专利名称：：一种鉴别中国地方猪种和欧洲地方猪种的方法
技术领域：
：本发明涉及畜牧领域，涉及利用mtDNA基因特异组合单倍型鉴别中国地方猪种和欧洲地方猪种的方法。
背景技术：
：千百年来，猪一直是人们生活中最重要的肉用动物之一，它性情温顺，易饲养，且出栏较快，深受广大养殖户的喜爱。猪的驯化可以追溯到9000-10000年以前(B5k5nyi1974)。在此期间，不同地理区域的国内外野猪被驯化。由于各地的气候条件及人们的喜好不同，选育的地方品种具有不同的地域特征性毛皮、体型和生产性状等。根据《中国畜禽遗传资源状况》(2004)编委会调查数据显示中国现存72个地方品种，大致可以分为六种类型，分别为华北型，华南型、华中型、江海型、西南型和高原型(张仲葛等.1986;Xu1987)。中国地方猪种由于具有繁殖性能好、母性强和耐粗饲等特点，在19世纪中期引入到法国、美国及英国等地，作为母本与国外地方猪种进行杂交以改良当地猪品种。如何识别欧洲原种猪(优良地方猪种)，并做到真正引种是我国引种工作中的一个重要问题。线粒体DNA在畜禽遗传多样性和起源鉴定中发挥着越来越重要的作用，同时不同类群线粒体DNA的遗传变异也揭示了畜禽驯化的历史(Brownetal.1979；Avisel994)。ATP合酶广泛存在于哺乳动物线粒体中，是生物体能量代谢的关键酶。该酶位于线粒体内膜上，参与氧化磷酸化与光合磷酸化反应，在跨膜质子动力势的推动下催化合成ATP。ATP合酶由Fl和FO两部分组成，其中Fl亚基由核基因编码，而FO亚基由线粒体基因和核基因共同编码，编码FO亚基的两个线粒体基因为mtATP6和mtATP8基因。近几年，相关报道表明人类许多疾病是由线粒体功能丧失所引起的，例如人类mtATP6基因8993位T>G的突变会引起156位编码氨基酸的改变，其中从亮氨酸变为精氨酸(Tatuchetal.1992；Manfredietal.1999；Garciaetal.2000)。但是，关于不同猪品种mtATP6和mtATP8基因遗传变异的报道并不多见。最近有少量研究报道了在部分国外猪种、中国地方品种和野猪中进行线粒体DNA多样性研究的结果(Kijas&Andersson2001，Yangetal.，2003，Wuetal.，2007)，但以上研究及相关文献中并没有报道关于影响ATP合酶组成的相关基因在群体水平的遗传变异研究，而且也没有报道鉴别中国地方猪种和国外地方猪种的特异组合单倍型研究的结果。
发明内容本发明的目的在于提供一种鉴别中国地方猪种和欧洲地方猪种的方法。本发明的另一个目的在于提供用于鉴别中国地方猪种和欧洲地方猪种的试剂盒。发明人研究发现，中国地方猪种和欧洲地方猪种mtATP6基因和mtATP8基因存在多态性差异，通过对相关位点的检测可以用来鉴别中国地方猪种和欧洲地方猪种。进而，本发明提供一种用于鉴别中国地方猪种和欧洲地方猪种的方法，其是通过检测mtATP6基因的第591位碱基和mtATP8基因的第21位碱基，当mtATP6基因的第591位碱基为C且mtATP8基因的第21位碱基为T时，该猪种为中国地方猪种，当mtATP6基因的第591位碱基为T且mtATPS基因的第21位碱基为C时，该猪种为欧洲地方猪种。可使用测序或者是探针杂交等不同方式进行检测。本发明还进一步提供了一种具有较高实用性的检测方法，该方法通过PCR分别扩增mtATP6基因和mtATPS基因，利用FokI分别酶切扩增产物，并凝胶电泳检测，其中mtATP6基因酶切产物呈现4条带且mtATPS基因酶切产物呈现1条带的为中国地方猪种，mtATP6基因酶切产物呈现3条带且mtATPS基因酶切产物呈现2条带的为欧洲地方猪种。进而，本发明还提供一种用于鉴别包括用于扩增mtATP6基因和/或mtATPS基因的引物，以及FokI酶。该试剂盒还可以进一步包括其它在检测过程中所使用到的试剂。本发明方法能够快速、准确鉴别中国地方猪种和欧洲地方猪种，并且易于实验室操作，污染少，成本低，具有较强的实用性。本发明试剂盒，具有广阔的应用前景，能够产生可观的经济效益和良好的社会效益。图1显示的是mtATP6基因FokI酶切产物电泳图，其中A代表339/164/149/91bp带型；B代表488/164/91bp带型；M表示分子量标准；图2显示的是mtATP8基因FokI酶切产物电泳图，其中C代表425bp带型；D代表160/265bp带型；M表示分子量标准。具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明通过对不同猪品种mtATP6和mtATP8基因全序列和诊断性SNP分析来揭示中国地方猪种和欧洲地方猪种线粒体DNA的遗传多样性。其中研究对象包括6个传统类型23个地方品种(民猪、二花脸、乐平、荣昌、香猪、藏猪、八眉、蓝塘、五指山、巴马香猪、版纳微型猪、撒坝猪、通城、玉山、汉江、内江、黔北黑、小梅山、嘉兴黑、金华、桂中、莆田黑和上高猪)、3个不同类型中国野猪品种(华南、浙江和东北野猪)和3个欧洲品种(大白、长白和杜洛克)共805个个体(无亲缘关系)。采用氯仿抽提法从猪耳组织中提取基因组DNA，用NanoDropND-1000分光光度计检测其DNA的浓度和纯度。根据GenBank信息(登录号AJ002189)分别设计特异性引物扩增mtATP6(nt7923nt8665)和mtATP8(nt7625nt8049)基因全长，其中核苷酸具体位置以NCBI数据库中Ursing和Arnason报道的猪线粒体DNA序列位置标示为基准(Ursing&Arnason1998)。试验首先采用PCR扩增，所得产物进行测序。序列结果利用ChromasProvl.41软件进行分析，然后采用Clustalw在线软件(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)进行序列比对，寻找品种间的重要SNP。为了试验的精准性，发明人对疑似SNP进行重测序验证，同时采用DNAMAN软件进行序列酶切位点分析。最后从群体水平对上述重要SNP进行组合单倍型分析。结果表明中国地方猪种和欧洲地方猪种在mtATP6和mtATP8基因存在多态性。实施例1采用氯仿抽提法从猪耳组织中提取基因组DNA，根据GenBank信息(登录号AJ002189)分别设计特异性引物扩增mtATP6(nt7923nt8665，SEQIDNo.1)和mtATP8(nt7625nt8049,SEQIDNo.1)基因全长。其中扩增mtATP6基因的引物为mtATP6-F:5’-AGCACCCCTTGAGAAATA-3’禾口mtATP6-R:5’-GGCTTGGGTTTACTATGTG-3，。扩增mtATP8基因的引物为mtATP8_F:5，-TGGATCAAACCACAGCTTCA-3，禾口mtATP8-R:5’-CGTTTGGGTGTTGGGAATAG-3，。反应体系如下总体系为25μ1，其中包括IOOng的基因组DNA、1.2μ1上游引物(lOpmol/μ1)、1·2μ1下游引物(lOpmol/μ1),2.5μ1的10XPCRBuffer,2μ1的dNTPs(0.25mM)和2.5U的Taq聚合酶。反应程序950C预变性5min，进入以下循环94°C、lmin,55°C、30sec，72°C、lmin，进行35个循环，最后一个循环结束时，72°C延伸7min。PCR产物经过琼脂糖电泳检测后进行测序，结果如表1所示。表1不同品种猪的mtATP6基因及mtATP8基因的相关位点差异<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由表1可以看出，中国地方猪种mtATP6基因的第591位碱基为C且mtATP8基因的第21位碱基为T；而欧洲地方猪种mtATP6基因的第591位碱基为T且mtATP8基因的第21位碱基为C。通过检测这两个位点的变异即可实现对中国地方猪种和欧洲地方猪种的鉴别。实施例2按照实施例1方法扩增mtATP6和mtATP8基因全长。采用总反应体系为20μ1，其中包括5μIPCR产物和1.25μ1内切酶FokI(酶切位点为GGATG(N)9Τ)的混合体系在37°C条件下10-12小时消化，随后将酶切产物上样于3%琼脂糖胶电泳中，在75V的电压条件下电泳80分钟进行检测。mtATP6基因序列中通常有3处FokI酶切位点，经过FokI酶切可产生164+9l+339+149bp这4个片段(泳道1)，当第591位碱基处由C突变为T时，导致第574位碱基处酶切位点的消失，此处只存在2个FokI酶切位点，产生164+91+488bp这3个片段。如图1所示，PCR产物经限制性内切酶FokI酶切后，产生两种带型339/164/149/91bp(泳道l)、488/164/91bp(泳道2)，分别命名为A型和B型。如图2所示，mtATP8基因序列中由于第21位碱基处突变产生一个FokI酶切位点，经过FokI酶产生两种带型425bp(泳道l)、160/265bp(泳道2)，分别命名为C型和D型。根据FokI酶特征序列特点，检测到mtATP6基因第144、234和572碱基处存在多态性，mtATP8基因第三碱基处存在多态性。不同猪种的PCR产物的酶切结果按照上述类型区分结果，如表2所示。表2不同猪种的PCR产物的酶切结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>上述群体数据分析表明AC组合单倍型仅出现在亚洲品种中，而BD组合单倍型出现在欧洲地方猪种中，单倍型AC和BD可以分别作为鉴别中国地方猪种和欧洲地方猪种的特异组合单倍型。通过对国外引进种猪进行抽样检测(酶切结果)发现，引进的欧洲猪品种(大白、长白和杜洛克)中部分个体具有中国地方猪种单倍型AC，可以推断此部分欧洲猪个体是经过中国地方猪种改良的个体，不是国外原始地方猪种。权利要求一种鉴别中国地方猪种和欧洲地方猪种的方法，其特征在于，通过检测mtATP6基因的第591位碱基和mtATP8基因的第21位碱基，当mtATP6基因的第591位碱基为C且mtATP8基因的第21位碱基为T时，该猪种为中国地方猪种，当mtATP6基因的第591位碱基为T且mtATP8基因的第21位碱基为C时为欧洲地方猪种。2.一种鉴别中国地方猪种和欧洲地方猪种的方法，其特征在于，通过PCR分别扩增mtATP6基因和mtATP8基因，利用FokI分别酶切扩增产物，并凝胶电泳检测，其中mtATP6基因酶切产物呈现4条带且mtATPS基因酶切产物呈现1条带的为中国猪种，mtATP6基因酶切产物呈现3条带且mtATPS基因酶切产物呈现2条带的为欧洲地方猪种。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，用于扩增mtATP6基因的PCR引物为mtATP6-F:5’-AGCACCCCTTGAGAAATA-3’和mtATP6-R:5’-GGCTTGGGTTTACTATGTG-3，。4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，用于扩增mtATPS基因的PCR引物为mtATP8-F:5’-TGGATCAAACCACAGCTTCA-3’禾口mtATP8-R:5’-CGTTTGGGTGTTGGGAATAG-3，。5.用于鉴别中国地方猪种和欧洲地方猪种的检测试剂盒，其包括用于扩增mtATP6基因和/或mtATP8基因的引物，以及FokI酶。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述用于扩增mtATP6基因的PCR引物为mtATP6-F5'-AGCACCCCTTGAGAAATA-3‘禾ΠmtATP6-R:5’-GGCTTGGGTTTACTATGTG-3，。7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述用于扩增mtATPS基因的PCR引物为mtATP8-F:5’-TGGATCAAACCACAGCTTCA-3’禾口mtATP8-R:5’-CGTTTGGGTGTTGGGAATAG-3，。全文摘要本发明提供了一种鉴别中国地方猪种和欧洲地方猪种的方法，其通过检测mtATP6基因第591位碱基和mtATP8基因第21位碱基的突变来鉴别检测个体为中国地方猪种还是欧洲地方猪种，或者通过对mtATP6基因和mtATP8基因的酶切产物凝胶电泳进行鉴别。本发明还提供了相关检测试剂盒。本发明方法快速、准确，易于实验室操作，污染少，成本低，具有较强的实用性。本发明试剂盒，具有广阔的应用前景，能够产生可观的经济效益和良好的社会效益。文档编号C12Q1/68GK101805800SQ20101015560公开日2010年8月18日申请日期2010年4月21日优先权日2010年4月21日发明者刘刚,刘月平,张浩,方美英,黄金明申请人:中国农业大学