一种具有锌指蛋白结构bbx24的基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种具有锌指蛋白结构BBX24的基因及其应用。本发明还提供了编码锌指蛋白转录因子的核苷酸序列以及它们在调控植物开花时间及非生物胁迫耐性上的应用。所述锌指蛋白转录因子在菊花上的基因沉默表现出对光周期的不敏感性，在长日照条件下可以明显地使短日照菊花的开花时间提前；在菊花上过表达表现出对低温和干旱耐性的增强。因此，它在调控植物开花时间和非生物胁迫耐性的应用上具有独特的优势。
【专利说明】—种具有锌指蛋白结构BBX24的基因及其应用
【技术领域】
[0001]本成果涉及菊花的园艺栽培、生产以及菊花开花时间调节的领域。
【背景技术】
[0002]锌指蛋白(Zincfingerprotein)是一类具有“指状”结构域的转录因子(也称为反式作用因子，能够与真核基因启动子区域中的顺式作用元件发生特异结合，并激活或抑制转录)。这一类蛋白的共同特征是通过多个半胱氨酸或/和组氨酸结合Zn2+来稳定一种很短的可自我折叠成“手指”的多肽空间构型。
[0003]BBX是B-box家族的一类锌指转录因子蛋白。B_box家族蛋白的N端为一个或两个串联的B-box结构域，由保守的半胱氨酸和组氨酸残基组成。B-box蛋白的三级结构由锌离子的结合而稳定.[0004]在动物中，B-box经常与环指(A-box)以及螺旋-螺旋结构域一起出现在RBCC (三重基序)蛋白中，参与转录调节、蛋白定位等多种活动。B-box被认为是蛋白互作的结构域，但功能仍然不甚清楚。植物中不包含RBCC蛋白，但拟南芥中有32个N-端含B-box的蛋白，根据他们的蛋白结构分为五个结构亚组。亚组I (BBX1-6)，II (BBX7-13)和III (BBX14-17)的成员N端包含一个或两个B-box，C端含有一个CCT域。在光调控途径中控制开花时间的C0NSTANS(C0,BBX1)属于亚组I。亚组IV(BBX18-25)和V(BBX26_32)的成员只在N端有两个或一个B-box结构域，而C端没有CCT域(图1)。
[0005]BBX蛋白被认为参与蛋白-蛋白之间的互作，并且已经有一些这方面的研究。比如BBXl (C0NSTANS)，BBX4 (C0L3)，BBX21 (STH2)，BBX22 (STH3)，BBX24 (STO)，以及 BBX25 (STH)可以和COPl互作。有研究结果表明，B-box结构域介导了蛋白与蛋白的相互作用，HY5通过B-box结构域与BBX21以及BBX22互作，COPl通过B_box结构域与BBX24产生互作。BBX21(STH2)的B-box结构域是蛋白互作和激活转录所必须的。在番茄中，BBX25 (STH)的同源蛋白TSTO没有DNA结合域，但有很强的转录激活功能。B-box蛋白之间也会产生互作，如BBX32与BBX21即可发生互作，抑制BBX21与HY5蛋白复合体的正调控功能。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种参与调控菊花开花时间和非生物胁迫耐性的锌指蛋白BBX转录因子。本发明的目的是通过如下技术方案来实现的。
[0007]1、一种锌指蛋 白转录因子，其中，所述锌指蛋白转录因子与SEQ N0.2具有50%至ioo%的同一'I"生的核苷酸序列编码。
[0008]2、一种核苷酸序列，所述核苷酸序列为编码技术方案I所述的所述锌指蛋白转录因子；优选的是，所述核苷酸序列与SEQ N0.1具有50%至100%的同一性。
[0009]3、用于对技术方案I所述的锌指蛋白转录因子或技术方案2所述的核苷酸序列进行克隆、检测、定位、过表达或沉默的引物或者引物对，所述引物包含SEQ N0.3 ;所述引物对选自由如下引物对组成的组:引物对SEQ N0.4和6、5和7、8和9、10和11、12和13、14和15、16 和 17、18 和 19,20 和 21、22 和 23,24 和 25,26 和 27。
[0010]4、一种克隆技术方案I所述的锌指蛋白转录因子或技术方案2所述的核苷酸序列的方法，所述方法包括使用选自由如下引物或者引物对组成的组:所述引物包含SEQ N0.3 ；所述引物对选自由如下引物对组成的组:引物对SEQ N0.4和6、引物对SEQ N0.5和7、引物对SEQ N0.8和9、引物对SEQ N0.10和11、引物对SEQ N0.12和13、和引物对SEQ N0.26和27。
[0011 ] 5、一种检测技术方案I所述的锌指蛋白转录因子或技术方案2所述的核苷酸序列的方法，所述方法采用I)引物对SEQ N0.14和15、和/或2)引物对SEQ N0.16和17。
[0012]6、一种过表达技术方案I所述的锌指蛋白转录因子的基因的方法，所述方法包括使用引物对SEQ N0.20和21进行。
[0013]7、一种使技术方案I所述的锌指蛋白转录因子的基因沉默的方法，所述方法包括使用D引物对SEQ N0.22和23、和/或2)引物对SEQ N0.24和25。
[0014]8、一种调节植物开花特性与非生物胁迫耐性的方法，所述方法包括使技术方案I所述的锌指蛋白转录因子过表达或沉默的步骤。
[0015]9、一种载体,所述载体包含如技术方案2所述的核苷酸序列；优选的是，所述载体为质粒载体，更优选为质粒表达载体；另外优选的是，所述载体为微生物载体。
[0016]10、如技术方案I所述的锌指蛋白转录因子或者如技术方案2所述的核苷酸序列在参与调节植物开花时间或提高植物对非生物胁迫耐性尤其是耐旱和/或耐寒上的应用。
[0017]本发明所提供的锌指蛋白转录因子参与植物开花特性和非生物胁迫耐性的调节。例如，在植物中沉默该基因表现出对光周期不敏感的特性，在长日照的条件下能明显的使短日照植物的开花时间提前；在植物中过表达该基因表现出对低温和干旱耐性的增强。这将使锌指蛋白转录因子(zinc finger protein)编码基因CmBBX24在调节植物开花特性或者提高植物对非生物胁迫耐性上具有独特的优势。CmBBX24基因参与调节植物开花特性以及抗性的研究具有重要的意义，为利用基因工程手段培育性状优良的植物提供了基因储备。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1显示了 BBX转录因子结构与分类。亚组I (BBX1-6)，II (BBX7-13)和IIKBBX14-17)的成员N端包含一个或两个B-box，C端含有一个CCT domain。亚组IV (BBX18-25)和V (BBX26-32)的成员只在N端有两个或一个Β-box结构域，而C端没有CCTdomain。
[0019]图2显示了 CmBBX24蛋白推定的氨基酸序列与其他物种的BBXs序列比对以及与拟南芥结构亚组IV中的8个BBXs进化树分析。其中，A图:多重序列比对使用ClustalW2和BioEdit软件完成。黑框内展示了具有50%以上的相似性的氨基酸序列，横线分别标示两个保守的B-Box结构域(BI和B2)，星号标示B-Box结构域内与Zn2+结合的半胱氨酸，组氨酸以及天冬氨酸。B图:进化树由软件MEGA4.02生成，分枝上的数值显示了各分枝间的分歧度，图下的比例尺显示了分枝的长度。
[0020]图3显示了菊花CmBBX24基因的表达模式。其中，A图:菊花CmBBX24基因组织特异性表达分析。L，叶片；F，花；R，根；S，茎；六个月大的菊花植株用于RNA的提取，Ubiquitin作为内标基因。B图:CmBBX24基因在低温、干旱胁迫下的表达分析。正常生长条件下培养的菊花在8叶龄时按照时间点进行不同的胁迫处理；对照，正常生长条件下的基因表达情况；冷处理，4°C条件下的基因表达情况；干旱处理，室内(相对湿度30%，室温22°C )滤纸上自然脱水下的基因表达情况。
[0021]图4显示了转基因菊花(过表达和RNAi)开花时间的表型。其中，A图:转基因菊花和WT不同阶段的花朵开放的差异；B图:转基因菊花和WT在生殖阶段的表型。在植株长到有8片叶后移栽，移栽后置于16h光照/8h黑暗条件下培养4个月后拍照。WT，野生型菊花，CmBBX24-0X-23, 21，14 为三个独立的 CmBBX24 过表达株系，CmBBX24-RNAi_l，2，3 为三个独立的CmBBX24RNAi株系。
[0022]图5显示了 CmBBX24在菊花中过表达提高低温和干旱耐性表型。其中，A图CmBBX24过表达和WT植株的冷冻胁迫耐性分析。B图:CmBBX24过表达和WT植株的干旱胁迫耐性分析。WT，野生型菊花，CmBBX24-0X-23, 21，14为三个独立的CmBBX24过表达株系。
[0023]图6显示了转基因菊花植株(过表达和RNAi)与野生型植株的1.5倍差异表达基因分析。
[0024]【具体实施方式】
[0025]本发明在第一方面提供了一种锌指蛋白转录因子，其中，所述锌指蛋白转录因子与 SEQ N0.2 具有至少 50%，例如 60%,70%,80%,90%,91%,92%,95%,97%,98%,99%或100%的同一性。在一些实施方式中，所述锌指蛋白转录因子可以由与SEQ N0.2具有至少 50%例如 60%,70%,80%,90%,91%,92%,95%,97%,98%,99%^； 100%的同一性的核苷酸序列编码。
[0026]本发明在第二方面提供了一种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码与SEQ N0.2具有至少 50%，例如 60%,70%,80%,90%,91%,92%,95%,97%,98%,99%^； 100%的同一'I"生的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述核苷酸序列与SEQ N0.1具有至少50%,例如60%、70%、80%、90%、91%、92%、95%、97%、98%、99% 或 100% 的同一性。在一些实施方式中，所述核苷酸序列为所述锌指蛋白蛋白转录因子的基因序列或其片段，优选的是，所述片段至少包括所述所述锌指蛋白转录因子基因的开放阅读框。
[0027]本发明第三方面提供了用于上述锌指蛋白转录因子或核苷酸序列进行克隆、检测、定位、过表达或沉默的引物或者引物对，所述引物包含SEQ N0.3 ;所述引物对选自由如下引物对组成的组:引物对SEQ N0.4和6、引物对SEQ N0.5和7、引物对SEQ N0.8和9、引物对SEQ N0.10和11、引物对SEQ N0.12和13、引物对SEQ N0.14和15、引物对SEQ N0.16和17、引物对SEQ N0.18和19、引物对SEQ N0.20和21、引物对SEQ N0.22和23、引物对SEQN0.24 和 25、引物对 SEQ N0.26 和 27。
[0028]本发明的第四方面提供了一种克隆上述锌指蛋白转录因子或核苷酸序列的方法，所述方法包括使用选自由如下引物或者引物对组成的组:所述引物包含SEQ N0.3，优选的是，所述引物为SEQ N0.3。所述引物对可以选自由如下引物对组成的组:引物对SEQ N0.4和6、引物对SEQ N0.5和7、引物对SEQ N0.8和9、引物对SEQ N0.10和11、引物对SEQ N0.12和13、和引物对SEQ N0.26和27。
[0029]本发明的第五方面提供了一种检测上述锌指蛋白转录因子或核苷酸序列的方法，所述方法采用I)引物对SEQ N0.14和15、和/或2)引物对SEQ N0.16和17。
[0030]本发明的第六方面提供了一种过表达上述锌指蛋白转录因子的基因的方法，所述方法包括使用引物对SEQ N0.20和21进行。
[0031]本发明的第七方面提供了一种使上述锌指蛋白转录因子的基因沉默的方法，所述方法包括使用I)引物对SEQ N0.22和23、和/或2)引物对SEQ N0.24和25。
[0032]本发明的第八方面提供了一种调节植物开花特性或者提高植物抗非生物胁迫耐性的方法，所述方法包括干预上述锌指蛋白转录因子的步骤。所述干预例如可以为过表达所述转录因子或者使所述转录因子的基因沉默。
[0033]本发明的第九方面提供了一种载体，所述载体包含上述核苷酸序列。优选的是，所述载体为质粒载体，更优选为质粒表达载体。另外，所述载体可以为微生物载体，例如微生物例如细菌(如大肠杆菌)细胞等。
[0034]本发明的第十方面提供了上述锌指蛋白转录因子和/或其基因或其片段在参与调节植物开花特性或提高植物对非生物胁迫耐性上的应用。所述调节植物开花特性例如为促进短日照植物开花、使短日照植物在长日照条件下开花等。例如，通过使植物中的所述锌指蛋白转录因子的基因沉默来使植物表现出对光周期的不敏感性，从而使植物在长日照条件下提前开花。所述非生物胁迫耐性例如为耐旱胁迫耐性或者耐寒胁迫等耐性。例如，通过使植物中所述锌指蛋白转录因子的过表达提高植物对低温和干旱胁迫耐性。在一些优选的实施方式中，所述植物为短日照植物；短日照植物在24小时昼夜周期中，日照长度必须短于一定时数，才能成花的植物。另外优选的是，所述植物为菊花植物。
[0035]本发明还提供了对上述锌指蛋白转录因子进行定位的方法，所述方法包括采用引物对SEQ N0.18和19进行。
[0036]本发明在第十一方面提供了如上所述的锌指蛋白转录因子或者如上所述的核苷酸序列在参与调控植物开花时间方面的应用。在一些优选的实施方式中，所述基因在菊花中的沉默表现了对光周期的不敏感性，使菊花在长日照条件下开花时间提前；在菊花过过表达该基因提高了对干旱和低温的耐性。
[0037]下文将通过实施例对本发明进行进一步的说明。应当理解的是，这些实施例仅仅出于说明目的，不应被理解为是对本发明请求保护的范围的限制。
[0038]实施例
[0039]1.基因克隆
[0040]试验材料是从菊花‘秋艳’(morifolium(Ramat.)KitamuraFalI ‘Color’)通过莖段再生获得的2个月大的菊花组培苗，从瓶中移出，洗净附着在根系上的培养基，在正常培养条件下炼苗24h (小时)，转移到4°C生长箱中存放6h，整株取样液氮速冻保存在_80°C冰箱，用于RNA的提取。
[0041]菊花植株RNA的提取采用Trizol试剂(Invitrogen, USA),具体操作如下:
[0042]A.将0.1g叶片在液氮中充分研磨,加入1ml Trizol,室温放置5min。
[0043]B.加入200 μ I氯仿,剧烈震荡15s (秒)，室温静置分层。
[0044]C.40C 12000rpm(转/分钟)离心10min (分钟)，将上层水相转入新的离心管中。
[0045]D.加入相同体积的异丙醇，轻柔混匀，室温静置沉淀15min。
[0046]E.4°C 12000rpm离心10min，在管侧和管底出现胶状沉淀，弃上清。
[0047]F.加入lml75%乙醇洗漆沉淀,4°C 7500rpm离心10min,弃上清。
[0048]G.室温放置或真空抽干RNA沉淀，不要真空抽干过于干燥，过于干燥会导致RNA溶解度降低。
[0049]H.加入40-100 μ I无RNase的水，用枪头吸打或轻弹管壁将RNA溶解。凝胶电泳检测RNA提取的质量。RNA可置于-80 V保存。
[0050]cDNA 末端快速扩增(RACE)，RACE 试剂盒为 Clontech (USA)的 SMARTer? RACE cDNAAmplification kit,以下步骤详见试剂盒说明书。
[0051](I) RACE cDNA 第一链合成
[0052]A.在PCR小管中按下表加样:
[0053]5? RACE cDNA 3? RACE cDNA
[0054]1-3 μ I RNA 1-3 μ I RNA
[0055]I μ 15’-CDS 引物(SEQN0.8)lyl3’-CDS$* (SEQ N0.3，具体序列参见下表 2，提及其他引物时同样参见下表2)
[0056]I μ I SMART II Aoligo (SEQ N0.9)
[0057]B.加灭菌水至5 μ I，混匀，稍离心；
[0058]C.7(TC温育 5min ；
[0059]D.冰浴 2min ；
[0060]E.按下表所列加样至总体积10μ 1:
[0061]
【权利要求】
1.一种锌指蛋白转录因子，其中，所述锌指蛋白转录因子与SEQ N0.2具有至少50%，例如 60%、70%、80%、90%、91%、92%、95%、97%、98%、99%或 100% 的同一性；优选的是，所述锌指蛋白转录因子由与SEQ N0.1具有至少50%，例如60%、70%、80%、90%、91%、92 %、95 %、97 %、98 %、99 %或100 %的同一性的核苷酸序列编码。
2.一种核苷酸序列，所述核苷酸序列为编码权利要求1所述的所述锌指蛋白转录因子；优选的是，所述核苷酸序列与SEQ N0.1具有至少50%，例如60%、70%、80%、90%、91%,92%,95%,97%,98%,99%^； 100% 的同一性。
3.用于对权利要求1所述的锌指蛋白转录因子或权利要求2所述的核苷酸序列进行克隆、检测、定位、过表达或沉默的引物或者引物对，所述引物包含SEQ N0.3 ;所述引物对选自由如下引物对组成的组:引物对SEQ N0.4和6、引物对SEQ N0.5和7、引物对SEQ N0.8和9、引物对SEQ N0.10和11、引物对SEQ N0.12和13、引物对SEQ N0.14和15、引物对SEQ N0.16和17、引物对SEQ N0.18和19、引物对SEQ N0.20和21、引物对SEQ N0.22和23、引物对SEQN0.24 和 25、引物对 SEQ N0.26 和 27。
4.一种克隆权利要求1所述的锌指蛋白转录因子或权利要求2所述的核苷酸序列的方法，所述方法包括使用选自由如下引物或者引物对组成的组:所述引物包含SEQ N0.3 ;所述引物对选自由如下引物对组成的组:引物对SEQ N0.4和6、引物对SEQ N0.5和7、引物对SEQ N0.8和9、引物对SEQ N0.10和11、引物对SEQ N0.12和13、和引物对SEQN0.26和27。
5.一种检测权利要求1所述的锌指蛋白转录因子或权利要求2所述的核苷酸序列的方法，所述方法采用I)引物对SEQ N0.14和15、和/或2)引物对SEQ N0.16和17。
6.一种过表达权利要求1所述的锌指蛋白转录因子的基因的方法，所述方法包括使用引物对SEQ N0.20和21进行。
7.—种使权利要求1所述的锌指蛋白转录因子的基因沉默的方法，所述方法包括使用I)引物对SEQ N0.22和23、和/或2)引物对SEQ N0.24和25。
8.一种调节植物开花特性与非生物胁迫耐性的方法，所述方法包括使权利要求1所述的锌指蛋白转录因子过表达或沉默的步骤。
9.一种载体,所述载体包含如权利要求2所述的核苷酸序列；优选的是,所述载体为质粒载体，更优选为质粒表达载体；另外优选的是，所述载体为微生物载体。
10.如权利要求1所述的锌指蛋白转录因子或者如权利要求2所述的核苷酸序列在参与调节植物开花时间或提高植物对非生物胁迫耐性尤其是耐旱和/或耐寒上的应用。
【文档编号】C12N15/82GK104004070SQ201410165270
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年4月24日 优先权日:2014年4月24日
【发明者】高俊平, 王美艳, 杨英杰, 洪波, 徐彦杰 申请人:中国农业大学