专利名称：甲型流感病毒抗原决定区更换方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种甲型流感病毒不同毒株之间HA基因上 抗原性片段相互替换的甲型流感病毒抗原决定区更换方法。
背景技术：
流行性感冒简称流感，被人们认识已有一百余年的历史，每到秋冬以及冬春季节 会就发生流行，成为全球最严重的传染病之一。20世纪发生的几次全球性大规模流行，造 成大量人口死亡，给人类社会带来深重灾难。例如，因1918年的西班牙流感(H1N1)而死亡 的人数估计超过5000万，1957年的亚洲流感(H2N2)和1968年的香港流感(H3N2)也有几 百万人死亡，该病导致的死亡人数远远超过了因战争而死亡的人数。2009年，发端于墨西哥 的新甲型Hmi流感在全球肆虐。流感病毒是引起流感的病原体，属于正黏病毒科单股负义分节段的RNA病毒，根 据核蛋白和M蛋白抗原性的不同，分为甲、乙、丙三个型。其中乙型流感病毒抗原性相对稳 定，疫苗预防效果显著，并且普通人群自身携带的抗体已具有较好的免疫保护作用。丙型流 感病毒抗原性稳定，多为散发病例，不引起流行，危害小。但甲型流感病毒具有极易变异、亚 型众多、传染性强、宿主范围广等特点，是当前最难以控制的传染病原之一。引起世界范围 大流行的都是甲型流感病毒，近十年来人类感染H5m、H9N2、H7N7等亚型的禽流感病毒也 属于甲型流感病毒范畴。甲型流感病毒按其表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的 抗原性不同，又可分为16个HA亚型和9个NA亚型，并且在HA和NA上存在着多个抗原决 定区，如HI亚型的HA蛋白抗原决定区分为Sa、Sb、Cal、Ca2和Cb，H3亚型病毒的HA蛋白 抗原决定区分为A、B、C、D和E。甲型流感病毒抗原性变异分为抗原漂移和抗原转变两类。 抗原漂移指逐渐发生点或局部变异，引起流感的中小规模流行，一般认为抗原漂移使得流 感病毒每1 3年出现一次新变种；抗原转变指大的抗原变异，变异结果会产生新的不同亚 型，并且它的改变和病毒的毒力密切相关。由于人群对新的亚型缺乏相应抗体，常常会引起 大的流行。因此，亚型众多的甲型流感病毒及其抗原性极易变异等特点给疫苗研发带来了 巨大困难，常规灭活疫苗不能完全覆盖随时变异的流感病毒株，病毒往往能逃逸疫苗的保 护作用而引起大流行。现有的疫苗预防策略呈现一种明显的滞后状态，面对新的毒株或新 的亚型，原有疫苗无法提供足够有效的保护，需要在短时间内研发针对性疫苗。随着分子生 物学技术的飞速发展，反向基因操作系统的诞生与不断完善，使得人们定向改造流感病毒、 利用流感病毒为人类服务成为可能。本发明提出了一种流感病毒抗原更换的平台，通过反 向基因操作系统对流感病毒抗原性进行人为改变，在实现开发快速应变能力的流感疫苗， 以及以流感病毒为载体的基因治疗中具有重大的应用价值。反向遗传技术在病毒学研究领域具有重要作用，其中之一就是病毒的拯救和改 造。利用反向遗传技术，人们可以根据需要对病毒进行改造，人为拯救新型病毒，作为病毒 载体或疫苗株等来使用。1989年美国科学家首先利用反向基因操作系统并成功获得经人工 重组的流感病毒。1999年Neumann等利用反向基因操作系统在拯救流感病毒方面取得了
3重大突破，采用的全质粒系统摆脱了辅助病毒的使用。随着技术的进步，质粒数量由最起先 的17个不断缩减。目前最常用的是8个质粒系统，即RNA聚合酶I/II (Pol I/II)的双启 动子载体系统。反向基因操作系统已越来越被广泛应用，包括流感病毒的分子生物学研究、 流感疫苗的研制和流感病毒载体的尝试等，使得研究开发新型的流感疫苗成为可能。根据 流感病毒生物学特性，在其HA、NA和NS基因都可以携带外源基因片段，流感病毒作为基因 载体在基因治疗领域亦得到越来越多的关注。基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细 胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。基因 治疗目前主要是治疗那些对人类健康威胁严重的疾病，包括遗传病、恶性肿瘤、心血管疾 病、感染性疾病等。然而选择适合的载体则是治疗取得成功的关键因素。基因治疗常用载 体可分为非病毒载体和病毒载体两大类，其中非病毒载体转染能力差，动物水平研究以及 临床应用都受到巨大限制；而病毒载体具有感染效率高、宿主范围广、稳定性强等优势令人 瞩目。近年来，国内外学者利用逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、痘苗病毒载体等 在基因治疗上取得了较大进展，但是使用病毒载体首次治疗后因机体的免疫保护作用而使 得重复使用的疗效不理想，这个科学难题始终制约着病毒载体在临床治疗上的推广使用， 目前最为成熟的腺病毒载体也存在这个问题，尚不能有效解决。而亚型众多的流感病毒虽 然为疫苗研发带来了巨大困难，但是在基因治疗过程中为病毒载体的重复使用提供了有利 条件。流感病毒载体通过抗原的更换，再次使用时逃避免疫系统的追踪，从而有望能有效解 决病毒载体在重复使用效果不理想这一难题。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种甲型流感病毒抗原决定区更换 方法，本发明实现了不同亚型病毒之间以及同一亚型不同毒株之间的抗原区整体替换或部 分替换，为流感减毒性活疫苗和流感病毒载体在基因治疗中的应用提供有效的抗原性转换 技术平台。本发明中所涉及的装载流感病毒抗原区序列的转录载体为pPolI，全长HA基因 插入到pPolI两个BsmBI限制性内切酶识别位点之间。插入的HA基因片段通过序列分析 以及核苷酸定点突变，设定若干限制性酶切位点(这些酶切位点不存在于载体骨架上)，在 氨基酸序列上，将抗原区分为若干个部分，适用于抗原决定区序列的更换。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种甲型流感病毒抗原决定区更换方法，该方法包括以下步骤(1)从病毒培养液中克隆获得流感病毒全长血凝素基因，该血凝素基因两端包含 完整的非翻译区序列，并插入到转录载体PPolI中，构建出含有血凝素基因的重组转录载 体，作为反向基因操作系统的重组质粒之一。(2)在HA基因序列上选择合适位点进行定点突变，构建出新的限制性酶切位点， 适用于抗原决定区的更换。(3)不同抗原性流感病毒之间HA基因抗原决定区序列的相互更换所述的抗原决 定区序列相互更换包含两个内容，一个是抗原决定区序列的整体更换，或者是整条HA基因 的更换；一个是抗原决定区序列的部分更换。更换可以在同一亚型不同毒株的对应序列之 间进行，也可以在不同亚型不同毒株的对应序列之间进行。
(4)HA基因抗原决定区序列更换后重组病毒的拯救利用上述已进行过HA基因抗 原区DNA序列更换的重组质粒，通过8质粒的反向基因操作系统，共转染到293T细胞，并用 MDCK细胞增殖，拯救出抗原更换的重组流感病毒。本发明的有益效果是，1.减毒性流感病毒活疫苗候选株的快速构建一方面，通过上述抗原更换平台，可以将高致病性毒株的抗原更换为低致病性毒 株的抗原，对病毒株进行减毒；另一方面，通过上述抗原更换平台，可以有目的地改变流感 病毒株的抗原性，面对突发的流感疫情，将病原体的抗原决定区更换到原有的温度敏感性 减毒活疫苗上，使得重组病毒一方面保留低毒特征，一方面具有与病原体相似的抗原性，对 生产具有快速应变能力的减毒活疫苗具有重大意义。2.解决病毒载体不能重复使用的瓶颈问题基因治疗在未来攻克恶性肿瘤、遗传病等多种疑难病症方面具有非常广阔的应用 前景。病毒侵染人体细胞时能将自身的基因组携带到细胞内，并利用人体细胞内物质完成 自身繁殖，最终导致人类疾病。利用这一特性，去掉病毒基因组中与致病相关的基因，保留 其携带基因组进入人体细胞的功能，再组装上理想的外源基因，即成为一种病毒载体。病 毒载体具有感染效率高、宿主范围广、稳定性强等优势令人瞩目，在基因治疗上具有独特优 势。近年来，国内外学者利用逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、痘苗病毒载体等在 基因治疗上取得了较大进展，但是使用病毒载体首次治疗后因机体的免疫保护作用而使得 重复使用的疗效不理想，这个科学难题始终制约着病毒载体在临床治疗上的推广使用。目 前研究最为成熟的腺病毒载体虽然已经在临床上开展了诸多工作，但是始终无法有效突破 在同一个体上多次使用效果不佳这一困境。而流感病毒的抗原多样，多个亚型之间免疫交 叉反应弱这一特点，为解决这一难题带来希望。通过本发明可以对流感病毒进行有目的的 抗原更换，构建出一系列抗原多样的流感病毒载体系统，在重复使用时利用不同抗原性的 流感病毒载体进行多次治疗，逃避免疫系统的追踪，从而能有效解决病毒载体在重复使用 效果不理想这一难题。
图1为重组质粒pPolI/WSN-HA/Xba82/Hl的PCR鉴定图，图中，从左至右排列分别 是:M. DL2000 ；1.全长HA基因的PCR产物；2. Xbal和SacI酶切位点之间DNA片段的PCR产 物；3. SacI和Ncol酶切位点之间DNA片段的PCR产物；4. Ncol和EcoRI酶切位点之间DNA 片段的PCR产物；M. DL2000。图2为重组质粒pPolI/WSN-HA/Xba82/Hl的酶切鉴定图，图中，从左至右排列分 别是:M. DL2000 ； 1.pPolI/WSN-HA/Xba82/Hl ；2.pPolI/WSN-HA/Xba82/Hl 的 Nhel 酶切； 3. pPolI/WSN-HA/Xba82/Hl 的 Xbal 和 SacI 双酶切；4. pPolI/WSN-HA/Xba82/Hl 的 SacI 和 Ncol 双酶切；5. pPolI/WSN-HA/Xba82/Hl 的 Ncol 和 EcoRI 双酶切；M. DL2000。图3为重组质粒pPolI/Memphis-HA/Pst35/H3的PCR鉴定图，图中，从左至右排列 分别是M. 200bp DNA Ladder ；M. lkb DNA Ladder ； 1.全长 HA 基因的 PCR 产物；2. PstI 和 HindHI酶切位点之间DNA片段的PCR产物；3. HindHI和Xbal酶切位点之间DNA片段的 PCR产物；4. Xbal和Nsil酶切位点之间DNA片段的PCR产物；5. Nsil和SphI酶切位点之间DNA片段的PCR产物；6. SphI和Xhol酶切位点之间DNA片段的PCR产物。图4为重组质粒pP0lI/MemphiS-HA/PSt35/H3的酶切鉴定图，图中，从左至右排 列分别是1. pPolI/Memphis-HA/Pst35/H3 ；2. pPolI/Memphis_HA/Pst35/H3 的 Nhel 酶切； 3. pPolI/Memphis-HA/Pst35/H3 的 PstI 和 Hindlll 双酶切；4. pPolI/Memphis_HA/Pst35/ H3 的 Hindlll 和 Xbal 双酶切；5. pPolI/Memphis_HA/Pst35/H3 的 Xbal 和 Nsil 双酶切； 6. pPolI/Memphis-HA/Pst35/H3 的 Nsil 和 SphI 双切；7. pPolI/Memphis_HA/Pst35/H3 的 SphI 和 Xhol 双酶切；M. 200bp DNA Ladder ；M. lkb DNA Ladder。图5为重组质粒pPolI/HK312-HA/Xho68/H5的PCR鉴定图，图中，从左至右排列分 别是M. 200bp DNA Ladder ； 1.全长HA基因的PCR产物；2. Xhol和SacI酶切位点之间DNA 片段的PCR产物；3. SacI和BamHI酶切位点之间DNA片段的PCR产物；4. BamHI和SphI酶切 位点之间DNA片段的PCR产物；5. SphI和AfIII酶切位点之间DNA片段的PCR产物；M. lkb DNA Ladder。图6为重组质粒pPolI/HK312-HA/Xho68/H5的酶切鉴定图，图中，从左至右排列分 别是1. pPo11/HK312-HA/Xho68/H52. pPo11/HK312-HA/Xho68/H5 的 Nhel 酶切；3.pPolI/ HK312-HA/Xho68/H5 的 Xhol 和 SacI 双酶切；4. pPo 11/HK312-HA/Xho68/H5 的 SacI 和 BamHI 双酶切；5. pPo 11/HK312-HA/Xho68/H5 的 BamHI 和 SphI 双酶切；6. pPo 11/HK312-HA/Xho68/ H5 的 SphI 和 Aflll 双酶切；M. 200bp DNA Ladder ；M. lkb DNA Ladder。
具体实施例方式
发明内容
本发明甲型流感病毒抗原决定区更换方法，包括以下步骤1.从病毒培养液中克隆获得流感病毒全长血凝素基因，血凝素基因两端包含完整 的非翻译区序列，并插入到转录载体pHH21(又称为pPolI)中，构建出含有血凝素基因的重 组转录载体，作为反向基因操作系统的重组质粒之一。(1) HI亚型流感病毒以HI亚型流感病毒株A/WSN/1933 (H1N1)为材料，RT-PCR方法获得两端含有完整 非翻译区的全长HA基因片段，克隆到所述的转录载体pPolI的两个限制性酶切位点BsmBI 之间，该重组质粒命名为pPolI/WSN-HA/Hl。(2) H3亚型流感病毒以H3亚型流感病毒株A/Memphis/1/1971 (H3N2)为材料，RT-PCR方法获得两端含 有完整非翻译区的全长HA基因片段，克隆到所述的转录载体pPolI的两个限制性酶切位点 BsmBI之间，该重组质粒命名为pPolI/Memphis-HA/H3。(3) H5亚型流感病毒以H5亚型流感病毒株A/duck/HK/312/78 (H5N3)为材料，RT-PCR方法获得两端含 有完整非翻译区的全长HA基因片段，克隆到所述的转录载体pPolI的两个限制性酶切位点 BsmBI之间，该重组质粒命名为pPolI/HK312-HA/H5。2.在HA基因序列上选择合适位点进行定点突变，构建出新的限制性酶切位点，适 用于抗原决定区的更换。(1). HI亚型流感病毒
对上述的重组质粒pPolI/WSN-HA/Hl的HA基因序列进行核苷酸定点突变，同时利 用原有的部分限制性酶切位点，构建出HA基因的82位上有Xbal、124位上有Sacl、267位 上有NcoI、412位上有EcoRI酶切位点的重组质粒，命名为pPo 11/WSN-HA/Xba82/Hl，适用于 抗原决定区的更换。上述重组质粒pPolI/WSN-HA/Xba82/Hl的Xbal和SacI酶切位点之间 相距126个核苷酸；SacI和Ncol酶切位点之间相距429个核苷酸；Ncol和EcoRI酶切位点 之间相距435个核苷酸(图1、图2)。(2) H3亚型流感病毒对上述的重组质粒pP0lI/MemphiS-HA/H3的HA基因序列进行核苷酸定点突变，同 时利用原有的部分限制性酶切位点，构建出HA基因的35位上有PstI、109位上有Hindlll、 235位上有Xbal、298位上有Nsil、321位上有Sphl、425位上有Xhol酶切位点的重组质 粒，命名为pPolI/Memphis-HA/Pst35/H3，适用于抗原决定区的更换。上述重组质粒pPolI/ Memphis-HA/Pst35/H3的PstI和Hindlll酶切位点之间相距293个核苷酸；Hindlll和 Xbal酶切位点之间相距378个核苷酸；Xbal和Nsil酶切位点之间相距267个核苷酸；Nsil 和SphI酶切位点之间相距69个核苷酸；SphI和Xhol酶切位点之间相距312个核苷酸(图 3、图 4)。(3) H5亚型流感病毒对上述的重组质粒pPolI/HK312-HA/H5的HA基因序列进行核苷酸定点突变，同时 利用原有的部分限制性酶切位点，构建出HA基因的68位上有Xhol、149位上有SacI、193 位上有BamHI、306位上有Sphl、468位上有Aflll等酶切位点的重组质粒，命名为pPolI/ HK312-HA/Xho68/H5，适用于抗原决定区的更换。上述重组质粒pPo 11/HK312-HA/Xho68/H5 的Xhol和SacI酶切位点之间相距243个核苷酸；SacI和BamHI酶切位点之间相距132个 核苷酸；BamHI和SphI酶切位点之间相距339个核苷酸；SphI和Aflll酶切位点之间相距 486个核苷酸(图5、图6)。3.不同抗原性流感病毒之间HA基因抗原决定区序列的相互更换所述的抗原决定区序列相互更换包含两个内容，一个是抗原决定区序列的整体更 换，或者是整条HA基因的更换；一个是抗原决定区序列的部分更换。更换可以在同一亚型 不同毒株的对应序列之间进行，也可以在不同亚型不同毒株的对应序列之间进行。下面以高致病性病毒株A/Vietnam/1203/04(H5m)的抗原片段替换到低致病性 流感病毒 A/duck/HK/312/78 (H5N3)为例。(1).流感病毒HA基因抗原决定区序列的整体更换当进行整条基因更换时，将上述的重组质粒pPolI/HK312-HA/Xho68/H5中HA基因 片段切除，插入A/Vietnam/1203/04(H5m)毒株的HA基因片段的相对应序列，使得新构建 的重组质粒中包含的HA基因完全来源于A/Vietnam/1203/04 (H5N1)毒株，起到完全更换的 效果。(2).流感病毒HA基因抗原决定区序列的部分更换当进行抗原区部分更换时，则在上述重组质粒PPolI/HK312-HA/Xho68/H5的 Xhol、SacI、BamHI、SphI、Aflll酶切位点中，根据所需要替换的抗原区大小及位置选择 合适的两个酶切位点。如所需要更换的抗原区在酶切位点SacI和SphI之间，则可采 用PCR扩增或酶切方法得到A/Vietnam/1203/04 (H5W)毒株HA基因相应区段的DNA片
7段，插入到上述的重组质粒pPo 11/HK312-HA/Xho68/H5中，替代原有相对应的基因序列， 使得新构建的重组质粒HA基因SacI和SphI酶切位点之间的DNA序列来源于毒株A/ Vietnam/1203/04 (H5N1)，起到部分更换的效果。采用上述整体更换和部分更换方法，可以对任意两个同一亚型或不同亚型的流感 病毒株之间进行抗原决定区的相互替换。4. HA基因抗原决定区序列更换后重组病毒的拯救利用上述已进行过HA基因抗原区DNA序列更换的重组质粒，通过8质粒的反向基 因操作系统，共转染到293T细胞，并用MDCK细胞增殖，拯救出抗原更换的重组流感病毒。下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。但这些实施例不得理解为任何意义 上对本发明的限制。实施例1血凝素基因的克隆在生物安全柜中，按Initrogen公司说明书提供的方法用Trizol提取病毒RNA， 以V13为逆转录引物，通过反转录酶MMLV合成病毒cDNA。并以上述的病毒cDNA为模板， 通过V12和V13两条引物PCR扩增获得两端含有完整非翻译区的全长HA基因片段。再以 此全长HA基因片段为模板，通过5BmHA和3BmHA两条引物扩增得到HA全长基因，同时在基 因的两端各自引入一个BsmBI限制性酶切位点。具体就是用于扩增HI亚型流感病毒(A/ WSN/1933)全长HA基因的引物是V12和V13，再以扩增产物为模板，通过引物5BmHA和3BmHA 在HA基因两端各引入一个BsmBI限制性酶切位点，用于克隆到转录载体pPolI中；用于扩 增H3亚型流感病毒(A/Memphis/1/1971)全长HA基因的引物是V12和V13，再以扩增产物 为模板，通过引物5BmHA和3BmHA在HA基因两端各引入一个BsmBI限制性酶切位点，用于 克隆到转录载体pPolI中；用于扩增H5亚型流感病毒(A/duck/HK/312/78)全长HA基因的 引物是V12和V13，再以扩增产物为模板，通过引物5BmHA和3BmHA在HA基因两端各引入一 个BsmBI限制性酶切位点，用于克隆到转录载体pPolI中。上述PCR的引物序列分别为V12 :AGCAAAAGCAGG ；V13 :AGTAGAAACAAGG ；5BmHA TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG3BmHA :ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT。实施例2全长HA基因克隆到转录载体pPolI将实施例1所述的两端都具有BsmBI限制性酶切位点的全长HA基因用BsmBI酶 切，酶切产物纯化后与BsmBI酶切的转录载体pPolI连接，筛选得到重组质粒后并进行DNA 序列测定。在pPolI中插入HI亚型A/WSN/1933(H1N1)毒株HA基因的重组质粒命名为 pPolI/WSN-HA/Hl ；在 pPolI 中插入 H3 亚型 A/Memphis/1/1971 (H3N2)毒株 HA 基因的重组 质粒命名为 pPolI/Memphis-HA/H3 ；在 pPolI 中插入 H5 亚型 A/duck/HK/312/78 (H5N3)毒 株HA基因的重组质粒命名为pPo 11/HK312-HA/H5。实施例3定点突变，引入新的酶切位点
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通过定点突变的方法，在实施例2所述的重组质粒中引入新的酶切位点，用于抗 原更换。以在所述的重组质粒pPolI/WSN/Hl中引入Xbal限制性酶切位点为例，具体步骤 如下以 pPolI/WSN/Hl 为模板，以 HlXbaHA82F 和 HlXbaHA82R 为点突变引物，进行 PCR 扩增。扩增条件为94°C预变性3min ；94°C变性45s、55°C退火45s、72°C延伸6min，共18个 循环，最后72°C延伸lOmin。扩增产物纯化后用限制性内切酶Dpnl在37°C消化lh，乙醇/ 醋酸钠沉淀后溶于20 yl双蒸水中，取1 yl转化大肠杆菌DH5 a，筛选突变克隆并进行序列 测定，证实引入Xbal酶切位点。经过点突变的HA基因含有Xbal、SacI、Ncol、EcoRI酶切 位点(图2)。以H3Pst35HAF和H3Pst35HAR为点突变引物，应用上述方法进行定点突变，在所述 的重组质粒pPolI/MemphiS-HA/H3血凝素基因的35位引入PstI酶切位点，经过定点突变 的HA基因含有限制性酶切位点PstI、HindIII、XbaI、NsiI、SphI、XhoI。以H5XhoHA68F和H5XhoHA68R为点突变引物，应用上述方法进行定点突变，在所述 的重组质粒pPolI/HK312-HA/H5血凝素基因的68位引入Xho I酶切位点，经过定点突变的 HA基因含有限制性酶切位点Xhol、SacI、BamHI、SphI、AfIII。上述定点突变的引物分别是HlXbaHA82F GGGAAATCTAGAATGCGAC ；HlXbaHA82R :GTCGCATTCTAGATTTCCC ；H3Pst35HAF CATCCTGCAGTGCCAAAC ；H3Pst35HAR :GTTTGGCACTGCAGGATG ；H5XhoHA68F CCTCTCATCTCGAGGGATTG ；H5XhoHA68R CAATCCCTCGAGATGAGAGG实施例4抗原更换——全基因更换将高致病性病毒株A/Vietnam/1203/04 (H5N1)的HA基因整体更换到低致病性毒 株 A/duck/HK/312/78 (H5N3)中。对于流感病毒株 A/Vietnam/1203/04 (H5N1)，按照实施例 1所述的血凝素基因克隆方法，扩增得到两端各自有一个BsmBI限制性酶切位点的完整HA 基因(包含5’端和3’端的非翻译区)，BsmBI酶切后并进行纯化。同时用BsmBI对所述重 组质粒pPolI/HK312-HA/H5进行酶切，去除来源于A/duck/HK/312/78 (H5N3)的HA基因片 段后并进行纯化。两者连接后筛选重组克隆，获得的重组质粒(命名为pPolI/VN1203-HA/ H5)的HA基因完全来源于A/Vietnam/1203/04 (H5N1)，HA基因得到整体更换。实施例5抗原更换——部分抗原区更换将高致病性流感病毒A/Vietnam/1203/04 (H5W)的部分抗原片段替换到低致病 性流感病毒A/duck/HK/312/78 (H5N3)中，以SacI和SphI两个酶切位点之间抗原区序列的 更换为例。通过序列分析，A/Vietnam/1203/04(H5N1)和 A/duck/HK/312/78 (H5N3)两个病 毒株的相应位置都具有SacI和SphI两个酶切位点。通过PCR扩增或双酶切方法获得A/ Vietnam/1203/04 (H5N1)病毒株HA基因中位于SacI和SphI两个酶切位点之间的DNA片段，并进行纯化。同时用SacI和SphI双酶切重组质粒pPolI/HK312-HA/Xho68/H5，去除SacI 和SphI位点之间的DNA片段后进行纯化。将上述两个经纯化的DNA片段进行连接，筛选重 组克隆。获得的重组质粒中，HA基因上SacI和SphI位点之间的基因序列来源于病毒株A/ Vietnam/1203/04 (H5N1)，HA基因的抗原区序列得到部分更换。实施例6拯救获得HA基因抗原更换的重组病毒流感病毒拯救以8质粒反向基因操作系统为基础，共转染到293T细胞，并用 MDCK 细胞增殖。8 个质粒分别为 pPol-II/I-Ann60-PB2、pPol-II/I-Ann60_PBl、pPol-II/ I-Ann60-PA、pPol-II/I-Ann60-NP、pPol-II/I-Ann60-HA、pPol-II/I-Ann60-NA、pPol-II/ I-Arm60-M、pPol-II/I-Arm60-NS(参见国际流行病学传染病学杂志的第33卷第5期，“改 进型反向基因操作系统的构建和流感病毒变异株的选育”一文)。若要获得HA基因经过抗原更换的重组流感病毒，则采用上述反向基因操作系统， 其中质粒pPOl-II/I-Arm60-HA可根据需要进行选择性替换。例如要将重组病毒的HA完 全更换为毒株 A/Vietnam/1203/04(H5m)的 HA，则只要将 pPol-II/I-Ann60-HA 替换成 pPolI/VN1203-HA/H5 即可。
权利要求
一种甲型流感病毒抗原决定区更换方法，其特征在于该方法包括以下步骤(1)从病毒培养液中克隆获得流感病毒全长血凝素基因，该血凝素基因两端包含完整的非翻译区序列，并插入到转录载体pHH21(又称为pPolI)中，构建出含有血凝素基因的重组转录载体，作为反向基因操作系统的重组质粒之一。(2)在HA基因序列上选择合适位点进行定点突变，构建出新的限制性酶切位点，适用于抗原决定区的更换。(3)不同抗原性流感病毒之间HA基因抗原决定区序列的相互更换。(4)HA基因抗原决定区序列更换后重组病毒的拯救。
2.根据权利要求1所述甲型流感病毒抗原决定区更换方法，其特征在于所述步骤(3) 中，所述的抗原决定区序列相互更换包含两个内容，一个是抗原决定区序列的整体更换，或 者是整条HA基因的更换；一个是抗原决定区序列的部分更换。更换可以在同一亚型不同毒 株的对应序列之间进行，也可以在不同亚型不同毒株的对应序列之间进行。
3.根据权利要求1或3所述甲型流感病毒抗原决定区更换方法，其特征在于所述步 骤(4)具体为利用上述已进行过HA基因抗原区DNA序列更换的重组质粒，通过8质粒的 反向基因操作系统，共转染到293T细胞，并用MDCK细胞增殖，拯救出抗原更换的重组流感 病毒。
全文摘要
本发明公开一种甲型流感病毒抗原决定区更换方法。本发明针对抗原决定区的位置，利用和设计酶切位点，能够实现同一亚型或不同亚型流感病毒株相互之间抗原决定区序列的整体或部分更换，并利用8质粒反向基因操作系统拯救出抗原性经过人为定向改变的重组流感病毒，在流感病毒减毒性活疫苗的快速制备和病毒载体在基因治疗中多次重复使用方面具有重大的应用价值。
文档编号C12N7/01GK101857872SQ201010140628
公开日2010年10月13日 申请日期2010年4月6日 优先权日2010年4月6日
发明者沃恩康, 郭潮潭 申请人:浙江省医学科学院