专利名称：乙肝病毒l基因的玉米表达载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学工程领域，特别涉及一种包含了乙肝病毒L基因的玉米表达载体及其应用。
背景技术：
乙型肝炎病毒(Ofepatitis B virus HBV)的感染是一个非常严重的全球性的健 康问题。目前全球60亿人口中有20亿人感染过乙型肝炎病毒，占全球人口三分之一。约 25%的人最终将转化为慢性肝病，包括肝硬化和肝癌。控制乙肝传播的主要手段是接种有 效的疫苗进行预防和阻断传播途径，。目前应用的乙肝疫苗主要由中国仓鼠卵巢细胞(CH0 细胞)和啤酒酵母表达的乙肝病毒表面抗原HBsAg(S蛋白)颗粒组成。在预防接种的过程 中发现仍有10% 20%人群接种乙肝疫苗表现为无反应或弱反应，甚至根本不产生抗体。 随着年龄的上升，无反应或弱反应者增多，尤其是在艾滋病感染者、肾透析和免疫抑制病人 中这种低反应或不反应的发生率会更高。另外，由于长期推广乙肝疫苗后，HBVS基因变异 株以弱势准种形式广泛存在，有可能在免疫后人群中流行而成为新的公共问题。因此，研制 新型免疫原性更好的乙肝疫苗是国内学者迫切需要解决的课题。研究表明，乙肝病毒全包膜蛋白L(包含Prel、Pre2、S基因编码蛋白)，其中preSl 肽段含有好几个免疫原性比S蛋白更强的T细胞和B细胞表位，由preSl引起的细胞特异性 的细胞免疫应答可以帮助克服某些人对S蛋白的免疫无反应状态或同时对preSl和preS2 蛋白双重无反应状态；preS2中也含有多个抗原表位和病毒中和位点，在疫苗制剂中加入 preSl和preS2的抗原表位后，人群对传统的乙肝疫苗的不反映和低反应频率大大降低，抗 体产生的时间较仅有S区抗原的时间提前；因而含有乙肝病毒preSl和preS2抗原成分或 HBV S基因变异株核心蛋白成分的各种新型重组乙肝疫苗具有更强的免疫原性，能诱导更 高效的免疫应答，产生中和乙肝病毒抗体，保护机体免受病毒攻击，并可打破免疫耐受，清 除乙肝病毒。转基因植物疫苗是将植物分子生物学技术与机体免疫机理相结合，使外源基因在 植物中表达，免疫人体后获得特异性抗体的新型疫苗，和其他疫苗相比有安全、高效、廉价、 易运输、易推广等优点。但外源基因在植物中低表达是研究人员面临的重大难题之一，开发 并建立高效表达体系和高效植物表达载体的研究是克服该问题的重要途径。理论上，用于 生产口服疫苗的植物反应器要需符合以下条件①表达蛋白的含量较高，至少能占可溶性 总蛋白0. 01-0. 1%;②抗原蛋白的浓度要稳定、一致，以便定量口服；③常温下长期保存，并 保证抗原蛋白生物活性稳定；④转基因植物表达抗原蛋白的组织要可口、服用方便；⑤种 植技术普及，人人可种植。玉米作为植物反应器候选之一，具有其独特的优势①表达外源性蛋白的玉米种 子在常温下至少保存一年；②抗原蛋白浓度稳定；③检测到在转基因玉米中表达的LT-B蛋 白占可溶性总蛋白0.05% 0. 之间，有的达到1.8%。Jeffrey和St印hen等在对外源 性基因Lt-B表达进行定位，发现其编码的蛋白被定位到液泡当中蛋白表达量最高，其次是在细胞表面，再次是在内质网中，而定位到细胞核或质体当中，或者不进行定位时蛋白表达 量最低。相反，Lt-B基因在烟叶中或马铃薯茎中表达时，定位在内质网的蛋白质表达量可 达到在细胞表面的三到四倍；④玉米是全世界三大主食之一，广受人们的喜爱。正因为玉米 具备多项优势，已经成功表达外源性基因，并取得较好的效果。1986年Fromm等首次在玉米 中成功表达除草剂pat基因，经过约十年深入研究，1995年后转基因玉米已经进入商业化 阶段。其中，抗虫(Bt)转基因玉米和除草剂已经被批准商业化。到了 2005年，全球转基因 玉米种植面积超过2120万hm2，转基因玉米市场价值达到19. 1亿美元。当然，玉米真正成 为人类防治传染病的口服疫苗，还需要进一步探索。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种包含乙肝病毒L基因的玉米表 达载体的构建方法；所构建的pCAMG-L，是一个包含1201个碱基对的闭环质粒。将表达乙 肝包膜大蛋白(L蛋白)的全基因插入到植物表达载体PAMBIA1300中。本发明的另一目的在于提供上述方法构建的玉米表达载体的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种包含了乙肝病毒L基因的玉米表达载 体的构建方法，包括以下步骤(1)根据乙肝病毒L基因的编码序列设计1对引物上游引物序列为P15，-TTATCG GGATCC ATGGGAGGTTGGTCTTC-3，，含 BamH I 酶切 位点和起始密码子；下游引物序列为P25，-CGCGCTGCTAGCTCAAATGTATACCCAAAG-3，，含 Nhe I 酶切位
点和终止密码子；(2)将乙肝表面抗原阳性患者血清采用苯酚/氯仿抽提法获得DNA提取液，作为L 基因扩增模板，用步骤(1)设计的引物Pl和P2进行常规链式聚合酶反应，扩增出乙肝病毒 L基因；(3)pCRG_L 载体的构建用BamH I和Nhe I双酶切步骤(2)所得乙肝病毒L基因，用BamH I和Xba I双 酶切pCR-G(pCR-Gl0bulin)载体，将上述酶切纯化的产物按照摩尔比3 1混合、连接、转 化获得重组质粒PCRG-L ；(4)重组载体pCAMG-L的克隆与构建以重组载体pCRG-L为模板，设计 引物P3和P4进行常规链式聚合酶反应扩增得到 Globulin-L基因，分离纯化后用HindIII和Nhe I双酶切，同时用HindIII和Xba I双酶 切植物表达载体PCAMBIA1300，再将上述酶切产物进行同尾酶连接(Nhe I和XbaI是同尾 酶)，转化，获得重组载体pCAMG-L ；引物 P3 的序列为P3 :5，-TTAATCGAAGCTTGCCGAGTGCCATCCT-3，；引物 P4 的序列为5，-CGCGCTGCTA GCTCAAATGTATACCCAAAG-3，。步骤(2)所述常规链式聚合酶反应具体步骤如下将混合液在94°C预变性5min， 然后进入下列循环94 °C、45s，56. 5 °C、45s，72 °C、60s，共进行30个循环，最后72 °C延伸 lOmin，扩增完毕后置4°C终止反应；所述混合液组成如下浓度为lOumol/1的上游引物Pl 1 μ 1
浓度为lOumol/1的下游引物P2 1μ 1dATP、dTTP、dCTP、dGTP 的浓度各为2. 5mM的dNTP混合物4 μ 1DNA 提取液5 μ 1Ex耐热性DNA聚合酶反应缓冲液 5 μ 1 Ex耐热性DNA聚合酶 0. 25 μ 1灭菌水33. 75 μ 1。步骤(4)所述常规链式聚合酶反应具体步骤如下将混合液在94°C预变性5min， 然后进入下列循环94 °C、50s，56 °C、50s，72 °C、90s，共进行30个循环，最后72 °C延伸 lOmin，扩增完毕后置4°C终止反应；所述混合液组成如下浓度为lOumol/1的上游引物Pl 1 μ 1浓度为IOumo 1/1的下游引物Ρ2 1 μ 1
dATP、dTTP、dCTP、dGTP 的浓度各为2. 5mM的dNTP混合物4 μ 1pCRG-L1 μ 1Ex耐热性DNA聚合酶反应缓冲液 5 μ 1Ex耐热性DNA聚合酶0. 25 μ 1灭菌水37. 75 μ 1。上述方法构建的乙肝病毒L基因的玉米表达载体作为制备疫苗的用途。该载体是 植物双元表达载体，可以携带乙肝病毒L基因被转化到农杆菌中，介导转化玉米幼胚，继而 获得玉米转基因植株，也可以将乙肝病毒L基因整合到植物基因组中，使抗原基因在植物 中正常表达出含有乙肝病毒L基因的表达蛋白质作为口服疫苗。本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果本发明选择具有驱动外 源性基因在组织或器官表达特异性和高水平表达的双重优势的玉米种子特异性启动子 Globulin-Ι，构建了由玉米种子特异表达启动子Globulin-I调控的优势乙肝病毒L基因， 使其特异、高效地在玉米种子中表达，可以克服组成型启动子在应用中的缺陷，这一研究在 国内外鲜有报道；目前，发明人已经利用农杆菌介导转化玉米幼胚，获得部分转基因植株， 为进一步研究利用转基因玉米生产乙肝病毒L基因口服疫苗的免疫效果奠定基础。
图1为重组载体pCAMG-L的构建示意图。图2是PCR扩增的乙肝病毒L基因，其中，M为DNA marker DL-IOOOO (bp) ；1 2为乙肝病毒L基因的PCR产物。图3是PCR扩增的Globulin-L基因，其中，M为 DNA marker DL-IOOOO (bp) ；1 3 为 Globulin-L 基因的 PCR 产物。图4为重组载体pCAMG-L双酶切琼脂糖凝胶电泳图，其中，M为 DNA markerDL-10000 (bp) ；2 为 pCAMG-L 的 HindIII 和 xbal 双酶切产 物；3为pCAMG-L的BamH和Xba I双酶切产物；4为pCAMG-L的Hind III和Xba I双酶切产物。
图5为在农杆菌中提取出的pCAMG-L重组质粒的双酶切鉴定图，其中，M为 DNAmarkerDL-10000 (bp) ；2 为 pCAMG-L 的 HindIII 和 XbaI 双酶切产物。图6为在农杆菌中提取出的pCAMG-L重组质粒的PCR法鉴定包含Globulin-I的 HBV-L，其中 M 为 DNA marker DLlOOOO(bp) ；1 2 为 Globulin-L 基因的 PCR 产物。图7载体pCRG构建示意图。图8为载体pCRG示意图。图9为载体pCAMBIA-1300-N0S构建示意图。图 10 为载体 pCAMBIA-1300-N0S 示意图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。在下面实施中所要用到的材料为质粒pUC18购自华美生物工程公司；PCR2. 1与pCAMBIA1300均购自于上海二医 新生基因科技有限公司；PBI 121购自北京天恩泽基因公司；Globulin-I基因根据Genbank 上登录号(M24845. 1 GI =168480)，由大连宝生物公司合成；Bar基因根据Genbank上登录号 (X05822. 1 GI 47126)由上海英骏生物有限公司合成。乙肝表面抗原阳性患者血清由广州华侨医院提供。大肠杆菌E. coli T0P10购自天津天有利科技有限公司。试剂=Ex TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶(HindIII, Xba I、Nhe I、 BamH)和DL-Ikb Ladder购自大连宝生物公司；试剂盒(质粒提取试剂盒，PCR产物清洁试 剂盒，DNA胶回收纯化试剂盒)购自OMEGA公司；PCR引物合成和重组质粒上目的基因的序 列测定均由上海生工生物工程公司完成；农杆菌菌株LBA4404购自Invitrogen公司。培养基LB培养基，用于大肠杆菌的 培养。YEB培养基，用于农杆菌的培养。实施例1 包含了乙肝病毒L基因的玉米表达载体pCAMG-L的构建示意图如图1所 示(1)克隆基因引物的设计根据乙肝病毒L基因的编码序列设计1对引物上游引物序列为P15，-TTATCG GGATCC ATGGGAGGTTGGTCTTC-3，，含 BamH I 酶切 位点和起始密码子ATG ；下游引物序列为P25，-CGCGCTGCTAGCTCAAATGTATACCCAAAG-3，，含Nhe I 酶切位 点和终止密码子；(2) PCR反应与克隆L基因扩增模板取自乙肝表面抗原阳性患者血清；血清抽提采用苯酚/氯仿抽提 法；乙肝病毒DNA的提取采集静脉血，将100UL血清与蛋白酶K (PK)缓冲液IUL混勻，加人 IOUlpK(20mg/mL)，55° C过夜。与 250UL 饱和酚 / 氯仿(1 1)混勻，10000 转/min4°C离心 5MIN, 500UL 冰乙醇沉淀 15MIN，12000 转 /min 离心 15MIN，20UL TE 缓冲液(10mmol/L 三羟 甲基氨基甲烷盐酸盐(PH8. 0)，lmmol/L乙二胺四乙酸二钠)溶解DNA后，一 20°C保存备用。
以上述方法所得DNA提取液作为模板，用步骤⑴设计的引物Pl和P2进行常规 链式聚合酶反应扩增乙肝病毒L基因；所述常规链式聚合酶反应具体步骤如下将混合液 在94°C预变性5min，然后进入下列循环94°C、45s，56. 5°C、45s，72°C、60s，共进行30个循 环，最后72°C延伸lOmin，扩增完毕后置4°C终止反应；所述混合液组成如下浓度为10umol/l的上游引物Pl 1 μ 1浓度为IOumo 1/1的下游引物Ρ2 1 μ 1dATP、dTTP、dCTP、dGTP 的浓度 各为2. 5mM的dNTP混合物4 μ 1 DNA 提取液5 μ 1Ex耐热性DNA聚合酶反应缓冲液5 μ 1Ex耐热性DNA聚合酶0. 25 μ 1灭菌水33. 75 μ 1 ；将扩增产物分离纯化后，用IXTAE电泳缓冲液制备质量百分比浓度为1. 0%的琼 脂糖凝胶，取其中5μ1进行电泳，以DNA marker DLlkb分子量参照，在紫外透射分析仪下 观察PCR产物片段大小，并拍照；结果如图2所示，产物片段大小与预期结果相符，大小为 1. 2Kb。(3) pCRG-L 载体的构建用BamH I和Nhe I双酶切步骤(2)所得乙肝病毒L基因，用BamH I和Xba I双 酶切pCR-G载体，酶切后用10g/L琼脂糖凝胶电泳进行分离，并经过DNA凝胶回收纯化试剂 盒回收酶切产物，将上述酶切纯化的产物按照3 1的摩尔比混合(Nhe I和Xba I为同尾 酶)，用T4DNA连接酶连接过夜；转化至低温CaC12制备的大肠杆菌E. coli ToplO感受态 中，然后涂布50μ g/mL卡那霉素的LB固体培养基中；次日，随机挑取多个单菌落，分别接种 于3mL含卡那霉素的LB培养液中，37°C下130r/min振荡培养过夜；先取少量菌液煮沸作为 模板进行菌落PCR检测，再将菌落PCR筛选呈阳性的菌落用质粒提取试剂盒抽提质粒DNA ； 将提取的质粒DNA进行双酶切鉴定，将筛选出的阳性克隆产物的菌液进行测序鉴定，测序 工作由上海生物工程有限公司完成，鉴定结果表明所得质粒DNA为重组质粒pCRG-L ；所述pCR-G载体的构建方法(见图7)如下用Hindi 11和BamHI分别双酶切 Globulin-I和pCR2. 1，经质量分数为0. 8%的琼脂糖分离，用胶回收试剂盒回收酶切产物， 将两个回收片段用T4连接酶连接，转化大肠杆菌T0P10，酶切鉴定获得pCR-G载体(见图 8)。(4)重组载体pCAMG-L的克隆与构建以重组载体pCRG-L为模板，设计引物P3和P4进行常规链式聚合酶反应(PCR)扩 增得到Globulin-L基因；引物 P3 的序列为P3 :5，-TTAATCGAAGCTTGCCGAGTGCCATCCT-3，；引物 P4 的序列为5，-CGCGCTGCTAGCTCAAATGTATACCCAAAG-3，。所述常规链式聚合酶反应具体步骤如下将混合液在94°C预变性5min，然后进入 下列循环94°C、50S，56°C、50S，72°C、90S，共进行30个循环，最后72°C延伸lOmin，扩增完 毕后置4°C终止反应；所述混合液组成如下浓度为lOumol/1的上游引物Pl 1 μ 1
浓度为IOumo 1/1的下游引物P2 1 μ 1dATP、dTTP、dCTP、dGTP 的浓度各为2. 5mM的dNTP混合物4 μ 1pCRG-L1 μ 1Ex耐热性DNA聚合酶反应缓冲液 5 μ 1
Ex耐热性DNA聚合酶0. 25 μ 1灭菌水37. 75 μ 1 ；将扩增产物纯化分离后，用IXTAE电泳缓冲液制备质量百分比浓度为1. 0%的琼 脂糖凝胶，取其中5μ1进行电泳，以DNA marker DL150作分子量参照，在紫外透射分析仪 下观察PCR产物片段大小，并拍照；结果如图3所示，PCR产物为2. 6kb的特异性片段，与预 期含玉米特异启动子基因和HBVL基因大小相符。将上述PCR产物经质量百分数的琼脂糖凝胶电泳分离，用PCR回收试剂 盒回收产物，用HindIII和Nhe I双酶切回收产物；同时用HindIII和Xba I双酶切 PCAMBIA1300 (载体pCAMBIA1300示意图如图8所示)(XbaI和Nhe I是同尾酶)；用凝胶回 收试剂盒纯化回收上述酶切产物，并将酶切产物以3 1的摩尔比混合，用T4DNA连接酶连 接过夜，转化至低温CaC12制备的大肠杆菌E. coli ToplO感受态中，然后涂布50 μ g/mL卡 那霉素的LB固体培养基中；次日，随机挑取单菌落接种于LB培养液中，37°C下振荡培养过 夜；首先进行菌液PCR鉴定，之后抽提质粒DNA，最后进行双酶切鉴定，筛选出的阳性克隆的 菌液送公司测序，测序工作由上海生物工程有限公司完成，鉴定结果表明所得质粒DNA为 重组质粒重组载体pCAMG-L.所述pCAMBIA-1300-N0S载体的构建方法(见图9)如下通过per技术以PBI 121 为模板扩增NOS终止子，用SacI和EcoRI完全双酶切NOS和pUC18，经1 %琼脂糖分离后用 胶回收试剂盒纯化回收酶切产物，将二者以T4连接酶连接，然后转化大肠杆菌，酶切鉴定 重组质粒，命名为PUC18-N0S。再用XbaI和EcoRI酶切pUC18_N0S，回收含有NOS及部分多 克隆位点的DNA片段，与经XbaI和EcoRI酶切的质粒pCAMBIA_130连接、转化，获得的重组 质粒命名为PCAMBIA-1300-N0S.用Xho I切除质粒pCAMBIA-1300_N0S内潮霉素抗性基因， 回收并进行末端脱磷酸；将含有bar基因片段的DNA与pCAMBIA-1300_N0S连接，转化获得 的重组质粒，测序鉴定，将构建的质粒的命名为pCAMBIA-1300-N0S-Bar (见图10)。(5)重组载体pCAMG-L的鉴定取菌落PCR阳性的菌落培养，提取质粒进行双酶切鉴定，反应体系参照见表1 ；体 系配好后旋涡振荡混勻，然后置于仪中37°C反应12小时，酶切产物用质量百分数的琼 脂糖凝胶电泳鉴定。在双酶切鉴定重组载体pCAMG-L时，选用位于HBV-L基因第633位碱基Xba I酶 切位点；三条泳道分别是用HindIII和BamH I、BamH和Xba I.Hindlll和Xba I双酶切植 物表达载体pCAMG-L，分别得到约1. 4kb、0. 6kb和2. Okb的特异性条带，如图4所示，与预期 启动子、0. 6bp的HBV-L部分基因片断、Globulin-L部分的融合片断的大小相符；证实 玉米 特异性启动子和HBV-L的融合基因Globulin-L已经插入植物表达载体中。表1重组载体pCAMG-L_Esat6酶切体系 提取筛选实施例1所得重组表达载体pCAMG-L，转化农杆菌LBA4404.预先制备农 杆菌LBA4404感受态，储存于_80°C冰箱备用；取200 μ L感受态细胞，冰上放置30min ；将 lug DNA加入感受态细胞中，液氮中速冻5min以上；37°C水浴快速解冻小于5min ；加入 800 μ L LB培养基；28°C摇床低速培养3h ；取200 μ L涂布于含50 μ g/mL卡那霉素的平板， 28°C摇床培养2d 3d ；经菌落PCR验证，挑选阳性克隆子摇菌，提取质粒后进行双酶切鉴 定，最终确定重组质粒转入到了 LBA4404中，-80°C保存菌株(见图5和图6)。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种包含了乙肝病毒L基因的玉米表达载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤(1)根据乙肝病毒L基因的编码序列设计1对引物上游引物序列为P1 5’-TTATCG GGATCC ATGGGAGGTTGGTCTTC-3’，含BamH I酶切位点和起始密码子；下游引物序列为P2 5’-CGCGCTGCTAGCTCAAATGTATACCCAAAG-3’，含Nhe I酶切位点和终止密码子；(2)将乙肝表面抗原阳性患者血清采用苯酚/氯仿抽提法获得DNA提取液，作为L基因扩增模板，用步骤(1)设计的引物P1和P2进行常规链式聚合酶反应，扩增出乙肝病毒L基因；(3)pCRG-L载体的构建用BamH I和Nhe I双酶切步骤(2)所得乙肝病毒L基因，用BamH I和Xba I双酶切pCR-G载体，将上述酶切纯化的产物按照摩尔比3∶1混合、连接、转化获得重组质粒pCRG-L；(4)重组载体pCAMG-L的克隆与构建以重组载体pCRG-L为模板，设计引物P3和P4进行常规链式聚合酶反应扩增得到Globulin-L基因，分离纯化后用HindIII和Nhe I双酶切，同时用HindIII和Xba I双酶切植物表达载体pCAMBIA1300，再将上述酶切产物进行同尾酶连接，转化，获得重组载体pCAMG-L；引物P3的序列为P35’-TTAATCGAAGCTTGCCGAGTGCCATCCT-3’，含HindIII酶切位点；引物P4的序列为5’-CGCGCTGCTAGCTCAAATGTATACCCAAAG-3’，含Nhe I酶切位点。
2.根据权利要求1所述的一种包含了乙肝病毒L基因的玉米表达载体的构建方法， 其特征在于步骤(2)所述常规链式聚合酶反应具体步骤如下将混合液在94°C预变性 5min,然后进入下列循环94°C、45s，56. 5°C、45s，72°C、60s，共进行30个循环，最后72°C延 伸lOmin，扩增完毕后置4°C终止反应；所述混合液组成如下浓度为lOumol/1的上游引物Pl1μ 1浓度为lOumol/1的下游引物P21 μ 1dATP、dTTP、dCTP、dGTP 的浓度各为2. 5mM的dNTP混合物4 μ 1DNA提取液5 μ 1Ex耐热性DNA聚合酶反应缓冲液5 μ 1Ex耐热性DNA聚合酶0. 25 μ 1灭菌水37. 75 μ 1。
3.根据权利要求1所述的一种包含了乙肝病毒L基因的玉米表达载体的构建方法， 其特征在于步骤(4)所述常规链式聚合酶反应具体步骤如下将混合液在94°C预变性 5min,然后进入下列循环94°C、50s，56°C >50s, 72°C、90s，共进行30个循环，最后72°C延伸 lOmin，扩增完毕后置4°C终止反应；所述混合液组成如下浓度为lOumol/1的上游引物Pl1μ 1浓度为lOumol/1的下游引物P21 μ 1dATP、dTTP、dCTP、dGTP 的浓度各为2. 5mM的dNTP混合物4 μ 1pCRG-L1 μ 1Ex耐热性DNA聚合酶反应缓冲液5 μ 1Ex耐热性DNA聚合酶0. 25 μ 1灭菌水37. 75 μ 1。
4.根据权利要求1所述方法构建的玉米表达载体作为制备疫苗的用途。
全文摘要
本发明公开了一种包含了乙肝病毒L基因的玉米表达载体及其应用。该玉米表达载体的构建方法是(1)根据乙肝病毒L基因的编码序列设计1对引物P1和P2；(2)用引物P1和P2进行常规链式聚合酶反应扩增乙肝病毒L基因；(3)pCRG-L载体的构建；(4)重组载体pCAMG-L的构建，并转化农杆菌。本发明选择具有驱动外源性基因在组织或器官表达特异性和高水平表达的双重优势的玉米种子特异性启动子Globulin-1，构建了由玉米种子特异表达启动子Globulin-1调控的结核优势乙肝病毒L基因，使其特异、高效地在玉米种子中表达。本发明乙肝病毒L基因的玉米表达载体可用于制备疫苗。
文档编号C12N15/82GK101845455SQ20101014084
公开日2010年9月29日 申请日期2010年3月31日 优先权日2010年3月31日
发明者李君武 申请人:暨南大学