组质粒 导入小鼠左腿肌肉，小鼠3周时开始导入，每2周导入一次，总共3次。从导入开始，每2周 取一次血分离血清直到小鼠13周。13周后将每组小鼠同一时间的血清均勻混合，然后使 用小鼠IGF BP-2检测试剂盒(Mediagnost公司)检测血清中IGF BP-2的含量，使用小鼠 IGF BP-3检测试剂盒(APLC0公司)检测血清中IGF BP-3的含量，再与对照组比较。结果分析1、准确构建了 IRES介导的GH四种亚型与IGF-I的双顺反子真核共表达载体构建的IRES介导的GH四种亚型与IGF-I的双顺反子真核共表达载体即 pCI-22-IRES-IGF-I、pCI-20-IRES-IGF-I、pCI-17-IRES-IGF-I、pCI-5-IRES-IGF-I，经酶切 鉴定与预期结果一致，测序结果也证实与GeneBank公布的序列一致。2、重组质粒影响小鼠血清中IGF BP-2和IGF BP-3的含量注射重组质粒的的小鼠血清中的IGF BP-2的随着周龄的成长的变化趋势完全不 同于对照组；并且IGF BP-3的随着周龄的成长的变化趋势也不同于对照组。图4是本发 明的 pCI-22-IRES-IGF-I、pCI-20-IRES-IGF-I、pCI-17-IRES-IGF-I、pCI-5-IRES-IGF-I 四 种重组质粒导入昆明鼠的左腿肌肉后小鼠血清中的IGF BP-2在13周内的变化。结果显 示，注射重组质粒的的小鼠血清中的IGF BP-2的随着周龄的成长的变化趋势完全不同于 对照组。图 5 是本发明的 pCI-22-IRES-IGF-I、pCI-20-IRES-IGF-I、pCI-17-IRES-IGF-I、 pCI-5-IRES-IGF-I四种重组质粒导入昆明鼠的左腿肌肉后小鼠血清中的IGF BP-3在13周 内的变化。结果显示，注射重组质粒的的小鼠血清中的IGF BP-3的随着周龄的成长的变化 趋势不同与对照组，pCI-22-IRES-IGF-I、pCI-20-IRES-IGF-I、pCI-17-IRES-IGF-I 最高值 高于对照组，pCI-5-IRES-IGF-I最高值则低于对照组。序列表<110>北京科技大学<120>IRES介导的GH四种亚型与IGF-I双顺反子真核共表达载体的构建与应用<160>5<210>1<211>573<212>DNA<213> 人<400>1ttcccaacca ttcccttatc caggcttttt gacaacgcta tgctccgcgc ccatcgtctg 60
<213> 人<400>4ttcccaacca ttcccttatc caggcttttt gacaacgctacaccagctgg cctttgacac ctaccaggag tttgaagaagaagtattca<210>5<211>210<212>DNA<213> 人<400>5ggaccggaga cgctctgcgg ggctgagctg gtggatgctcaggggctttt atttcaacaa gcccacaggg tatggctccaacaggcatcg tggatgagtg ctgcttccgg agctgtgatctgcgcacccc tcaagcctgc caagtcagct
tgctccgcgc ccatcgtctg cctatatccc aaaggaacag
ttcagttcgt gtgtggagac gcagtcggag ggcgcctcag taaggaggct ggagatgtat
60 120 129
60 120 180 210
权利要求
一种IRES介导的GH四种亚型与IGF I双顺反子真核共表达载体的构建方法，所述GH四种亚型为22kD、20kD、17kD和5kD，其特征在于，所述构建方法包括步骤1)根据Genebank公布的GH和IGF I的mRNA序列和蛋白序列对比得出GH四种亚型和IGF I的编码序列设计引物，以实验室的GH和IGF I的DNA为模板通过PCR的方法得到GH四种亚型和IGF I的目标DNA，将PCR产物连接到pBS T载体中，获得GH四种亚型和IGF I的TA载体；2)然后将GH的TA载体经XhO I和EcoR I双酶切将GH四种亚型的基因定向插入pCI IRES中，构建了GH四种亚型的真核表达载体pCI 22 IRES、pCI 20 IRES、pCI 17 IRES和pCI 5 IRES；3)将IGF I的TA载体经Sam I和Not I双酶切将IGF I的基因分别定向插入pCI 22 IRES、pCI 20 IRES、pCI 17 IRES和pCI 5 IRES，构建IRES介导的人生长激素(GH)四种亚型22kD、20kD、17kD、5kD与IGF I的双顺反子真核共表达载体pCI 22 IRES IGF I、pCI 20 IRES IGF I、pCI 17 IRES IGF I和pCI 5 IRES IGF I。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，使用双酶切方法，将GH的四种亚型基因 定向插入含有IRES元件质粒的上游，将IGF-I基因定向插入该元件下游，形成可同时表达 GH 和 IGF-I 的重组质粒pCI-22-IRES、pCI-20-IRES、pCI-17-IRES 和 pCI-5-IRES。
3.如权利要求1或2的构建方法得到的构建载体，其特征在于，获得的四种真核共表达 载体分别含有GH四种亚型22kD、20kD、17kD、5kD和IGF-I的cDNA序列。
4.权利要求1所述的4种真核共表达载体在GH四种亚型和IGF-I促进人体生长中的 应用。
5.权利要求1所述4种真核共表达载体在GH四种亚型与IGF-I联合治疗中的应用。全文摘要
本发明是IRES介导的GH四种亚型与IGF-I双顺反子真核共表达载体的构建与应用，根据GH和IGF-I的mRNA序列和蛋白序列对比得出GH四种亚型和IGF-I的编码序列设计引物，以实验室的GH和IGF-I的DNA为模板通过PCR的方法得到GH四种亚型和IGF-I的目标DNA，将PCR产物连接到pBS-T载体中，获得GH和IGF-I的TA载体，然后将TA载体经XhO I和EcoR I双酶切将GH四种亚型的基因定向插入pCI-IRES中，成功构建了GH四种亚型的重组质粒pCI-22-IRES、pCI-20-IRES、pCI-17-IRES和pCI-5-IRES。然后将IGF-I的TA载体经Sam I和Not I双酶切将IGF-I的基因分别定向插入上述重组质粒中，成功构建了IRES介导的人生长激素(GH)四种亚型与IGF-I的双顺反子真核共表达载体pCI-22-IRES-IGF-I、pCI-20-IRES-IGF-I、pCI-17-IRES-IGF-I、pCI-5-IRES-IGF-I。为进一步研究GH的四种亚型和IGF-I基因的生物学特性和功能提供了方便有效的基本资料。
文档编号C12N15/12GK101892262SQ20101000073
公开日2010年11月24日 申请日期2010年1月15日 优先权日2010年1月15日
发明者华甜, 李传宝, 杜宏武, 金海明 申请人:北京科技大学