专利名称：：一种分泌表达黑曲霉木聚糖酶的食品级重组乳酸乳球菌及制法的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种可表达分泌型黑曲霉木聚糖酶的食品级重组乳酸乳球菌，同时还提供了该乳酸乳球菌的制备方法和应用，属于微生物基因工程领域。
背景技术：
：黑曲霉(Aspergillusniger)木聚糖酶B可以高效降解木聚糖，备受国内外科研工作者重视。木聚糖酶B通过降解木聚糖主链上木糖残基之间的0-1，4_糖苷键，将木聚糖降解成短链的木寡糖和木二糖以及少量的的木糖和阿拉伯糖，是降解木聚糖的关键酶之一。但是黑曲霉表达的木聚糖酶B是诱导酶，同时有葡萄糖等物质存在时，木聚糖酶B的合成受到阻遏；又由于黑曲霉菌种自身的特性导致其所合成的木聚糖酶B需经分离纯化才能使用，因此限制了其在工业上的应用。L.lactisNZ3900/pNZ8149表达系统是乳酸菌食品级高效表达系统NICE(thenisincontrolledexpression,NICE)系统中的一员，pNZ8149载体以lacF为选择标记，lacF缺陷型L.lactisNZ3900作为宿主，利用乳糖进行筛选，L.lactisNZ3900/pNZ8149表达系统是典型的食品级表达系统。但是由于该系统是胞内表达系统，外源基因产物在细胞内大量表达易形成包涵体，产物分离时需要对菌体进行破碎处理，处理不当会影响产物活性和产物回收率等指标，因此在实际应用中该系统还存在一定的缺陷。目前，国内外对黑曲霉木聚糖酶B和L.lactisNZ3900/pNZ8149系统均以开展了较多的研究工作，但对于将PNZ8149载体改造为分泌表达载体以及利用改造后的分泌表达载体在L.lactisNZ3900中表达黑曲霉木聚糖酶B则未见报道。
发明内容本发明提供一种可表达分泌型黑曲霉木聚糖酶的食品级重组乳酸乳球菌，可表达分泌型黑曲霉木聚糖酶B，有利于木聚糖酶B发挥活性。本发明还提供上述重组乳酸乳球菌的制备方法，解决了原pNZ8149载体胞内表达的局限。本发明的可表达分泌型黑曲霉木聚糖酶B的食品级重组乳酸乳球菌，其特征在于菌株中含有表达载体pNZS-XYNB，所述的表达载体pNZS-XYNB是在载体pNZ8149加入了以下元件乳酸乳球菌MG1363的Usp45信号肽基因SPusp45序列；黑曲霉木聚糖酶B的成熟肽编码序列XYNB。本发明所述食品级重组乳酸乳球菌的构建方法，包括以下步骤1)将乳酸乳球菌MG1363的Usp45信号肽基因SPusp45序列克隆到表达载体PNZ8149的启动子PnisA下游；2)利用特异性引物通过PCR方法删除启动子序列和信号肽基因序列间的Ncol酶切位点，将基因SPusp45融合到PnisA下游，构建的载体pNZS；3)将黑曲霉木聚糖酶B基因克隆到分泌表达载体pNZS的多克隆位点中，构建了可表达分泌型黑曲霉木聚糖酶B的载体pNZS-XYNB，将pNZS-XYNB载体利用电击转化法转入受体菌L.IactisN3900，筛选培养得到分泌表达黑曲霉木聚糖酶B的食品级重组乳酸乳球菌。本发明所述的构建方法，其特征在于SPusp45信号肽基因序列的引物为5'端引物Pl:5'GGGCCATGGATGAAAAAAAAGATTATCTCAGCTATTTTAATGTCTACAGTGATACTTTC3‘3'端引物P2:5'TATGCATGCAGCGTAAACACCTGACAACGGGGCTGCAGCAGAAAGTATCACTGTAGACA3'改造载体删除NcoI酶切位点用引物为5'端引物P2:5'ATGAAAAAAAAGATTATCTCAGC3'3'端引物P3:5'GGTGAGTGCCTCCTTATAAT3'本发明具有以下有益效果本发明提供的表达分泌型黑曲霉木聚糖酶B的食品级重组乳酸乳球菌，可以表达木聚糖酶B，并将木聚糖酶B分泌到培养基中，分泌率最高可达47.94%。弥补了传统原核表达系统不能分泌表达的不足，同时又避免了采用酿酒酵母和毕赤酵母等真核表达系统带来的蛋白糖基化严重等问题，大大降低了酶产品的制备难度，有利于木聚糖酶B发挥活性。将发明应用于木聚糖酶饲料添加剂等的生产，则具有宿主安全益生、产酶时期可控、菌体生长周期短和产物不需提取就可以同重组菌一起直接投入应用的优点，因此具有重要的实际意义和广阔的开发前景！图1为构建含有SPusp45信号肽基因的重组乳酸乳球菌表达载体的技术路线图。图2为构建含有XLNB的重组乳酸乳球菌表达载体的技术路线图。图3为SPusp45的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。图4为SPusp45的测序图。图5为线形pNZS载体环化后电穿孔转化子的平板筛选图。图6为pNZS载体改造后的测序图谱。图7为pNZS-gus质粒DNA的PCR鉴定图。图8为重组乳酸乳球菌菌株L.IactisN3900/pNZS-gus和L.IactisN3900/pNZS的GUS染色图片。图9为黑曲霉总RNA的琼脂糖凝胶电泳图。图10为XYNB基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。图11为表达载体pNZS-XLNB的电穿孔转化子的平板筛选图。图12为重组乳酸乳球菌菌株L.IactisN3900/pNZS-XLNB质粒DNA的PCR和酶切鉴定图。图13为pNZS-XLNB质粒测序后的XLNB基因核苷酸序列同参考序列AspergillussulphureusxylanaseBmRNA,completecds(DQ168666)的DNAMAN比对图。图14为pNZS-XLNB质粒测序序列经Primmerpremier5.0软件翻译后的氨基酸序列同参考序列AspergillussulphureusxylanaseBmRNA,completecds(DQ168666)的氨基酸序列DNAMAN比对图。图15为木糖标准曲线。具体实施例方式下述实施方式中所用方法如无特别说明均为常规方法，工具酶均购自宝生物公司。1、分泌表达载体pNZS的构建及验证分泌表达载体pNZS的构建技术路线如图1所示，具体步骤如下(1)引物设计根据GeneBbankEU382094公布的乳酸乳球菌MG1363的Usp45信号肽基因SPusp45序列，利用Primmerpremier5.0软件设计一对各长50bp的引物，且在两条引物3’端引入19bp的互补序列，5’端分别引入Ncol和SphI酶切位点以及保护碱基，互补序列和酶切位点用下划线标出，如下5’端引物P1:5，GGGCCATGGATGAAAAAAAAGATTATCTCAGCTATTTTAATGTCTACAGTGATACTTTC3，3，端引物P2:5’TATGCATGCAGCGTAAACACCTGACAACGGGGCTGCAGCAGAAAGTATCACTGTAGACA3’根据SPusp45序列设计一对鉴定引物，如下P35，ATGAAAAAAAAGATTATCTCAGCT3，P45，AGCGTAAACACCTGACAAC3，根据pNZ8149载体序列和SPusp45序列，利用Primmerpremier5.0软件设计一对用于改造载体的引物，如下5，端引物P5:5，ATGAAAAAAAAGATTATCTCAGC3，3，端引物P6:5’GGTGAGTGCCTCCTTATAAT3’(2)SPusp45序列的克隆以步骤(1)所示引物P1、P2在不添加模板的条件下进行PCR克隆SPusp45，体系和条件如下反应体系25iiL10Xbuffer(5mMMg2+Plus)2.5uL>dNTPMixture(lOmmol/L):0.4uL>PI(50pmol/L):0.5iiL、P2(50pmol/L):0.5uL,Taq酶(5u/u1):0.2iiL、灭菌ddH20:upto25y1。反应条件94°C预变性5min；94°C变性20sec，42°C退火15sec，72°C延伸20sec，30cycles，72°C后延伸8min；上述PCR产物用琼脂糖电泳检测见(图3)，图中泳道1为SPusp45片段PCR产物，在约81bp处有特异亮带，表明目的基因扩增成功。将扩增产物经T-A克隆送三博远志公司测序(TA克隆系列购自TAKARA公司)，测序结果见(图4)，结果表明所得序列与Genebank上公布的SPusp45序列完全一致。(3)重组分泌表达载体pNZS的构建SPusp45的PCR产物和pNZ8149质粒同时进行NcoI和SphI限制性酶切，将酶切产物用T4DNA连接酶连接，电击转化L.lactiSN3900，转化子经平板筛选(胰蛋白胨20.Og，酵母粉5.Og，氯化钠4.Og，醋酸钠1.5g，抗坏血酸0.5g，15.Og琼脂粉，蒸馏水定容至1L，pH值7.0，灭菌后加入终浓度0.5%的乳糖，和0.004%溴甲酚紫)，平板筛选获得的阳性重组质粒命名为pNZ-S，pNZ-S载体用步骤(1)设计的引物P3、P4进行PCR鉴定，以鉴定正确的重组质粒pNZ-S为模板，用步骤(2)设计的引物P5、P6和PrimeSTARTMHSDNAPolymerase进行扩增，体系参照PrimeSTARTMHSDNAPolymerase说明书，经PCR反应删除启动子和SPusp45基因间的NcoI酶切位点，将SPusp45基因融合在启动子下游作为载体上的信号肽基因片段，消除NcoI位点中ATG碱基对翻译起始影响的同时缩短了外源基因序列同SD序列的相对距离，有助于提高转录效率，扩增产物经磷酸化后用T4DNA连接酶连接重新环化，获得的载体命名为pNZS，连接产物电击转化L.lactisN3900，平板筛选见(图5)，阳性菌落呈黄色，经筛选获得携带阳性重组质粒pNZS的菌株，利用引物P4进行测序，测序由三博远志公司完成，测序结果见(图6)，图中1代表上游启动子，2代表下游信号肽，测序显示已经成功删除了NcoI酶切位点，分泌表达系统L.IactisN3900/pNZS构建成功。(4)利用gus报告基因验证分泌表达载体pNZS的分泌表达特性，gus为本实验室保存，序列参照Genebank中AF502128，将gus插入pNZS多克隆位点中，电击转化L.IactisN3900，经筛选获得阳性重组菌命名为L.IactisN3900/pNZS-gus,pNZS-gus的PCR鉴定结果见(图7)，在约1840bp处出现亮带，与预期产物大小相符，图中泳道1为gus基因PCR扩增产物。将L.IactisN3900/pNZS-gus菌株进行GUS染色，按10ngNisin/lml培养基的量加入Msin进行诱导培养5小时诱导培养后，进行培养物菌体与培养基分离，分离后的培养基经0.22μm醋酸纤维素滤膜过滤除菌，然后对培养基进行⑶S染色，以L.IactisN3900/pNZS为对照，染色结果见(图8)，结果表明L.lactiSN3900/pNZS-guS菌株可以正确表达有活性的⑶S蛋白，并将蛋白分泌细胞外，由此证明分泌表达载体pNZS构建成功。2、表达分泌型黑曲霉木聚糖酶B的重组L.IactisN3900的获得(1)黑曲霉木聚糖酶B基因XYNB的扩增利用添加0.5%木聚糖的察氏培养基对黑曲霉进行菌丝体培养，并用DNS法跟踪测量木聚糖酶B活性，当酶活最大时利用购自TAKARA公司的RNA提取试剂盒提取黑曲霉总RNA,按试剂盒提取步骤进行总RNA的提取。提取出的总RNA利用无RNA酶的DnaseI(购自TAKARA公司)作酶切纯化处理，按说明书操作。纯化后的总RNA经甲醛变性凝胶电泳检测见(图9)，结果证明所提取的RNA均有三条带，分别为28S、18S、5.8SRNA条带，亮度符合试验要求。纯化后的总RNA利用反转录酶按说明书进行反转录，获得cDNA。根据GenBank已发表的木聚糖酶B基因XYNB(GenBank的登录号为DQ168666)RNA序列，应用PrimerPremierS.O引物设计软件分别设计一对特异性引物，为了便于定向克隆和载体构建，在上游引物和下游引物的5’端分别加入限制性内切酶位点和保护碱基(画线部分为加入的酶切位点)5，端引物P7:SphI5，TTTGCATGCATGCTCACCAAGAACCT3，3，端引物P8:Spel5’CGGACTAGTTTACTGAACAGTGATGGAG3’以cDNA为模板，通过PCR扩增黑曲霉木聚糖酶基因的DNA片段，PCR扩增反应体系如下反应体系:25u1；10Xbuffer(Mg2+plus)2.5uL>dNTPMixture(20mmol/L)0.5iiL、P7(50pmol/L):1iiL、P8(50pmol/L)1uL>Template(70ng/u1):1iil、Taq酶(5u/ill):0.2iiL、灭菌ddH20:upto25yl。反应条件94°C预变性5min，94°C变性50sec，53°C退火35sec，72°C延伸50sec，30cycles，72°C后延伸8min；PCR反应结束后，全量反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，结果见(图10)所示，图中泳道1为XYNB片段PCR产物在约678bp处有特异亮带，所得目的条带符合预期大小。(2)、木聚糖酶基因重组乳酸乳球菌表达载体pNZS-XYNB的构建含有目的基因的重组乳酸乳球菌表达载体pNZS-XYNB的构建过程见图2所示，具体步骤如下1)、重组表达载体pNZS-XYNB的构建及转化乳酸乳球菌XYNB的PCR产物和表达载体pNZS质粒DNA分别用SphI和Spel双酶切，酶切体系20iU，37°C酶切3h。反应结束后，全量反应液于的琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段。用T4DNA连接酶连接，反应体系20iU，混勻，16°C反应16h。连接产物电击转化L.lactisN3900，在筛选培养基上进行筛选培养，筛选结果见(图11)，阳性转化子可以在含有乳糖和溴甲酚紫的筛选平板上生长，菌落呈黄色，初步表明本发明所述的质粒转化成功。转化子提取质粒进行PCR和酶切鉴定，结果见(图12)，泳道1为XLNB的PCR产物，泳道2为pNZS-XLNB的SphI、Spel双酶切产物，产物条带符合预期大。将pNZS-XYNB质粒送往三博远志公司测序鉴定，测序所得核苷酸序列同参考序列DQ168666的DNAMAN比对，结果(见图13)，同源率为99.26%。将pNZS-XLNB质粒测序核苷酸序列经Primmerpremier5.0软件翻译后的氨基酸序列同参考序列AspergillussulphureusxylanaseBmRNA,completecds(DQ168666)的氨基酸序列进行DNAMAN比对，结果见(图14)，同源率100%。保证插入的外源基因在宿主内可以正确翻译的概率，pNZS-XYNB转化的阳性菌株称为L.lactisN3900/pNZS-XYNB。分泌表达黑曲霉木聚糖酶B的食品级重组乳酸乳球菌构建成功。3、木聚糖酶B基因在重组乳酸乳球菌中的诱导表达将L.lactisN3900/pNZS_XYNB阳性重组菌和L.lactisN3900/pNZS空载对照分别按体积比1100比例接种于GM17液体培养基中，30°C过夜培养，取过夜培养物按体积比150进行扩增培养于100ml培养基中，30°C培养至0D_为0.3到0.5之间时，按10ngNisin/lml培养基的量加入Nisin进行诱导培养5小时。终止培养后培养物经4°C、lOOOOrpm、离心lOmin，分别收集培养物上清和菌体，上清培养基又经过0.22ym醋酸纤维素滤膜过滤除菌备用，而菌体洗涤两次后重悬于0.1MpH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，用超声波(功率800W，破碎3S，间歇9S，周期15min，破碎体积为50ml)破碎，破碎物同样4°C、10000rpm、离心lOmin，收集上清和沉淀。分别取培养物上清、菌体破碎物上清和菌体破碎后沉淀进行酶活检测。木聚糖酶活性检测采用DNS法(3，5-二硝基水杨酸比色定糖法)。木糖标准曲线制作，按表1，分别吸取标准木糖使用溶液、缓冲液和DNS试剂于各管中(每管号平平行3个样)，混勻。将标准管同时置于沸水浴中，反应7min，取出，迅速冷却至室温，准确加入蒸馏水10ml，混勻。用IOmm比色杯，以空白管(0号管)调仪器零点，在分光光度计波长550nm处测吸光度，结果如表2，标准曲线见(图15)。以木糖量为横座标，以吸光度为纵座标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。线性回归系数(r)应在0.990以上。对每个新配制的DNS溶液制作新的标准曲线。表1.木糖标准曲线<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表2.标准曲线OD55tlIim出吸光值<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>1)酶活的定义每分钟每毫升酶液分解木聚糖生成1Pmol还原糖所需酶量为1个酶活性单位(IU)。2)酶活的计算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>其中，mf-样品木糖量(mg);m2_对照品木糖量(mg)；M-木糖摩尔质量(150)；T-酶液反应时间(min)；V-参与反应酶液体积(ml)；N--稀释倍数；将上述处理获得的样品用0.1MpH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释10倍，菌体破碎后上清不稀释，取1ml与用0.1MpH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配成的的木聚糖溶液0.5mr混合，40°C反应15min，加入3mLDNS试剂，煮沸lOmin，以100°C煮沸的酶液为空白对照，反应结束用蒸馏水定容至10mL，测550nm光吸收，平行做三组。根据木糖标准曲线计算各部分的酶活和木聚糖酶B的分泌率，结果见表3。表3.重组菌株不同组分酶活和分泌率统计表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表3可知，重组菌株L.lactisN3900/pNZS_XYNB可以表达有活性的黑曲霉木聚糖酶B，并且可以将其分泌到基质中，分泌率可达总酶活的47.94%，虽然L.lactisN3900/pNZS-XYNB菌株的产木聚糖酶的活性比其原始菌株黑曲霉低，但是使黑曲霉木聚糖酶B在乳酸乳球菌中表达是首次，同时宿主菌L.lactisN3900和载体均符合食品安全要求，因此L.lactisN3900/pNZS-XYNB菌株仍具有重要的实际应用价值和很好的应用前景，特别是在饲料添加剂行业的应用，可以直接作为口服饲料添加剂，补充木聚糖酶的同时宿主菌还可以产生有益因子。权利要求一种可表达分泌型黑曲霉木聚糖酶B的食品级重组乳酸乳球菌，其特征在于菌株中含有表达载体pNZS-XYNB，所述的表达载体pNZS-XYNB是在载体pNZ8149中加入了以下元件乳酸乳球菌MG1363的Usp45信号肽基因SPusp45序列；黑曲霉木聚糖酶B的成熟肽编码序列XYNB。2.权利要求1所述食品级重组乳酸乳球菌的构建方法，包括以下步骤1)将乳酸乳球菌MG1363的Usp45信号肽基因SPusp45序列克隆到表达载体pNZ8149的启动子PnisA下游；2)利用特异性引物通过PCR方法删除启动子序列和信号肽基因序列间的Ncol酶切位点，将SPusp45融合到PnisA下游，构建的载体pNZS；3)将黑曲霉木聚糖酶B基因(XYNB)克隆到分泌表达载体pNZS的多克隆位点中，构建了可表达分泌型黑曲霉木聚糖酶B的载体pNZS-XYNB，将pNZS-XYNB载体利用电击转化的方法转入受体菌L.lactisN3900，通过筛选培养获得分泌表达黑曲霉木聚糖酶B的食品级重组乳酸乳球菌。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于SPusp45序列的引物为5'端引物P15'GGGCCATGGATGAAAAAAAAGATTATCTCAGCTATTTTAATGTCTACAGTGATACTTTC3'3'端引物P2:5'TATGCATGCAGCGTAAACACCTGACAACGGGGCTGCAGCAGAAAGTATCACTGTAGACA3'改造载体删除Ncol酶切位点用引物为5'端引物P2:5'ATGAAAAAAAAGATTATCTCAGC3'3'端引物P3:5'GGTGAGTGCCTCCTTATAAT3'。全文摘要本发明公开一种可分泌表达黑曲霉木聚糖酶的食品级重组乳酸乳球菌及制法，菌株中含有表达载体pNZS-XYNB，所述的表达载体pNZS-XYNB是在载体pNZ8149中加入了以下元件乳酸乳球菌MG1363的Usp45信号肽基因SPusp45序列；黑曲霉木聚糖酶B的成熟肽编码序列XYNB。本发明扩增出已知的黑曲霉木聚糖酶基因的成熟肽编码序列，将其与载体pNZS进行连接，通过电转化进入宿主菌乳酸乳球菌NZ3900细胞中，在nisin的诱导下进行表达，经SDS-PAGE分析和酶活检测证明，本发明克隆的黑曲霉木聚糖酶基因在工程菌中可以分泌表达，具有降解木聚糖的活性。文档编号C12N9/42GK101805718SQ20101014105公开日2010年8月18日申请日期2010年3月31日优先权日2010年3月31日发明者付永平,曲静,王丕武,马建,马超申请人:吉林农业大学