专利名称：：牦牛铜锌超氧化物歧化酶重组表达蛋白质的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程
技术领域：
，具体地说，涉及一种构建牦牛Cu，Zn-SOD-m22b(+)~E.co7iBL21(DE3)基因工程菌及IPTG诱导表达与重组蛋白质纯化的技术。
背景技术：
：超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)是一类含有不同金属离子的氧化还原酶，广泛存在于自然界各种生物体内，按所含金属辅因子的不同，可将SOD分为3大类型铜锌超氧化物歧化酶(Cu，Ζη-SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)和铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)0Cu,Zn-SOD主要存在于真核生物胞浆中，另外在细胞核、溶酶体、过氧化物酶体中也有存在；Mn-SOD在真核生物的线粒体及原核生物的胞浆中皆存在；Fe-SOD主要存在于叶绿体和原核生物中。Mn-SOD和Fe-SOD出现在生命进化的早期，而Cu，Zn-SOD是在以后的发展中单独进化而成的。Cu,Zn-SOD在脊椎动物中约占总SOD活性的80%以上，在人体内Cu，Zn-SOD含量最高。1938年，Marm和Keilin首次从牛红细胞中分离出一种蓝色的含铜蛋白质(Hemocuprein)。1968年，McCord和Fridovich等对Hemocuprein的功能进行研究，因其能催化超氧阴离子(V的歧化反应而将其命名为超氧化物歧化酶(S0D)，其作用主要是专一地清除生物氧化中产生的超氧阴离子自由基(superOXideradical，02_)等中间物的毒性，能有效地防御活性氧对生物体的毒害作用。Mn-SOD主要存在于原核细胞和真核细胞的线粒体基质中，呈紫红色。某些真核生物的叶绿体中也含有一定量的Mn-SOD。真核生物中主要分布于细胞的线粒体内，其基因为单拷贝基因，在人体内位于第6号染色体上，其分子量为80，000道尔顿(SOkDa)，该酶与Cu,Zn-SOD无同源性。MnSOD具有抵抗氧化自由基，延缓衰老和抗肿瘤的作用，并与许多氧化损伤引起的疾病有关。Fe-SOD首次于大肠杆菌中分离得到，Fe-SOD呈黄褐色，主要存在于五coli和Methanobacteriumbryantil等原核生物及少数高等植物(如油菜、柠檬、银杏、番茄、水百合等)细胞的叶绿体基质中。Fe-SOD其活性中心的金属离子与3个His、一个Asp和一个H2O配位，它的分子结构为二聚体或三聚体，其分子构象主要为α螺旋，与Mn-SOD为同一进化起源。超氧化物歧化酶是一种用途极广的药用酶，在预防和治疗氧自由基危害、损伤和抗衰老、抗炎症、抑制肿瘤和癌症、治疗肌肉萎缩及在免疫系统中治疗无菌性炎症有重要的功能。1992年吴瑞芳介绍了德国格兰泰有限公司(GrunenthalGmbH)从动物血液中提取的商品名为潘乐新针(Peroxinorm)的注射用SOD制剂，主要用于治疗放射性膀胱炎、类风湿性关节炎。我国自上世纪八十年代以来，对超氧化物歧化酶的应用研究主要侧重于动植物SOD的提取和纯化，目前市场上的SOD产品大部分是从动物血液中提取的，以猪血为原料提取SOD制剂为多。中国专利CN00113802.2公开了一种牦牛血超氧化物歧化酶及其提取纯化工艺和应用。但大多数从动物血液中直接提取的SOD制剂可能对人体有排异性，存在免疫源性的问题。为解决天然SOD免疫源性的问题，美、日、英、德等国相继开发了人源SOD基因工程产品，已进入到II期、III期临床研究。国内周潮等也对人红细胞SOD冻干制剂进行了研究。但用人红细胞生产注射用SOD制剂其原料来源受到极大的限制，并且其疗效不一，Jadot等人提出同源SOD不被细胞膜受体辨认而无活性的观点，所以应对重组人源SOD的研究开发持谨慎态度，注意其应用领域。鉴于直接从动物血中提取的天然SOD存在工艺复杂、提取率低并存在免疫源的问题，人源SOD存在来源受限及同源SOD可能不被细胞膜受体辨认而无活性的问题，寻找廉价、高效的外源基因表达系统是突破传统制备方法的有效途径之一。目前有许多外源SOD基因表达系统的报道，但未见有成功表达有生物活性的重组蛋白的报道。很多外源SOD基因表达系统都采取了胞内表达的策略，在五coli胞内表达虽然具有产量高、操作简便的优点，但由于胞内缺少真核生物中翻译后修饰所需的酶类，或缺乏蛋白折叠过程中需要的某些酶和辅助因子，致使中间体大量积聚，容易形成包涵体沉淀。不可溶、无生物活性的包涵体必须经过变性、复性等繁琐过程才能获得天然结构和生物活性，增加了工作难度和生产成本。为了克服这一缺点，本发明选择了带有评仿信号序列的载体，评仿信号肽可以使目的蛋白被导入周质空间。五coli的胞周质中含有一系列的酶，并提供了一个氧化的环境，这些都有利于二硫键的正确形成，并增强硫基蛋白的正确折叠使活性蛋白质的产量得到提高，增强基因产物的可溶性，同时，周质空间和胞外培养基中的蛋白酶活性要比胞质中低，使所表达的蛋白能避免胞内降解从而稳定地存在于胞周质中。
发明内容本发明的第一个目的是提供一种构建含有牦牛Cu，Zn-SODcMk的表达载体的方法及构建的重组载体以及利用该载体转化的重组基因工程菌。本发明的第二个目的是提供从所述的基因工程菌重组牦牛Cu，Zn-SOD蛋白质及纯化该重组蛋白质的方法。本发明实现上述发明目的采用的技术方案如下一种构建含有牦牛Cu，Zn-SODdMk的表达载体的方法，包括以下步骤(1)根据奶牛Cu，Zn-SODcDNA序列(匪174615)用DNAsisforWindowsVer2.5设计一对PCR引物，引物序列如下上游引物P15‘-CATGCCATGGCGACGAAGGCCGTCTGCGTGC-3‘下游引物P25‘-CCCAAGCTTGAATGTTTACTTGGCAATTC-3‘(2)提取牦牛肝脏RNA，以提取的牦牛肝脏RNA为模板，在引物Pl和P2的引导下进行逆转录PCR(RT-PCR)扩增；(3)将RT-PCR产物连接到pGM-T载体，转化到E.colHQV10宿主菌进行克隆，用菌液PCR、质粒双酶切方法筛选阳性重组质粒，用双脱氧链终止法对阳性重组质粒中的Cu,Zn-SODcMk测序，将测序结果正确的阳性重组质粒命名为Cu，Zn-SOD-pGW-质粒；(4)用限制性内切酶AfcoI和HindIII对Cu，Zn-SOD-^Qk-质粒和pET22b⑴质粒分别进行双酶切，分别回收得到Cu，Zn-SODcMk片段和pET22b(+)开环线状载体；(5)将Cu，Zn-SODcMk片段连接到pET22b(+)开环线状载体，转化到E.co7iT0P10宿主菌，用菌液PCR、质粒双酶切及DNA测序法筛选阳性重组质粒，得到重组载体Cu,Zn-S0D-pET22b(+)。上述构建含有牦牛O/,Zn-SODcmk表达载体方法的步骤(2)中所述逆转录PCR扩增包括逆转录和PCR反应，其中所述逆转录的10μL体系为MgCl22.0μL，lOXRTBufferl.OμL，RNaseFreedH203.75μL,dNTPMixturel.OyL,AMVReverseTranscriptaseO.5μL,RNaseInhibitorO.25μL,Oligo-TO.5μL,耗牛月干脏RNA1.0μL，逆转录扩增反应条件为:42°C，45min；99°C，5min；5°C，5min。所述PCR反应的50μL体系为牦牛cDNA模板1.25ng，10XPCR缓冲液5.00μL，25mmol/L的MgCl22.00μL,2.5mmol/L的dNTPs2.00μL,5U/μL的位TaqDNA聚合酶0.50μL，20pmol/yL的上游引物Ρ10.50μL，20pmol/μL的下游引物P20.50μL，余量为无菌蒸馏水，PCR扩增反应条件为94°C预变性5min；94°C变性35s，50.50°C退火35s，72°C延伸90s，共32个循环；72°C延伸IOmin0上述构建含有牦牛级Zn-SODcmk表达载体方法的步骤(3)中所述将RT-PCR产物连接到pGM-T载体进行克隆的5μL连接体系为Zn~SODcmk2.OOyL,载体pGM-TO.5μL，LigationMix2.5μL，步骤(5)中所述将Ω/，ZnSODcmk片段连接到pET22b⑴开环线状载体后转化到E.CO7iT0P10宿主菌的5yL连接体系为Cu,Zn-SODomkl.00μL,pET22b(+)开环线状载体0.5μL，LigationMix2.5μL,连接条件为16°C连接过夜。上述构建含有牦牛Cu，Zn-SODcDNA表达载体方法的步骤(3)、步骤(5)中所述转化按以下步骤进行(1)将5.0μL连接体系加入50μL冰上预冷的Ε.coliTOVlQ感受态细胞，冰浴30min；(2)42°C水浴热激90s，放入冰浴IOmin；(3)加入SOC培养基800.0μL，混勻，37°C、120r/min振荡培养60min；(4)5000r/min离心30s，吸去大部分上清液，留下200.0μL上清液，重悬沉淀；(5)将细菌悬浊液均勻涂布在LB平板培养皿上，在37°C培养1220h，所述LB平板培养皿含有10mmol/LIPTG、40.0μL2%X-gal、100.0μg/mLAmp；(6)用封口胶封住LB平板培养皿，放入4°C冰箱显色30min；(7)挑取单个白色菌落接种于2mLLB液体培养基，37°C、120r/min培养12h后进行菌液PCR鉴定，所述LB液体培养基含100.0μg/mLAmp。上述构建含有牦牛Cu，Zn-SODcMk表达载体方法的步骤(3)、步骤(5)中所述重组质粒鉴定方法的菌液PCR反应体系及反应条件与上述RT-PCR中50μLPCR反应体系及扩增条件相同。上述构建含有牦牛Cu，Zn-SODcmk的表达载体方法的步骤(4)所述双酶切的20μL体系为质粒DNA10.00μL,10XKBuffer2.00μL,BSA3.00μL,HindIII1.00μL,AfcoII.00μL，余量为无菌蒸馏水，双酶切的反应条件为，37°C消化3h。按照上述构建方法得到的重组载体Cu，Zn-SOD-m22h⑴包含由序列表中序列3的核苷酸序列组成的牦牛Cu,Zn-SODcmk基因、/^仿信号序列、pET22b(+)载体元件，并且所述牦牛铜锌超氧化物歧化酶cDNA基因位于pET22b(+)载体的NcoI和Viz7i////限制性内切酶酶切位点之间。将重组载体Cu，Zn-SOD-m22b(+)转化到E.co7iBL21(DE3)宿主菌中得到牦牛Cu，Zn-SOD~m22b(+)-Ε.co7iBL21(DE3)工程菌。转化方法同构建含有牦牛Cu,Zn-SODcDNA表达载体方法的步骤(3)、步骤(5)中所述转化方法相同，所用宿主菌为E.co7iBL21(DE3)感受态细胞。转化得到牦牛Cu，Zn-SOD-^\22b(+)~B.co7iBL21(DE3)工程菌后经菌液PCR、质粒双酶切及DNA测序法筛选阳性重组质粒，得到鉴定正确的Cu，Zn-SOD~m22b(+)-Ε.co7iBL21(DE3)基因工程菌。一种牦牛Cu，Zn-SOD~m22h(+)_Ε·co7iBL21(DE3)基因工程菌高效表达方法及重组蛋白质纯化方法，包括对鉴定正确的重组基因工程菌进行IPTG诱导表达、用负染色法对表达产物进行鉴定、对重组蛋白进行纯化及复性，其中所述重组基因工程菌IPTG诱导表达方法包括以下步骤(1)经鉴定正确的Cu，Zn-SOD-m22b(+)_Ε·co7iBL21(DE3)基因工程菌接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，37°C120rpm震荡培养过夜，基因工程菌菌液与LB培养基的体积比为1:100；(2)次日，将过夜培养后的基因工程菌以1:40的体积比例接种到含氨苄青霉素的LB培养基中，于37°C震荡培养；(3)细菌OD6qq=O.51时，加入lmMIPTG，30°C，诱导表达9小时；(4)4000r/min离心5min，收集菌体，进行SDS-PAGE电泳，所述SDS-PAGE电泳的分离胶浓度为15%，积聚胶浓度为5%；所述负染色法鉴定表达产物包括以下步骤(1)将溶于PBS缓冲液的总蛋白上清液进行10%PAGE电泳，分别用提纯的牦牛血液Cu,Zn-SOD和含空载体的细菌细胞上清液作为阳性对照和阴性对照；(2)电泳结束后取出凝胶条，浸入NBT-TEMED-核黄素体系溶液中避光染色30min，倒出染色液，所述NBT-TEMED-核黄素体系溶液中含有1.5mmol/LNBT、0.lmmol/LTEMED、0.12mmol/L核黄素、67mmol/L磷酸盐缓冲液pH7.5；(3)用pH7.5的PBS冲洗胶片两次，胶片置于20W日光灯下照射45min，凝胶条无SOD活性部分全部为紫蓝色，有SOD活性的部分显现出无色透明的酶带，记录结果数据；所述重组Cu，Zn-SOD蛋白质纯化方法，包括以下步骤(1)经IPTG诱导的表达菌，4°C12000r/min离心15min，收集菌体；(2)按Ig菌体湿重加入10mLpH7.4的细胞裂解液重悬菌体，洗涤2次，所述细胞裂解液包括20mMNa3P04、500mMNaCl；(3)菌体悬浊液置于冰上超声破碎20min，破碎5s、间断9s，4°C12000r/min离心15min，收集沉淀；(4)按Ig菌体湿重加入20mLpH7.4的包涵体洗涤液I重悬沉淀，4°C静置20min，反复洗涤5次，所述包涵体洗涤液I包括20mMNa3P04、500mMNaCl、0.l%TritonX-100；(5)以同样的方法用pH7.4的包涵体洗涤液II洗涤包涵体5次，4°C12000r/min离心15min，收集沉淀，所述包涵体洗涤液II包括20mMNa3P04、500mMNaCl、2MUrea；(6)按Ig菌体湿重加入IOmL包涵体变性液向洗涤后的沉淀中加入pH7.4的包涵体变性液，4°C溶解过夜，40C12000r/min离心30min，收集上清液，经0.45μm滤膜过滤备用，所述包涵体变性液包括20mMNa3P04，500mMNaCl，8MUrea；所述重组蛋白质复性包括以下步骤将上述重组Cu，Zn-SOD蛋白质纯化方法步骤(6)纯化得到的包涵体蛋白用尿素浓度梯度法4°C透析复性，透析缓冲液依次以含6M、5M、4M、3M、2M、1M、OM尿素的PBS缓冲液，最后以无尿素的PBS缓冲液4°C透析过夜。用邻苯三酚自氧化法对表达产物SOD及复性蛋白质进行酶活性测定，包括以下步骤(1)邻苯三酚自氧化速率的测定取pH8.2的Tris-HCl-EDTA缓冲液4.5mL加入IOmL比色管中，于25°C进行恒温孵育，再加入经过25°C恒温孵育的45mmol/L的邻苯三酚溶液10.0μL，混勻后置于Icm石英比色杯中于325nm波长测光密度，每隔30s测一次光密度值，共测4min，求出邻苯三酚自氧速率0Da/min，同时用lOmmol/L盐酸做空白试验；(2)S0D活性测定取pH8.2的Tris-HCl-EDTA缓冲液4.5mL于IOmL比色管中，25°C恒温lOmin，加入已恒温至25°C的样品缓冲液10mL，混勻，用325nm波长测定密度值，每30s测一次，测4min，求出光密度值变化速率ODbAiin；(3)按下述公式计算酶活力酶活力(U/mL)=(ODa-ODb)/ODaX100%+S(Fc)XnXV1ZV2式中V1—反应体系；V2—测定样品体积；N—样品稀释液倍数；ODa—邻苯三酚的自氧化速率；ODb—样品光密度值变化速率。经测定，表达产物中SOD的酶活力为35U/mg，纯化后的牦牛重组Cu，Zn-SOD酶活力为3612U/mg。超氧化物歧化酶(SOD)是机体内唯一可清除超氧阴离子自由基((V)的天然清除齐U。在抗衰老、抗氧化应激、抗炎、和治疗自身免疫疾病等方面SOD有很重要的作用。目前，我国SOD的开发及应用取得了很大的进展，作为药用酶，由于天然SOD存在来源有限、异体蛋白免疫原性、进入细胞能力弱、在血中半衰期短、不能口服、价格昂贵等缺点，从而限制了SOD在相关领域的应用；人源SOD制剂其原料来源受到极大的限制，并且根据Jadot等人提出同源SOD不被细胞膜受体辨认而无活性的观点，应对重组人源SOD的研究开发持谨慎态度。本发明选用的牦牛是生存在喜马拉雅山脉和青藏高原海拔3000米左右的高原动物，高寒缺氧、高强度紫外辐射等恶劣环境使其在进化过程中体内保护酶(CAT、SOD、P0D)活性的升高，SOD活性也随氧含量的降低而升高从而提高了机体对缺氧条件下的适应性。另外，本发明的前期研究发现，牦牛SOD氨基酸与人和猪SOD比较，牦牛SOD氨基酸序列与人的SOD氨基酸序列同源性最高，牦牛SOD蛋白质比猪更接近于人。因而，牦牛可以作为比猪更合适的SOD供体。本发明提供了一种重组牦牛Cu，Zn-SOD蛋白质及构建牦牛Cu，Zn-SOD高效表达系统、重组蛋白质纯化的方法，选用大肠杆菌作为宿主，其遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、易于操作，大肠杆菌为宿主的体系是表达外源蛋白的首选体系。本发明选用的PET22M+)载体具有很强的T7启动子并带有/70仿信号肽，同时，本发明设计的Cu,Zn-SODzmk^端酶切位点AfcoI紧接着/70仿信号肽序列，3'端历III酶切位点紧接着终止密码子，这有利于表达的产物分泌到细胞周质空间组装成高级结构。本发明利用基因工程技术构建了牦牛Cu，Zn-SOD重组原核表达系统Cu,Zn-SOD-m22b(+)~E.co7iBL21(DE3)，并建立了重组表达后牦牛Cu，Zn-SOD蛋白质纯化方法，活性染色与活性测定后得出该基因工程菌表达的牦牛Cu，Zn-SOD蛋白活性高，且高效稳定表达。与SOD传统的血液来源相比，本发明提供的表达系统及纯化方法高效稳定，成本低，效果好，适用于大规模生产，极大地降低了生产成本，为SOD在临床治疗、制药、保健品、食品等领域的应用与开发提供了丰富的SOD资源。图1为牦牛肝脏总RNA电泳结果。图2为牦牛Cu,Zn-SOD的RT-PCR扩增结果。图3为重组克隆载体的PCR鉴定结果。图4为重组子的酶切鉴定结果。图5为人Cu，Zn-SOD与牦牛、猪和普通牛的核苷酸序列同源性比较结果。图6为人Cu，Zn-SOD与牦牛、猪和普通牛的氨基酸序列同源性比较结果。图7为重组表达载体的PCR鉴定结果。图8为重组表达载体的酶切鉴定结果。图9为牦牛Cu，Zn-SOD表达产物SDS-PAGE电泳结果。图10为Cu，Zn-SOD表达产物活性染色结果。图11为牦牛Cu，Zn-SOD蛋白质纯化结果。图中标记图1中，1、2表示牦牛1肝脏总RNA，3、4表示牦牛2肝脏总RNA。图2中，M表示DNAmarkerDL2000分子量标记，1表示牦牛ICu,Zn-SODRT-PCR产物，2表示牦牛2Cu,Zn-SODRT-PCR产物。图3中，M表示DNAmarkerDL2000分子量标记，1、2表示随机挑取的重组菌进行PCR反应的产物。图4中，M表示DNAmarkerDL2000分子量标记，1、2、3、4表示重组质粒的酶切结果。图7中，M表示DNAmarkerDL2000分子量标记，1、2、3、4表示重组载体PCR反应的产物。图8中，M表示DNAmarkerDL2000分子量标记，1、2、3、4表示重组载体经AfcoI和Λ/7/ΙΙΙ酶切后的产物，5表示牦牛Cu，Zn-SOD基因。图9中，M表示蛋白质分子量标准，1表示大肠杆菌BL21(DE3)的表达产物，2未经IPTG诱导的pET22b(+)-BL21(DE3)表达产物，3表示经IPTG诱导的pET22b(+)-BL21(DE3)表达产物，4表示IPTG诱导后的牦牛Cu，Zn-SOD-m22b(+)-Ε.co7iBL21(DE3)表达产物。图10中，0表示牦牛血液Cu,Zn-SOD,1表示诱导的pET22b(+)-BL21(DE3)，2表示未经IPTG诱导的Cu，Zn-SOD-^\22b(+)-E.co7iBL21(DE3)，3表示IPTG诱导的Cu,Z/-S0D-pET22b(+)-B.co7iBL21(DE3)，4，5表示经IPTG诱导并加入Cu2+和Zn2+的Cu,Zn-SOD-^\22b(+)-E.co7iBL21(DE3)。图11中，M表示蛋白质分子量标准，1、2、3、4表示纯化后的牦牛Cu，Zn-SOD蛋白质，5、6表示牦牛Cu，Zn-SOD~m22h(+)-Ε.coliBL21(DE3)表达的总蛋白。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。所用引物合成由TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司完成。实施例1、牦牛Cu,Z/7-^cDNA-pET22b(+)重组载体构建一、引物设计根据奶牛Cu，Zn-SODcmk序列(NMl74615)，用DNAsisforWindowsVer2.5设计一对PCR引物，即上游引物Pl和下游引物P2上游引物Pl:5''-|CATCt|CCATGGCGACGAAGGCCCtTCTGCGTGC-3fr*t薛弓1P2ο~CCCAAGC"TTGAATGTTXACTTGCJCAATT"0~3“上述上游引物Pl序列中划线部分为限制性内切酶AfcoI酶切位点；下游引物P2序列中划线部分为限制性内切酶ZZiz7i/III酶切位点；引物序列中方框部分为酶切位点保护碱基；二、RT-PCR扩增牦牛Cu，Zn-SODcmk片段(1)牦牛肝脏RNA提取根据SIGMA公司提供的总RNA提取方法，按以下步骤提取牦牛肝脏总RNA。φ取-70V保存的牦牛肝脏组织50lOOmg，剪碎后移入20mL预先加入ImLTRIREAGENT的勻浆器中进行勻浆，至细胞完全裂解；(g将勻浆所得液体移入2mLEppendorf管，于室温静置IOmin左右，4°C10000r/min离心15min；:1取上层液体移入另一Eppendorf管，加入0.5mL氯仿，振荡摇勻，室温静置IOmin；；!)将Eppendorf管置于高速台式冷冻离心机，在4°C10000r/min离心15min；S吸取上层水相置于另一新的无菌Eppendorf管中，重新加入0.5mL氯仿，振荡摇勻，室温静置5min后于4°C，10000r/min离心15min；:f吸取上层水相置于另一新的无菌Eppendorf管中，加入0.5mL异丙醇，振荡摇勻后于室温静置1520min(或于4°C静置Ih左右)；4"C10000r/min离心lOmin，弃上清，加0.5lmL75%乙醇洗涤两次；取40.OμL无RNAase的水重悬干燥后的RNA，置_70°C保存。上述提取的牦牛肝脏总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳后，可见28S核糖体RNA，18S和5S核糖体RNA三条带，无拖尾(见图1)，经紫外分光光度计检测，0D260nm/280nm值在1.852.05之间，说明RNA完整性好，且其纯度高，可用作RT-PCR试验。(2)cDNA第一条链的合成以牦牛肝脏RNA为模板，Oligo-dT为引物，按照表1所示配制逆转录反应液，用AMV反转录酶合成cDNA第一条链。反应体系如下表1反转录反应体系<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>逆转录反应条件为:42°C,45min;99°C,5min;5°C，5min。(3)PCR扩增按照表2所示配置PCR反应体系，PCR扩增反应条件为95.0°C预变性IOmin；94.0°C变性35s，50.5°C退火35s，72.0°C延伸90s，共32个循环；72.0°C再延伸IOmin,扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。表2PCR反应体系<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由图2可知，RT-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳在约480bp处可见一特异性条带，与预期目标片段大小一致。三、牦牛Cu，Zn-SODcmk克隆将RT-PCR产物连接到pGM-T载体并转化到大肠杆菌T0P10感受态细胞进行克隆，用菌液PCR、质粒双酶切方法筛选阳性重组质粒，用双脱氧链终止法对阳性重组质粒中的Cu,Zn-SODcMk测序，将测序结果正确的阳性重组质粒命名为Cu，Zn-SOD-^QA-质粒，具体按如下操作步骤进行(1)连接反应将RT-PCR产物连接到pGM-T载体进行克隆，连接反应体系如表3所示。按照表3所示，配制连接5.0μL反应体系，将连接反应体系放入置于16°C的低温水浴连接过夜。！_表3.连接反g体系_样品_实验组_阴性对照_阳性对照_ICujZn-SODcDMA2.OAL0Μ·O^L|tlfrpGI-T0.5μL0.5μ0.5M-L1LigationMix2.5μL2.2.5μLSBΗ;00M"L2.OAL0.5μL|controlinsertDHAΟμ_OM-L_0._I(2)转化①取一管大肠杆菌T0P10感受态细胞，置于冰浴中，待融化后用预冷的枪头吸取3050.0μL到一个新的预冷的无菌离心管中，加入连接产物5.0μL，轻轻旋转以混合内容物，在冰中放置2030min；②42°C水浴热激90s，不要摇动管子，然后迅速放入冰浴IOmin；③加入SOC培养基800.0μL，轻轻混勻，37°C、160r/min振荡培养45min90min；④8000r/min离心30s，轻轻吸去上清液，留下约200.0μL上清液，重悬沉淀将菌混勻，分两次涂板；⑤涂布预先已准备好含有100.0μL100mmol/LIPTG、40.0μL2%X-gal、100.0μg/mLAmp的LB平板，在室温吸收后，然后倒置培养皿37°C培养1220h；⑥然后用封口胶封住，放入4°C冰箱显色30min。(3)用菌液PCR、质粒双酶切方法筛选阳性重组质粒，用双脱氧链终止法对阳性重组质粒中的Cu，Zn-SODcDNA测序，将测序结果正确的阳性重组质粒命名为Cu，Zn-S0D-pGM-T质粒。具体如下菌液PCR鉴定重组子用灭菌牙签挑取单个白色菌落，接种于含有氨苄青霉素的2mLLB液体培养基中，37°C振荡过夜培养。取2.0μL菌液作模板，按表2配制PCR反应液，反应条件与RT-PCR中的PCR反应条件相同。用未经转化的Τ0Ρ10作为阴性对照。用1%琼脂糖凝胶电泳检测结果。双酶切鉴定重组子①质粒DNA的提取a.挑取一些独立的转化菌落进行小规模培养，用无菌牙签或接种环挑取单菌落于20mL含有适量氨苄青霉素的LB培养基中，37°C剧烈震摇培养过夜；b.将1.2mL培养物倒入微量离心管中，于5000r/min离心Imin(两次)。将剩余的培养物存于4°C冰箱；c.吸取并弃去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥；d.将细菌沉淀重悬于100.0μL溶液I中，剧烈振荡；e.加200.0μL溶液II，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物，确保离心管的整个表面均与溶液II接触，不要振荡，将离心管放置冰上5min；f.加150.OyL溶液III，盖紧管口，将管倒置，温和振荡20s，使溶液III在黏稠的细菌裂解物中分散均勻，之后将管置于冰上5min；g.12000r/min离心5min，将上清液转移到另一离心管中；h.加等体积酚一氯仿一异戊醇(25:24:1)，振荡混勻；i.12000r/min离心5min，将上清液转移至另一管离心管中；j.加入2倍体积的无水乙醇并置于冰中30min，使DNA沉淀；k.12000r/min离心5min，小心吸去上清液，将离心管倒置于一张滤纸上，以使有液体流出，再将附于管壁的液滴除尽；1.用lmL70%乙醇溶液洗涤沉淀，12000r/min离心5min，弃去上清液，在空气使核酸沉淀干燥；m.用50.0μL含无DNA酶的胰RNA酶20μg/mL的TE重新溶解核酸，振荡贮于_20°C。②Cu，Zn-SOB-pGM-T质粒双酶切鉴定上述提取的质粒、限制性内切酶Λ/^ΙΠ、Λ^οΙ及各种缓冲液按照表4所示配置双酶切体系，置于37°C消化3h左右，用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>由图3可知，菌液PCR扩增产物约480bp，与预期片段大小相符，由图4可知，筛选的Cu，Zn-SOD-^Qk-重组质粒被AfcoI和历III酶切为3001bp和467bp两个片段，与预期片段大小相符，表明筛选的重组质粒为阳性β/,办-5’fl9_pGM-T重组质粒。质粒测序经菌液PCR、双酶切鉴定筛选的Cu,Zn-SOD-pGM-T阳性重组质粒用双脱氧链终止法进行测序。将鉴定正确的阳性重组质粒分别送至TaKaRa公司和成都金杰生物技术有限公司测序。经DNAMAN、DNAsis软件分析，TaKaRa公司和成都金杰生物技术有限公司测序结果完全一致。将序列提交到NCBI数据库进行BlAST比对分析，结果表明，上述克隆的牦牛Cu,Zn-SODcWA序列正确。由图5、图6可知，经测序所得的牦牛Cu，Zn-SODcMk及氨基酸序列与NCBI中人、猪、普通牛3个物种的cDNA及氨基酸序列在DNAMAN中进行序列比对，牦牛Cu，ZnSOD与人共有61个碱基和26个氨基酸残基存在差异，牦牛及普通牛Cu,Zn-SODcmk较人少6个碱基，该连续6个碱基分别编码天冬酰胺(N)和甘氨酸(G)。在比较的四个物种氨基酸序列中，从129到151位氨基酸残基完全相同，该部分肽段参与第8个β-折叠的形成，是C端重要的功能性区域。研究表明，这一区段(环VII)的Glul30、Glul31和Lysl34位于静电环表面，是活性通道的组成部分，通过形成正电场起作用，虽然与酶活性无关，但与底物识别有关，在底物进入活性中心的过程中有导向作用。Argl41在酶催化过程中是唯一具有静电学和酶促动力学双重作用的氨基酸，在酶与底物的结合及催化反应中都具有作用。由表5可知，人与猪的核苷酸序列同源性最高为88.3%，其次为牦牛86.7%，最低为普通牛86.3%。但氨基酸序列比较显示，人与牦牛的氨基酸序列同源性最高82.9%，其次为普通牛82.2%，最低为猪81.1%。由此可见，采用重组牦牛Cu，Zn-SOD蛋白作为注射用蛋白其免疫反应可能较猪源Cu，Zn-SOD的小，这一结论与国外为什么均采用牛血提取的SOD作为注射用药一致。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>四、牦牛Cu，Zn-SOD~m22b(+)重组载体构建用限制性内切酶AfcoIMHindIIIMCu,Zn-SOD-^-I质粒和pET22b⑴质粒分别进行双酶切，分别回收得到Cu，Zn-SODcmk片段和pET22b(+)开环线状载体；将Cu，Zn-SODcMk片段连接到pET22b(+)开环线状载体，转化到五C^iTOPlO宿主菌，用菌液PCR、质粒双酶切及DNA测序法筛选阳性重组质粒，得到重组载体Cu，Zn-SOD~m22b(+)，具体按如下操作步骤进行U)Cu,Zn-SOB-pGM-T质粒及pET22b(+)载体双酶切上述提取的质粒、限制性内切酶Λ/^ΙΠ、Λ^οΙ及各种缓冲液按照表4所示配置双酶切体系，置于37°C消化3h左右，用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。(2)目的片段的回收纯化采用上海生物工程有限公司凝胶回收试剂盒纯化PCR扩增产物，方法如下①将100μLRT-PCR产物于1%的琼脂糖凝胶中电泳；②用干净的手术刀切下含有目的基因片段的琼脂糖凝胶块，放入1.5mLEppendorf管中，称其重量；③按每IOOmg琼脂糖凝胶加入400.0μLBindingBufffer,混勻后置5060°C、水浴锅内水浴lOmin，使胶彻底融化，加热融胶时每2min混勻一次；④将spinColumn柱放入2mL收集管中，将融化的胶溶液转移到spinColum柱中，12000r/min室温离心Imin；⑤取下spinColumn柱，倒掉收集管中的废液，将spinColumn柱放入原收集管中，加入300.0μLBindingBuffer,12000r/min室温离心Imin；⑥取下spinColumn柱，倒掉收集管中的废液，将spinColumn柱放入原收集管中，加入700.0μLDNAffashBuffer,室温放置23min，12000r/min室温离心Imin；⑦重复步骤6；⑧倒掉收集管中的废液，将spinColumn柱放入原收集管中，空转，12000r/min,室温离心Imin；⑨将spinColumn柱放入一只新的1.5mLEppendorf管，在柱膜中央加30.0μLElutionBuffer室温或37°C放置2min；⑩12000r/min高速离心lmin，离心管中的液体即含有回收的DNA片段，可立即使用或-20°C保存备用；(3)连接反应将RT-PCR产物连接到pET22b(+)载体，连接反应体系如表6所示。按照表6所示，配制连接5.0μL反应体系，将连接反应体系放入置于16°C的低温水浴连接过夜。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(4)转化将连接体系转化到大肠杆菌T0P10感受态细胞，具体操作与上述步骤三牦牛Cu，Zn-SODcmk克隆中的转化操作相同。(5)重组质粒鉴定用菌液PCR、质粒双酶切方法筛选阳性重组质粒并用DNA测序方法重组质粒进行鉴定，测序正确的重组质粒即为Cu，Zn-SOD~m22b(+)重组载体，命名为Cu，ZnSOD~m22b(+)。具体操作与上述步骤三牦牛Cu，Zn-SODcMk克隆中的菌液PCR、质粒双酶切鉴定操作相同。由图5可知，重组表达载体O/,Zn-SOD~m22b(+)表达载体在Cu，ZnSOD特异性引物引导下扩增得到了约480bp的片段，与Cu，Zn-SODcmk片段大小相符。图6可知，重组载体经双酶切后，断裂为5440bp和476bp两条片段，与预期片段大小相符。对牦牛Cu,Zn-SOD-m22b(+)重组载体测序结果与实施例1中已测序的牦牛O/,Z/-5’fl9cDNA进行比对，结果显示，O/,办-Sfl^cDNA两次测序结果完全一致，表明重组原核表达载体构建成功。实施例2、牦牛Cu,Zn-SOD-^E\Tlh(+)-￡co//BL21(DE3)基因工程菌表达一、构建牦牛Cu，Zn-SOD-^\22b(+)-E.co7iBL21(DE3)基因工程菌将O/,Z/-5’fl9-pET22b(+)重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌，具体操作步骤与上述实施例1步骤三牦牛Cu，Zn-SODcmk克隆中的转化操作相同。二、IPTG诱导Cu，Zn-SOD-^\22b(+)~B.co7iBL21(DE3)基因工程菌表达(1)挑取重组菌单菌落于LB培养基中培养过夜，以含有空载体的细菌样品做对照；(2)次日，将实验组与对照组活化的种子菌以1:40体积比的比例接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中，于37°C，120rpm震荡培养；(3)待实验组与对照组细菌OD6tltl=O.51时，加IPTG至浓度为lmmol/L，继续培养5h；(4)4000r/min离心5min，收集菌体。三、表达产物SDS-PAGE电泳检测(1)将上述离心收集的表达产物溶于PBS缓冲液(含8mol/L尿素，pH7.5)，4°C，12000rpm，离心IOmin；(2)取上清加入等体积2XSDS样品缓冲液，煮沸5min；(3)吸取10μL样品，用常规SDS-PAGE方法进行检测(浓缩胶浓度4.5%，分离胶浓度10%)，记录结果数据。取Cu，Zn-SOD-m22b(+)_E.co7iBL21(DE3)基因工程菌诱导的蛋白质上清液进行SDS-PAGE电泳检测，以IPTG诱导的含pET22b(+)空载体的菌体蛋白和未经诱导的Cu,Zn-SOD~m22b(+)~E.co7iBL21(DE3)基因工程菌菌体蛋白为对照组。由图9可知，实验组与对照组均呈现出17.SKDa的蛋白质条带，与重组Cu，Zn-SOD蛋白质单体分子量相符，与对照组相比，经IPTG诱导的O/,Zn-SOD-m22b(+)-E.co7iBL21(DE3)基因工程菌的蛋白条带更为明显，蛋白质含量更高。由此表明，实验组中该特异性蛋白质条带可能为在大肠杆菌中表达的牦牛Cu，Zn-SOD蛋白，但表达产物的活性还需进一步检测。四、负染色法鉴定表达产物(1)将上述溶于PBS的上清液进行10%PAGE电泳，分别用提纯的牦牛血液Cu，Zn-SOD和含空载体的细菌细胞上清液作为阳性对照和阴性对照；(2)电泳结束后取出凝胶条，放入NBT-TEMED-核黄素体系溶液(1.5mmol/LNBT+O.lmmol/LTEMED+O.12mmol/L核黄素+67mmol/L磷酸盐缓冲液pH7.5)中避光染色30min，倒出染色液。(3)用pH7.5的PBS冲洗胶片两次，胶片置与强20W日光灯下照射45min左右，则凝胶条无SOD活性部分全部为紫蓝色，而有SOD活性的部分显现出无色透明的酶带，记录结果数据。取等量经IPTG诱导的Cu，Zn-SOD-^\22b(+)~B.co7iBL21(DE3)基因工程菌表达产物和含空载体pET22b(+)的细菌的诱导表达产物进行PAGE电泳，以牦牛血液中提取的Cu，Zn-SOD为对照。由图10可知，对照组牦牛血液Cu，Zn-SOD和经IPTG诱导的Cu,Zn-SOD~m22b{+)~E.co7iBL21(DE3)重组菌表达产物都在同一水平线上出现较亮的条带，表明本研究的牦牛伪,办-5’fl9cDNA在大肠杆菌中表达的产物具有生物学活性且分子量与天然牦牛Cu，Zn-SOD基本一致，为32KDa。五、表达产物的酶活性测定用邻苯三酚自氧化法对表达产物SOD进行酶活性测定，用含空载体的菌液作对照。(1)邻苯三酚自氧化速率的测定取pH8.2的Tris-HCl-EDTA缓冲液4.5mL于IOmL比色管中，在25°C恒温的45mmol/L的邻苯三酚溶液10.0μL，混勻后迅速置Icm石英比色杯325nm波长测光密度，每隔30s测一次光密度值，共测4min，求出邻苯三酚自氧速率ODa/min。同时用10mmol/L盐酸做空白试验。(2)SOD活性测定取pH8.2的Tris-HCl-EDTA缓冲液4.5mL于IOmL比色管中，25°C恒温lOmin，加入已恒温至25°C的样品缓冲液10mL，迅速混勻，用325nm波长测定密度值，每30s测一次，测4min，求出光密度值变化速率0Db/min。(3)计算方法酶活力(U/mL)=(ODa-ODb)/ODaX100%+S(Fc)XnXV1ZV2(V1—反应体系；V2—测定样品体积；N—样品稀释液倍数；ODa—邻苯三酚的自氧化速率；ODb—样品光密度值变化速率)用邻苯三酚自氧化法分别对IPTG诱导5h的含pET22b(+)空载体和Cu,Zn-S0D-pET22b(+)重组载体的受体菌表达产物蛋白粗提液中牦牛Cu，Zn-SOD进行活性测定。结果显示，Cu,Zn-SOD-m22b(+)~E.co7iBL21(DE3)基因工程菌表达产物每毫克粗蛋白中Cu,Zn-SOD活性为35U/mg。由此表明，Cu，Zn~SOD-^122b(+)-B.co7iBL21(DE3)基因工程菌表达的牦牛Cu，Zn-SOD蛋白活性较高。实施例3、牦牛Cu,Zn-SOD蛋白质纯化一、包涵体洗涤法纯化Cu，Zn-SOD蛋白质(1)经IPTG诱导的表达菌，4°C12000r/min离心15min，收集菌体；(2)菌体中加入细胞裂解液(20mMNa3P04，500mMNaCl，pH7.4，Ig菌体湿重加入IOml裂解液)重悬菌体，洗涤2次；(3)菌体悬浊液置于冰上超声破碎20min，破碎5s、间断9s，4°C12000r/min离心15min，收集沉淀；(4)加入包涵体洗涤液I(20mMNa3P04，500mMNaCl，0.l%TritonX-100,pH7.4，Ig菌体湿重加入20ml包涵体洗涤液)重悬沉淀，4°C静置20min，反复洗涤5次；(5)以同样的方法用包涵体洗涤液II(20mMNa3P04,500mMNaCl,2MUrea,pH7.4)洗涤包涵体5次，4°C12000r/min离心15min,收集沉淀；(6)洗涤后的沉淀加入包涵体变性液(20mMNa3P04，500mMNaCl，8MUrea，pH7.4，Ig菌体湿重加入IOml包涵体变性液)4°C溶解过夜，4°C12000r/min离心30min，收集上清液，经0.45μm滤膜过滤备用。二、包涵体蛋白透析复性用尿素浓度梯度法透析复性牦牛Cu，Zn-SOD蛋白质(1)将透析袋剪成适当长度，在含ImMEDTA的Na2CO3溶液中沸30分钟，用蒸馏水彻底清洗；(2)用棉线将透析袋的一头扎结，并保证不漏，将洗脱下来的含有目的蛋白的各管洗脱液混合，加到透析袋中，打结透析袋的另一头，将透析袋加入到含6M尿素的PBS透析缓冲液中；(3)更换透析液，依次以含6M、5M、4M、3M、2M、1M、OM尿素的磷酸盐缓冲液，4°C进行透析。(4)以不含尿素的PBS缓冲液4°C透析过夜，Bradford法测定纯化后的融合蛋白浓度。(1)在96孔酶标板A行各孔中依次加入不同浓度的BSA标准蛋白质溶(0.110mg/ml结晶牛血清蛋白溶液)10μL，同样的方法在B行与C行中也加入标准蛋白质溶10μL；(2)在第四行各孔中各加10μL样品，每个样品重复加3孔；(3)各孔中加入考马斯亮蓝G250染色液200ul，混勻，反应板室温放置(样品中若有蛋白质存在，试剂又棕色变成蓝色)；(4)用酶标仪读取各孔595nm的吸光度值；(5)用A、B、C三列吸光度的平均值绘制标准曲线，计算待测蛋白质浓度。经计算，本发明得到的牦牛Cu，Zn-SOD蛋白质浓度为0.14mg/ml。三、复性蛋白质SDS-PAGE电泳检测上述复性后的蛋白质进行SDS-PAGE电泳检测，方法与实施例3中相同。由图11可知，重组基因工程菌表达的牦牛Cu，Zn-SOD蛋白质单体分子量为17.SkDa0四、复性蛋白质酶活性测定用邻苯三酚自氧化法测定复性后的SOD酶活性，方法与实施例3中相同。邻苯三酚自氧化速率在每分钟的光吸收值为0.07，本发明中牦牛Cu，Zn-SOD酶活力为3612U/mg。序列表<110>西南民族大学<120>牦牛铜锌超氧化物歧化酶重组表达蛋白质<160>4<210>1<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>1ggccatggcgacgaaggccgtctgcgtgc29<210>2<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>2gcaagcttgaatgtttacttggcaattc28<210>3<211>459<212>DNA<213>牦牛(Bosgrunniens)<400>atggcgacgaaggccgtctgcgtgctgaagggcgacggcccggtgcaaggcaccatccac60ttcgaggcaaagggagatacagtcgtggtaactggatccattacaggattgactgaaggt120gatcatggattccacgtccatcagtttggagacaatacacaaggctgtaccagtgcaggt180cctcactttaatcctctgtccaaaaaacacggtgggccaaaagatgaagagaggcatgtt240ggagacctgggcaatgtgacagctgacaaaaacggtgttgccgtcgtggatattgtagat300tctctgatttcactctcaggagaatattccatcattggccgcacgatggtggtccatgaa360aaaccagatgacttgggcagaggtggaaatgaagaaagtacaaagactggaaacgctgga420agtcgtttggcctgtggtgtaattggaattgccaagtaa459<210>1<211>152<212>PRT<213>牦牛(Bosgrunniens)<400>4MetAlaThrLysAlaValCysValLeuLysGlyAspGlyProValGlnGlyThrlleHis20PheGluAlaLysGlyAspThrValValValThrGlySerlleThrGlyLeuThrGluGly40AspHisGlyPheHisValHisGlnPheGlyAspAsnThrGlnGlyCysThrSerAlaGly60ProHisPheAsnProLeuSerLysLysHisGlyGlyProLysAspGluGluArgHisVa180GlyAspLeuGlyAsnValThrAlaAspLysAsnGlyValAlaValValAspIleValAsp100SerLeuIleSerLeuSerGlyGluTyrSerIIeIIeGlyArgThrMetValValHisGlu120LysProAspAspLeuGlYArgGlyGlyAsnGluGluSerThrLysThrGlyAsnAlaGly140SerArgLeuAlaCysGlyValIIeGlyIIeAlaLys*15权利要求一种构建含有牦牛Cu,Zn-SODcDNA的表达载体的方法，其特征在于包括以下步骤(1)根据奶牛Cu,Zn-SODcDNA序列，用DNAsisforWindowsVer2.5设计一对PCR引物，引物序列如下上游引物P1:5′-CATGCCATGGCGACGAAGGCCGTCTGCGTGC-3′下游引物P2:5′-CCCAAGCTTGAATGTTTACTTGGCAATTC-3′(2)提取牦牛肝脏RNA,以提取的牦牛肝脏RNA为模板，在引物P1和P2的引导下进行逆转录PCR扩增；(3)将RT-PCR产物连接到pGM-T载体，转化到E.coliTOP10宿主菌进行克隆，用菌液PCR、质粒双酶切方法筛选阳性重组质粒，用双脱氧链终止法对阳性重组质粒中的Cu,Zn-SODcDNA测序，将测序结果正确的阳性重组质粒命名为Cu,Zn-SOD-pGM-T质粒；(4)用限制性内切酶NcoⅠ和HindⅢ对Cu,Zn-SOD-pGM-T质粒和pET22b(+)质粒分别进行双酶切，分别回收得到Cu,Zn-SODcDNA片段和pET22b(+)开环线状载体；(5)将Cu,Zn-SODcDNA片段连接到pET22b(+)开环线状载体，转化到E.coliTOP10宿主菌，用菌液PCR、质粒双酶切及DNA测序法筛选阳性重组质粒，得到重组载体Cu,Zn-SOD-pET22b(+)。2.根据权利要求1所述的构建含有牦牛Cu，Zn-SODcmk的表达载体的方法，其特征在于步骤(2)中所述逆转录PCR扩增包括逆转录和PCR反应，其中所述逆转录的IOyL体系为MgCl22.ΟμL，IOXRTBufferl.ΟμL，RNaseFreedH203.75μL,dNTPMixturel.OyL,AMVReverseTranscriptaseO.5μL,RNaseInhibitorO.25μL,Oligo-TO.5μL,牦牛肝脏RNA1.OyL,逆转录扩增反应条件为420C，45min；99°C，5min；5°C，5min；所述PCR反应的50μL体系为牦牛cDNA模板1.25ng，10XPCR缓冲液5.00μL，25mmol/L的MgCl22.00μL,2.5mmol/L的dNTPs2.00μL,5U/μL的位TaqDNA聚合酶0.50μL，20pmol/yL的上游引物Ρ10.50μL，20pmol/μL的下游引物P20.50μL，余量为无菌蒸馏水，PCR扩增反应条件为94°C预变性5min；94°C变性35s，50.50°C退火35s，72°C延伸90s，共32个循环；72°C延伸IOmin03.根据权利要求1所述的构建含有牦牛Cu,Zn-SODcMk的表达载体的方法，其特征在于步骤(3)中所述将RT-PCR产物连接到pGM-T载体进行克隆的5μL连接体系为-.Cu，Zn-SODomkl.00μL,载体pGM-TO.5μL,LigationMix2.5μL，步骤(5)中所述将Cu，Zn-SODcMk片段连接到pET22b⑴开环线状载体后转化到E.co7iT0P10宿主菌的5μL连接体系为Zn-SODomkl.00μL，pET22b(+)开环线状载体0.5μL，LigationMix2.5yL，连接条件为16°C连接过夜。4.根据权利要求1所述的构建含有牦牛0/,Z/7-5’fl9CDNA的表达载体的方法，其特征在于步骤(4)所述双酶切的20L体系为质粒DNA10.00μL,10XKBuffer2.00μL,BSA3.00μL,HindIII1.OOyL,AfcoII.00μL，余量为无菌蒸馏水，双酶切的反应条件为，37°C消化3h。5.根据权利要求1所述的构建含有牦牛Cu,Zn-SODcmk的表达载体的方法，其特征在于步骤(3)、步骤(5)中所述转化按以下步骤进行(1)将上述5.0μL连接体系，包括Ω/，Zn-SODomkl.00μL，线状载体pGM_T或pET22b(+)O.5μL，LigationMix2.5μL,加入50μL冰上预冷的Ε.co7iTOPlO感受态细胞，冰浴30min；(2)42°C水浴热激90s，放入冰浴IOmin；(3)加入SOC培养基800.0μL，混勻，37°C、120r/min振荡培养60min；(4)5000r/min离心30s，吸去大部分上清液，留下200.0μL上清液，重悬沉淀；(5)将细菌悬浊液均勻涂布在LB平板培养皿上，在37°C培养1220h，所述LB平板培养皿含有10mmol/LIPTG、40.0μL2%X_gal、100.0μg/mLAmp；(6)用封口胶封住LB平板培养皿，放入4°C冰箱显色30min；(7)挑取单个白色菌落接种于2mLLB液体培养基，37°C、120r/min培养12h后进行菌液PCR鉴定，所述LB液体培养基含100.0μg/mLAmp。6.按照权利要求1-5所述构建方法得到的重组载体0/,Z/7-5’fl9-pET22b(+)，其特征在于该重组载体包含由序列表中序列3的核苷酸序列组成的牦牛0/,Z/-5’fl9CDNA基因、PelB信号序列、pET22b(+)载体元件，并且所述牦牛铜锌超氧化物歧化酶cDNA基因位于pET22b(+)载体的Afco/和^ifli////限制性内切酶酶切位点之间。7.一种牦牛Cu，Zn-SOD~m22b(+)-Ε.co7iBL21(DE3)工程菌，其特征在于它是将重组载体伪，Z/7-5a9-pET22b(+)转化到万.co/iBL21(DE3)宿主菌中得到的。8.一种权利要求7所述牦牛Ω/，Zn-SOD~m22b(+)~E.co7iBL21(DE3)基因工程菌高效表达方法，其特征在于该基因工程菌高效表达方法包括对鉴定正确的重组基因工程菌进行IPTG诱导表达、用负染色法对表达产物进行鉴定、对重组蛋白进行纯化及复性，其中所述重组基因工程菌IPTG诱导表达方法包括以下步骤(1)经鉴定正确的Cu，Zn-SOD-m22b(+)_Ε·co7iBL21(DE3)基因工程菌接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，37°C120rpm震荡培养过夜，基因工程菌菌液与LB培养基的体积比为1:100；(2)次日，将过夜培养后的基因工程菌以1:40的体积比例接种到含氨苄青霉素的LB培养基中，于37°C震荡培养；(3)细菌OD6qq=O.51时，加入lmMIPTG，30°C，诱导表达9小时；(4)4000r/min离心5min，收集菌体，进行SDS-PAGE电泳，所述SDS-PAGE电泳的分离胶浓度为15%，积聚胶浓度为5%；所述负染色法鉴定表达产物包括以下步骤(1)将溶于PBS缓冲液的总蛋白上清液进行10%PAGE电泳，分别用提纯的牦牛血液Cu,Zn-SOD和含空载体的细菌细胞上清液作为阳性对照和阴性对照；(2)电泳结束后取出凝胶条，浸入NBT-TEMED-核黄素体系溶液中避光染色30min，倒出染色液，所述NBT-TEMED-核黄素体系溶液中含有1.5mmol/LNBT、0.lmmol/LTEMED、0.12mmol/L核黄素、67mmol/L磷酸盐缓冲液pH7.5；(3)用pH7.5的PBS冲洗胶片两次，胶片置于20W日光灯下照射45min，凝胶条无SOD活性部分全部为紫蓝色，有SOD活性的部分显现出无色透明的酶带，记录结果数据；所述重组Cu，Zn-SOD蛋白质纯化方法，包括以下步骤(1)经IPTG诱导的表达菌，4°C12000r/min离心15min，收集菌体；(2)按Ig菌体湿重加入10mLpH7.4的细胞裂解液重悬菌体，洗涤2次，所述细胞裂解液包括20mMNa3P04、500mMNaCl；(3)菌体悬浊液置于冰上超声破碎20min，破碎5s、间断9s，4°C12000r/min离心15min，收集沉淀；(4)按Ig菌体湿重加入20mLpH7.4的包涵体洗涤液I重悬沉淀，4°C静置20min，反复洗涤5次，所述包涵体洗涤液I包括20mMNa3P04、500mMNaCl、0.l%TritonX-100；(5)以同样的方法用pH7.4的包涵体洗涤液II洗涤包涵体5次，4°C12000r/min离心15min，收集沉淀，所述包涵体洗涤液II包括20mMNa3P04、500mMNaCl、2MUrea；(6)按Ig菌体湿重加入IOmL包涵体变性液向洗涤后的沉淀中加入pH7.4的包涵体变性液，4°C溶解过夜，40C12000r/min离心30min，收集上清液，经0.45μm滤膜过滤备用，所述包涵体变性液包括20mMNa3P04，500mMNaCl，8MUrea；所述重组蛋白质复性包括以下步骤将上述重组Cu，Zn-SOD蛋白质纯化方法步骤(6)纯化得到的包涵体蛋白用尿素浓度梯度法4°C透析复性，透析缓冲液依次以含6M、5M、4M、3M、2M、1M、OM尿素的PBS缓冲液，最后以无尿素的PBS缓冲液4°C透析过夜。全文摘要本发明公开了一种牦牛铜锌超氧化物歧化酶重组表达系统的构建方法及重组蛋白质。用逆转录聚合酶链式反应克隆牦牛肝脏Cu,Zn-SODcDNA，连接到原核表达载体pET22b(+)，构建重组原核表达载体，并转化到大肠杆菌构建基因工程菌，对基因工程菌进行IPTG诱导表达并纯化Cu,Zn-SOD蛋白质,得到的蛋白质用尿素浓度梯度法透析复性并用邻苯三酚自氧化法进行酶活性测定。本发明提供了一种高效稳定的牦牛Cu,Zn-SOD重组表达系统的构建方法及重组表达的牦牛Cu,Zn-SOD蛋白质，本发明为丰富SOD资源，降低生产成本及SOD在自身免疫性疾病治疗、制药、保健品、食品、化妆品等领域的开发利用奠定了基础。文档编号C12N15/66GK101818166SQ20101016932公开日2010年9月1日申请日期2010年5月12日优先权日2010年5月12日发明者徐亚欧,杨德孝,毛亮,毛德才,袁忠,郑玉才申请人:西南民族大学