专利名称：：一种根据烟叶加工实际温度来测定烟叶酶活力的方法
技术领域：
：本发明涉及一种根据烟叶加工实际温度来测定烟叶酶活力的方法，属于烟草应用
技术领域：
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背景技术：
：烟叶的加工过程使烟叶品质发生了很大的变化，如自然陈化、打叶复烤、润叶和制丝过程。普遍认为，烟叶酶对烟叶品质的形成起了重要作用。例如α-淀粉酶是烟叶中的淀粉降解的重要酶。蛋白酶烟草蛋白质降解的重要酶。多酚氧化酶是烟叶中酶促棕化反应的重要酶，可使多酚氧化生成与香气有关的物质，并使烟叶颜色加深。脂氧合酶是类胡萝卜素降解的关键酶，类胡萝卜素在脂氧合酶作用下氧化分解的中间产物香叶醇、紫罗兰酮、紫黄质、黄质醛等是烟叶重要的致香物质，对烟叶香气品质的改善具有重要意义。苯丙氨酸裂解酶是烟叶苯丙氨酸代谢中的重要酶，烟叶中许多重要挥发性香气成分如苯甲醇、苯乙醇等的形成与其代谢有密切关系。根据大量文献报道，这五种酶对烟叶品质的形成有重要影响。因此，为了深入了解烟叶加工过程中各种工序对烟叶品质形成的作用，通常需要测定烟叶酶活力的变化。文献报道烟叶酶活力的测定方法主要来自于植物生理学，测定温度都是各种酶的最适宜反应温度(即标准温度)，范围从37°C--40°C。例如α-淀粉酶为37-40°C，蛋白酶为37°C，多酚氧化酶为35-37°C，脂氧合酶为35°C和苯丙氨酸裂解酶为30-35°C。重要文献如下1.朱广廉，钟诲文，张爱琴；植物生理学实验；北京大学出版社1990年2.李合生；植物生理生化实验原理和技术；高等教育出版社2000年3.中国科学院上海植物生理研究所，上海市植物生理学会编；现代植物生理学实验指南；科学出版社1999年4.BerkelyHD.MeasurementofLipoxygenaseactivityincrudeandpartiallyrurifiedpotatoextracts.J.Food.Sci.,1976,15:14751479.5.张志良.植物生物化学技术与方法.北京农业出版社，1986.6.赵铭钦，邱立友，张维群，等；陈化期间烤烟叶片中生物活性变化的研究；华中农业大学学报,2000，19(6)537-5427.宫长荣，林学梧，李艳梅；烟叶在烘烤过程中脂氧合酶活性及其作用的研究；西北农业大学，1999，8(4)63-668.朱大恒，陈再根，陈锐，等；烤烟自然醇化与人工发酵过程中微生物变化及其与酶活性关系的研究；中国烟草科学，2001，226-30文献报道的测定温度是酶活力达到最大值时的最适宜温度，并没有考虑烟叶加工过程中的实际温度。在实际温度下，各种酶反应无法达到最适宜温度，因此，如果按照标准温度测定，就无法真实了解实际烟叶加工过程中的酶活力变化。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术不能反应烟叶加工过程中酶活力的真实情况的不足，而提供一种根据烟叶加工实际温度来测定烟叶酶活力的方法。本发明根据烟叶加工实际温度，调整现有烟叶酶活力测定的温度，使之与烟叶加工过程中的实际温度相符合，更能客观反映烟叶加工过程中烟叶酶活力的影响，为探索通过酶作用提高烟叶品质提供更为客观的研究方法。本发明的方法是在现有方法基础上的改进，其改进点在于1、在烟叶加工过程中酶活力的测定温度为加工实际温度。本发明针对烟叶加工过程中不同工序有不同的加工温度，将酶活力测定的温度定为烟叶实际加工温度。2根据不同陈化地点的环境温度来测定陈化烟叶的五种酶活力。本发明选择了两陈化地点的环境平均温度来测定陈化烟叶的五种酶活力，环境平均温度为15°C或25°C，五种酶活力的标准检测温度为α-淀粉酶为37_40°C，蛋白酶为37°C，多酚氧化酶为35-37°C，脂氧合酶为35°C和苯丙氨酸裂解酶为30_35°C。调整温度后测定的五种酶活力与标准测定温度下的酶活力明显差异，更能反映烟叶陈化的真实状况。本发明的优点在于更能客观反映烟叶加工过程中烟叶酶活力的影响，为探索通过酶作用提高烟叶品质提供更为客观的研究方法。图1玉溪陈化烟叶两种测定温度下多酚氧化酶活力比较。图2元江陈化烟叶两种测定温度下多酚氧化酶活力比较。图3玉溪陈化烟叶两种测定温度下α-淀粉酶活力比较。图4元江陈化烟叶两种测定温度下α-淀粉酶活力比较。图5玉溪陈化烟叶两种测定温度下脂氧合酶活力比较。图6元江陈化烟叶两种测定温度下脂氧合酶活力比较。图7玉溪陈化烟叶两种测定温度下苯丙氨酸裂解酶活力比较。图8元江陈化烟叶两种测定温度下苯丙氨酸裂解酶活力比较。具体实施例方式1、试验方法a.烟叶粗酶液制备称取2g烟叶样品，加入0.1MPH7.0的磷酸缓冲液15ml，混勻，超声震荡30分钟，3000g/分离心lOmin，过滤即得酶液，4度保存备用。b.酶活力测定α-淀粉酶、蛋白酶、多酚氧化酶采用现有方法文献[1]朱广廉的方法测定；脂氧合酶采用现有方法文献[^Berkeley等的方法测定；苯丙氨酸裂解酶采用现有方法文献[5]张志良等的方法测定。2.不同测定温度对酶活力的影响每一种酶都有最适的反应温度，而酶活力的测定都是选取最适的温度条件进行。我们在35°C、45°C、55°C条件下测定标准耐高温α-淀粉酶、耐中温α-淀粉酶和中性蛋白酶的酶活力，结果见表1。从表中可看出在不同温度下，耐高温α-淀粉酶和中性蛋白酶随温度的升高，酶活性升高，55°C最高。而耐中温α-淀粉酶45°C较高，55°C酶失活。表1不同测定温度下的标准酶活力比较<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>改变烟叶酶活力测定的温度，在35°C、45°C、55°C条件下测定，获得的数据见表2，从表中可看出α-淀粉酶在55°C时的酶活力显著高于35°C和45°C，35°C和45°C时的酶活力基本无差异。蛋白酶在45°C时的酶活力高于35°C和55°C，但三个温度下测定的酶活力无明显差异。多酚氧化酶在45°C和55°C时的酶活力显著高于35°C，但45°C和55°C之间无差另O。脂氧合酶在35°C和55°C时的酶活力显著高于45°C，但35°C和55°C之间无差别。苯丙氨酸裂解酶在35°C和45°C时的酶活力显著高于55°C，但35°C和45°C之间无显著差别。表2不同测定温度下的烟叶酶活力比较<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>3、不同陈化地点烟叶的酶活力测定在环境温度和标准温度下的比较玉溪陈化仓库平均温度15°C，元江陈化仓库平均温度25V，为了考察这两个陈化地点烟叶的五种酶活力的差异，采用了环境实际温度来测酶活力，玉溪陈化的烟叶五种酶活力的测定统一采用15°C，元江陈化的烟叶五种酶活力的测定统一采用25°C。而五种酶活力的标准检测温度如下α-淀粉酶为37-40°C，蛋白酶为37°C，多酚氧化酶为35_37°C，月旨氧合酶为35°C和苯丙氨酸裂解酶为30-35°C。多酚氧化酶活力测定比较见以下图1和图2。从图中可看出在环境温度和标准温度测定条件下，酶活力明显不同，环境温度测定的酶活力明显低于标准测定温度。其余酶α-淀粉酶、蛋白酶37°C、脂氧合酶35°C和苯丙氨酸裂解酶的情况和多酚氧化酶相类似。这说明在实际环境陈化条件下，酶反应的温度无法达到标准温度，而标准温度是酶活力达到最大值时的最适宜温度，因此，如果按照标准温度测定，就无法真实了解实际烟叶陈化过程中的酶活力变化。权利要求一种根据烟叶加工实际温度来测定烟叶酶活力的方法，在现有方法基础上改进而成，其特征在于a.在烟叶加工过程中实际酶活力的测定温度为烟叶实际加工温度；b.根据不同陈化地点的环境平均温度来测定陈化烟叶的五种酶的实际酶活力。全文摘要本发明涉及一种根据烟叶加工实际温度来测定烟叶酶活力的方法，属于烟草应用
技术领域：
。本发明在现有方法基础上改进而成，其改进点在于a.在烟叶加工过程中实际酶活力的测定温度为烟叶实际加工温度；b.根据不同陈化地点的环境平均温度来测定陈化烟叶的五种酶的实际酶活力。本发明的优点在于更能客观反映烟叶加工过程中烟叶酶活力的影响，为探索通过酶作用提高烟叶品质提供更为客观的研究方法。文档编号C12Q1/40GK101831487SQ20101015528公开日2010年9月15日申请日期2010年4月26日优先权日2010年4月26日发明者任一鹏,唐兴宏,夭建华,王毅,简彬,马永凯申请人:红塔烟草(集团)有限责任公司